专利名称：6A8α－甘露糖苷酶在免疫细胞亚群分组中的用途及其方法
技术领域：
本发明涉及通过使用6A8α-甘露糖苷酶抗体检测细胞表面6A8α-甘露糖苷酶的表达对人免疫细胞，优选CD19+、CD4+、CD8+、CD14+和CD56+单核细胞，进行亚群分组的用途及其分组方法。
近年来已有报道，6A8α-甘露糖苷酶也表达于细胞膜，其描述见李琳等人，中华微生物学和免疫学杂志，2001；21(4)413-416页。由于细胞膜在受体传递、信号转导中具有重要的作用，例如可以激活或抑制某一生物学功能的实现等等，所以尽管目前对酶属膜蛋白的功能知之甚少，但位于细胞膜的酶一定有着特殊的生物学意义。而由于免疫细胞在体内结构与功能分类的日益多样化，采用在细胞膜表达的6A8α-甘露糖苷酶对免疫细胞进行亚群分类一定有着深远的意义。
发明内容
本发明目的是通过人6A8α-甘露糖苷酶在细胞表面的表达，把人CD19+、CD4+、CD8+、CD14+和CD56+细胞，及其它免疫细胞区分成阳性表达与阴性表达两个亚群，这一免疫细胞的亚群分组可作为诊断或检测指标在相应的医学基础与临床中应用。
本发明提供了一种用抗6A8α-甘露糖苷酶单克隆抗体对免疫细胞进行亚群分组的新用途。
具体来说，所述的分组是通过6A8α-甘露糖苷酶在细胞表面的表达的方式完成的。
更进一步地，所述的抗体包括用完整6A8α-甘露糖苷酶分子或6A8α-甘露糖苷酶的任意多肽片段为抗原免疫动物制备的任何抗体。
优选的免疫细胞包括人的CD19+、CD4+、CD8+、CD14+和CD56+免疫细胞。
本发明还提供了用6A8α-甘露糖苷酶抗体对免疫细胞进行分组的检测方法，它包括以下步骤1)用异硫氰酸荧光素(FITC)标记6A8α-甘露糖苷酶抗体，2)用藻红素(PE)标记抗CD4、CD8、CD14、CD19和CD56单抗，3)用1)和2)所述的抗体双染人免疫细胞，以及4)观察结果，并将所述的免疫细胞进行亚群分组。
优选地，所述的免疫细胞来自人外周血。
优选地，所述的免疫细胞是人外周血中的单个核细胞。
这一免疫细胞的亚群分组可作为诊断或检测指标应用到相应的医学基础与临床应用。
图2显示以异硫氰酸荧光素(FITC)分析6A8α-甘露糖苷酶抗体对CD8+T细胞的免疫检测结果。
图3显示以异硫氰酸荧光素(FITC)分析6A8α-甘露糖苷酶抗体对CD14+单核细胞细胞的免疫检测结果。
图4显示以异硫氰酸荧光素(FITC)分析6A8α-甘露糖苷酶抗体对CD19+B细胞的免疫检测结果。
图5显示以异硫氰酸荧光素(FITC)分析6A8α-甘露糖苷酶抗体对CD56+自然杀伤细胞的免疫检测结果。
6A8α-甘露糖苷酶在细胞表面的表达用抗6A8α-甘露糖苷酶抗体作探针检测。6A8α-甘露糖苷酶是6A8cDNA编码的(见Li B等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)2000，2677176-82页)。抗6A8α-甘露糖苷酶抗体用6A8cDNA在原核或真核细胞表达的蛋白质免疫动物，并作为筛选靶分子获得。我们制备了抗6A8α-甘露糖苷酶除表达于人B细胞株3D5的胞浆，也表达于胞膜(见上)。
用异硫氰酸荧光素(FITC)标记6A8α-甘露糖苷酶抗体，与藻红素(PE)标记的抗CD4、CD8、CD14、CD19或CD56单抗双染人外周血单核细胞，观察到人外周血中部分CD4+和CD8+T细胞、部分CD14+单核细胞、大部分CD19+B细胞和CD56+自然杀伤细胞表面表达6A8α-甘露糖苷酶，如
图1。这样，可把这些细胞区分成两个亚群。
本发明的单克隆抗体基本上可按下述方法制得。
例如，使用来自转化态细菌DH5α中表达的蛋白质，将其纯化后作为抗原，按照常规免疫方法免疫动物，按照常规细胞融合方法对免疫细胞进行融合，并按照常规克隆方法包括半固体培养基法克隆融合的细胞，并用常规的杂交瘤筛选方法进行筛选。
制备这种单克隆抗体的方法，对用上述抗原免疫的动物没有特殊限制；优选选择那些在细胞融合中对将要使用的骨髓瘤细胞有适应性的动物，优选使用小鼠、大鼠或仓鼠。
按照常规方法进行免疫，最好经腹腔注射作为油包水制剂的含佐剂的目的融合蛋白，优选使用的佐剂为完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂。
也可以使用不同的已知细胞作为与上述免疫细胞相融合的另一亲代细胞，即哺乳动物骨髓瘤细胞如P3、P3-U1、NS-1、Sp2/o-Ag14、MPC11和S194(J.Exp.Med.，148，313-323)等。
