专利名称：传感器型微透析生物活体取样装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种传感式微透析生物活体取样装置。这种装置可对动、植物组织内的微区取样部位的气体或生化物质的含量进行实时(realtime)监测，并可同时取得待测部位的细胞外液成分供生化分析用。
目前通用的微透析取样装置由微透析膜(5)、支撑管(4)、进液管(1)和出液管(2)四部分组成，其原理图如
图1所示。将一段游离端用胶(3)封闭的管状半透膜(5)(即微透析膜，相当于一段人造血管)通过支撑管(4)插入生物体内，在透析膜部位经过物理渗透作用，使取样部位小于截留分子量的膜内、外分子可以经微透析膜自由通透。其截留分子量取决于半透膜孔径，用以阻断蛋白质和生物酶等大分子通过，相当于对微透析液进行了前处理，便于进行痕量生化分析。由于管状透析膜的体积小，为保障活体取样的实时检测，需采用微流量灌流泵(相当于人造心脏)将生理溶液从进液管(1)以相当于取样部位微血管流速的速度对微透析探针施以轻微压力，使经过透析后的膜内物质经出液管(2)按灌流速度(通常＜5μl/min)缓慢流出体外，然后加以收集并进行在线(online)或离线(off line)生物化学检测。这种方法可以检测体内、外的液体小分子物质，但无法同时取得在当时取样状态下的生物氧等气体及其相关物质的含量，而在同一取样部位同时监测气体和生化活性物质的变化规律这一点对研究许多生物学和临床医学问题是非常重要的，特别在研究脑神经科学时显得更为迫切。目前多采用以下两种变通方法。一种是离体检测方法，由于体内氧含量等气体的变化与生物体的功能状态密切相关，所得结果往往难以反映当时活体状态下的气体及其相关生化物质的含量。另一种是在微透析探针的附近再插入一根监测气体含量的探针，缺点是很难在微区取样部位操作或实验结果不能反映同一取样部位的变化，这一点在研究脑神经核团的功能时特别显得无能为力。
本发明的目的是为了克服常规微透析取样装置不能同时检测活体组织中气体或其它生化物质含量的局限性，而提供了一种在取得微透析液的同时检测组织内细胞外环境中气体和其它生化物质含量的传感式微透析取样装置。
本发明可分为微透析膜、导电传感膜、支撑管(包括探针杆和探针柄)进液管和出液管五部分。现结合此装置的纵向剖面图2和图3详述如下图2表示金属杆材料的传感式微透析取样装置，其中1.微透析膜 2.探针杆 3.探针柄 4.出液管 5.进液管6.进液管套管 7.导线 8.粘合剂 9.焊锡 10.不导电膜 11.
导电传感膜图2所述的微透析膜(1)为管状，Φ0.15-0.5mm，长7-14mm，外露部分1-10mm，下端(游离末端)0.5mm处，以生物兼容性胶封固。透析膜管材有一定张力，不受力时管径能保持园形。管壁有半透性，截留分子量3,000-50,000道尔顿。透析膜为生物兼容性材质且不与体内组织或药物发生化学反应。透析膜上端(未封闭端)插入探针杆(2)内。
所述的探针杆(2)为Φ0.2-0.7mm，长12mm的金属管。末端(与微透析膜相连的一端)1-3mm有一圈镀有金、铂或钯的导电金属膜作为传感膜(11)。该金属镀膜通过一根有绝缘涂层的细导线(7)与电化学检测器相连。该导线沿探针杆和下述的探针柄(3)外侧缘向上通至体外，Φ2-3mm，长度超过探针柄上缘。
所述的探针柄(3)为0.4-0.8mm，长5-8mm的金属管，套在探针杆上部。上缘比探针杆高出2-3mm，，探针柄与探针杆之间以焊锡(9)密闭连接。