另外，可以使用常规纯化手段如盐析技术、凝胶过滤及亲和层析法，将按上述方法制得的单克隆抗体纯化到高纯度。
可以使用常规方法纯化IgG类单抗，优选使用正辛酸法纯化IgG类单抗。按常规方法标记单抗与用另外一种方法标记的单抗双染，包括人免疫细胞，优选用FITC标记的抗6A8α-甘露糖苷酶抗体和PE标记的抗人CD分子的单抗双染人免疫细胞，优选的动物包括人类，优选的免疫细胞包括CD4、CD8、CD14、CD19或CD56。
下列实施例详细列举本发明。
6A8α-甘露糖苷酶C端片段的制备包括以下步骤1)根据6A8cDNA 3′端DNA序列，设计含Bam HI切点的上游引物5′CGCGGATCCAGCGGATCGAAGTGATG 3′和含EcoR I切点的下游引物5′CCGGAATTCTTAGGCTGGGGAAGCAGA 3′，从质粒pCDI-6A8(Li B等人，编码人新6A8α-甘露糖苷酶克隆、表达和特征。欧洲生物化学杂志，2000，2677176)用PCR扩增出阳性片段，再经BamH I/EcoR I双酶切后，插入经BamH I/EcoR I消化的质粒pGEX-2T(Amersham Pharmac iaBiotech，Hong Kong，China)，形成pGEX-2T-6A8。
2)转化重组表达载体pGEX-2T-6A8于感受态细菌DH5α。用1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷在37℃诱导2小时。离心去除上清部分。沉淀行SDS-PAGE后，将蛋白转移至硝基纤维素膜上。切下转移有融合蛋白(mr为67×103)的硝基纤维素膜，溶膜于尽可能少量的二甲基亚砜(DMSO)中。
3)按油包水制剂制作方法，把等量含融合蛋白的DMSO与完全福氏佐剂或不完全佐剂经强振荡充分混合。第一次免疫用完全福氏佐剂制剂(内含10mg蛋白)，加强免疫用不完全福氏佐剂制剂(内含5mg蛋白)。免疫均用腹腔注射方式。用人B细胞株3D5(朱立平等一个对B细胞生长因子(BCGF)有特异反应的人细胞株(3D5)的建立，中华微生物学和免疫学杂志1989，9284)作靶细胞，间接免疫荧光染色(方法同5)监测小鼠血清中抗6A8α-甘露糖苷酶抗体水平。
4)待血清中抗6A8α-甘露糖苷酶抗体达一定水平，行细胞融合。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合按常规方法，用半固体培养基法克隆杂交瘤细胞(陈实平、朱立平第十一章杂交瘤技术与单克隆抗体制备，巴德年主编当代免疫学技术与应用，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998，p.54-356)5)杂交瘤的筛选分二步(李琳等6A8α-甘露糖苷酶也表达于细胞膜，中华微生物学和免疫学杂志2001，21413)第一步，以4％多聚甲醛固定，并用经0.1％TritonX-100处理使胞膜通透性增加的3D5细胞作靶细胞，以杂交瘤细胞培养上清作一抗，经间接免疫荧光染色筛选出3D5细胞免疫荧光阳染的杂交瘤细胞株；第二步，仍用同样处理的3D5细胞作靶细胞，杂交瘤细胞培养上清液先用6A8-GST融合蛋白或GST蛋白吸收，再作间接免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜(MERIDIANTMUluima212，USA)观察。以被6A8-GST融合蛋白中和，但不能被GST中和的上清液为阳性。
6)取筛选阳性的杂交瘤细胞，扩增，冻存于液氮。
7)按常规制备单抗腹水(陈实平、朱立平第十一章杂交瘤技术与单克隆抗体制备，巴德年主编当代免疫学技术与应用，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998，p.362-363)抗体染色用正辛酸法从小鼠腹水中纯化IgG类单抗取10ml腹水，加入20ml醋酸溶液(0.06M，pH4.0)稀释，用2M的醋酸钠调节pH值至4.8。每ml稀释后样品加10μl正辛酸，搅拌下缓慢加入300μl正辛酸。室温下继续搅拌30min。离心，4000rpm/min，30min，4℃。取上清装入透析袋，对50-100倍体积的透析液(PBS-0.2mMEDTA)4℃透析过夜，中途更换透析液1-2次。取出透析样品，加入等体积饱和硫酸铵，搅拌混匀。4℃放置30min。离心，4000rpm/min，20min，4℃。弃上清，用10ml透析液溶解沉淀，装入透析袋，对50一100倍体积的透析液4℃透析过夜，中途更换透析液1-2次。离心透析样品，4000rpm/min，30min，4℃。取上清装入透析袋，以蔗糖浓缩至体积约1-2ml。测定浓缩后样品的OD值，分装，-20℃储存。