探针柄的外表面及探针杆下部未涂有导电传感膜(11)部分的外表面涂有一层不导电的高分子膜(10)，总长13-20mm，使其与取样部位的组织绝缘。使用该涂层前需先将探针支撑管的外表面进行加工处理，使其变得略为粗糙，便于表面涂层更加牢固地附着于探针柄与探针杆上。
所述的出液管(4)为Φ0.4-0.6mm，长8-10mm的金属管。一端向下斜行插入探针杆上端，另一端通过导液管与样品收集管相连。
所述的进液管(5)为Φ0.1-0.3mm，长23-37mm的石英毛细管，进液管自上而下穿过探针支撑管，直到透析膜的封口端。进液管上端8-10mm一段的外面套有另有一根Φ0.4-0.6mm的金属管或石英毛细管作为保护管(6)与之滑配并用胶将其下端粘合，使进液管加粗，便于与导液管相连。
探针杆的末端与微透析膜相交处以及探针支撑管的上端与进出液管之间用生物兼容性粘合剂(8)粘合，粘合时应注意不得堵住出液管(4)。
图3表示非金属探针杆材料的传感式微透析取样装置，其中1.透析膜 2.探针杆 3.探针柄 4.出液管 5.进液管6.进液管套管 7.导线 8.粘合剂 9.导电涂层 10.不导电涂层 11.导电传感膜图3中所述的探针支撑管(包括探针杆和探针柄)可由石英毛细管、硬质塑料或陶瓷制造。探针杆(2)和探针柄(3)之间的连接改为粘合剂(8)。探针杆下部的表面镀有一层导电金属膜，支撑管的其余部分涂有一层导电胶(9)。该导电涂层通过导线(7)与电化学检测器相连。该导电涂层的外面尚需再涂覆一层不导电的高分子膜(10)，以便与周围组织绝缘。注意不可覆盖其下方的传感膜(11)。传感膜按检测要求可以只固定上惰性金属用于测定氧或其它气体，也可以在此基础上再固定化生物酶或染料等用于检测与消耗氧或产生氧有关的液体生化物质。其它部分的构造与图2相同。
使用时将本装置有微透析膜的一端插入体内取样部位，务使传感膜及微透析膜全部包容在取样部位内。进、出液管分别连于微透析灌流泵和收集管，导线需连于电化学检测器上。此外，还需插入一根由银/氯化银制成的参比电极。用于体外测定时，该参比电极只要与工作电极(纸传感膜)放入同一流通池中即可(流速为每分钟数微升)。用于体内测定时，该参比电极采用φ0.5mm的银丝插入工作电极的组织附近。如此便可在收集微透析液的同时测定取样部位气体或相关的生化物质含量。
本发明是一种全新的在体生化微透析取样装置。设计新颖，操作容易，结实耐用，成本较低。可以直接检测液体中的氧气浓度，也可以通过测定氧间接测定氮气和二氧化碳等气体，还可以通过测定酶反应检测其它的有关生物活性物质。例如，如果在探头上固定化一定量的葡萄糖氧化酶，由于该酶可催化氧化葡萄糖而消耗氧，使探头附近的氧浓度降低，从而间接测定葡萄糖的浓度。对传感膜进行不同的修饰，该探针系统便可在进行微透析取样的同时检测其它多种生物活性的小分子化合物，例如抗坏血酸，L-酪氨酸等。这是以往同类产品未能做到的。如果进一步与部分本发明人的实用新型专利(韩慧婉、刘国诠，96209761.6号)连用，还可对动物进行活动状态下的局部气体含量分析和微透析取样，用于研究更为复杂的生物学问题。
透析膜材料为再生纤维素，长2mm，外径0.2mm，截留分子量9,000。进液管及其外套管由粗细不同的石英毛细管制成，管外壁涂有聚酰亚胺保护层。外径分别为0.12mm及0.5mm，长度分别为20mm及8mm。出液管为长8mm，Φ0.5mm的不锈钢管。各部位黏合剂均用树脂胶黏合。制成后插入固定体位的大鼠脑内或身体其它部位。
传感器探头在测定气体含量时直接采用镀金涂层即可。如需在金属膜基底上固化生物酶，步骤如下将醋酸纤维素溶于丙酮中，固含量0.5-10％(w/w)，加入适当的致孔剂，如丁醇、环己醇、油酸甘油酯、硬脂酸甘油酯等制成固含量适宜的溶液。致孔剂含量0.1-10％(v/v)。先将待涂敷表面的丙酮、乙醇或氯代烃类清洗、晾干后，再将上述涂敷液均匀涂于金属表面。待溶剂蒸发至干且胶膜已牢固后，以50-80％乙醇水溶液将致孔剂萃取除去，或用真空烘箱令致孔剂挥发逸去而形成多孔性涂膜。将该膜以NaOH水溶液处理(NaOH浓度为0.1-1M)，令醋酸纤维素膜表面恢复至具有多羟基的纤维素表面，然后再以通常固定化方法，如BrCN法，高碘酸氧化法等将酶固定化于醋酸纤维素表面。
透析膜材料为聚碳酸酯，长5mm，外径0.5mm，截留分子量18,000，进液管为长10mm，Φ0.6mm的不锈钢管。出液管为Φ0.3mm，长37mm的石英毛细管。外套管为石英毛细管，长10mm，Φ0.6mm。各部位粘接剂采用树脂胶。制成后插入清醒状态，手无法触及取样部位的猴脑内或身体其它部位。
传感膜上用石墨导电胶连接一根Φ2mm的绝缘导线，向上直达探针柄上缘。
传感膜采用真空镀膜技术镀以铂层膜，长2mm，再向该层金属膜上固定化一定量的葡萄糖氧化酶。具体方法如下先在铂膜基底上吸附一层含巯基的化合物，如半胱氨酸，再利用巯基化合物上的活性基团将酶偶联于金属膜上。例如当利用氨基时可使用乙醛、戊二醛等试剂，其反应示意如下
权利要求
1.一种传感器型微透析生物活体取样装置，包括微透析膜、支撑管、进液管和出液管，微透析膜位于支撑管的下部顶端，进液管和出液管位于支撑管之内，其特征在于，在支撑管的下部外表面有一层由金，铂或钯金属制成的一层导电传感膜，该导电传感膜紧挨着微透析膜，并通过支撑管的上部与电化学检测器之间电连通，支撑管的外表面有一绝缘层。
2.按照权利要求1所述的传感器型微透析生物活体取样装置，其特征在于，所述的进液管为石英毛细管或不锈钢管或硬质塑料管，其管外游离端套有保护管。
3.根据权利要求1所述的传感器型微透析生物活体取样装置，其特征在于，所述的支撑管包括探针杆和探针杆的外套管(探针柄)，它是由金属制成的，在导电传感膜以外的部分涂以不导电膜。
4.根据权利要求1所述的传感器型微透析生物活体取样装置，其特征在于，所述的支撑管包括探针杆和探针杆的外套管(探针柄)，它是由非金属制成的，支撑管下部涂有导电传感膜，其余部分涂有一层导电膜，导电膜之外涂有一层不导电膜。
5.根据权利要求1所述的传感器型微透析生物活体取样装置，其特征在于，在导电传感膜上固化有生物酶或染料。
6.根据权利要求3所述的传感器型微透析生物活体取样装置，其特征在于，不导电膜为可溶于有机溶剂的高分子膜。
全文摘要
本发明是一种传感器型微透析生物活体取样装置,包括微透析膜、支撑管、进液管和出液管,微透析膜位于支撑管的下部顶端,进液管和出液管位于支撑管之内,其特征在于,在支撑管的下部外表面有一层由金、铂或钯金属制成的一层导电传感膜,该导电传感膜与支撑管的上部电连通,支撑管的外表面有一绝缘层。它兼有实时检测生物组织细胞外液中气体及生化物质浓度功能的复合式微透析取样装置,特别适于开展脑的活体、动态生化研究。
文档编号G01N1/28GK1358994SQ00135718
公开日2002年7月17日 申请日期2000年12月18日 优先权日2000年12月18日
发明者澳彼德, 韩慧婉, 李晓峰, 李元宗, 刘国诠 申请人:中国科学院化学研究所, 北京大学