用异硫氰酸荧光素(FITC)标记单抗取sephadex G一50凝胶颗粒2-3克，加入去离子水使其充分溶胀。制备层析柱，柱床体积至少是样品体积的20倍。用PBS平衡柱子。用0.1MNaCO，pH9.0稀释抗体至终浓度为2mg/ml。精确称取FITC1mg，溶解于无水DMSO中，此溶液需新鲜配制，否则会因色素分解而影响标记。每1ml抗体溶液加入50μlFITC染料，必须在搅拌下缓慢加入染料，每次加入5μl，直至全部加入。4℃，避光，缓慢混悬，反应8hr。加入NH4Cl，使其终浓度至50mM，4℃，孵育2hr。加入二甲苯蓝，使其终浓度至0.1％。加入甘油，使其终浓度至5％。将已制备好的抗体液小心加入层析柱，PBS洗脱，收集第一峰(淡黄绿色)。检测所收集的样品，测定OD495nm和OD280nm的比值，收集比值在0.3-1.0之间的样品，进行浓缩，浓缩后测定蛋白浓度，分装，-20℃储存。
从外周血中用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMNC)取一只50ml透明离心管，加入10mlPBS，50μl肝素，混匀备用。抽取静脉5ml，血加入准备好的离心管中，和PBS、肝素混匀。小心加入淋巴细胞分离液。离心，2000rpm，15min(离心时要从0rpm缓慢上升到2000rpm)。吸取淋巴细胞层，PBS洗涤两次，用PBS悬浮细胞，调整细胞密度至1×106/ml，进行下面的实验。
用FITC标记的单抗6A8和PE标记的抗CD4、CD8、CD14、CD19和CD56单抗双染从外周血中用淋巴细胞分离液分离到的单个核细胞(PBMNC)，流式细胞仪检测CD4、CD8、CD14、CD19和CD56阳性的细胞中，单抗6A8染色阳性细胞的百分率和荧光染色强度取10只试管，每管加入1ml细胞悬液，离心，1500rpm/min，5min，弃上清。将其分成五组，加入抗体，充分混匀。
A)PE-CD3+FITC一小鼠lgG和PE-CD3+FITC-6A8B)PE-CD4+FITC-小鼠lgG和PE-CD4+FITC-6A8
C)PE-CD8+FITC-小鼠lgG和PE-CD8+FITC--6A8D)PE-CD19+FITC-小鼠lgG和PE--CD19+FITC--6A8E)PE-CD56+FITC-小鼠lgG和PE-CD56+FITC--6A8避光，置冰浴反应45min。每管加入冰预冷的洗涤液1ml(洗涤液0.02％小牛血清-PBS)，洗涤细胞三次。每管加入0.5ml冰预冷的0.02％叠氮钠-PBS，悬浮细胞。流式细胞仪检测激发光488nm。以PE染色(红荧光)圈门，测定门中细胞的FITC染色(绿荧光)强度。
权利要求
1.一种6A8α-甘露糖苷酶单克隆抗体的新用途，其特征在于使用所述的抗体对免疫细胞进行亚群分组。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的分组是通过6A8α-甘露糖苷酶在细胞表面的表达的方式完成的。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述的抗体包括用完整6A8α-甘露糖苷酶分子或6A8α-甘露糖苷酶的任意多肽片段为抗原免疫动物制备的任何抗体。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述的免疫细胞包括人的CD19+、CD4+、CD8+、CD14+和CD56+免疫细胞。
5.用6A8α-甘露糖苷酶抗体对免疫细胞进行分组的方法，它包括以下步骤1)用异硫氰酸荧光素(FITC)标记6A8α-甘露糖苷酶抗体，2)用藻红素(PE)标记抗CD4、CD8、CD14、CD19和CD56单抗，3)用1)和2)所述的抗体双染人免疫细胞，以及4)观察所述的免疫细胞进行亚群分组结果。
6.根据权利要求5所述的分组方法，其中所述的免疫细胞来自人外周血。
7.根据权利要求5或6所述的分组方法，其中所述的免疫细胞是人外周血单个核细胞。
全文摘要
本发明涉及通过使用6A8α－甘露糖苷酶抗体检测细胞表面6A8α－甘露糖苷酶的表达对人免疫细胞，优选CD19
文档编号G01N33/577GK1464309SQ0212188
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月10日 优先权日2002年6月10日
发明者朱立平 申请人:中国医学科学院基础医学研究所