专利名称：一种测定神经生长因子的生物活性的方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域中的生物活性成份测定方法，尤其是指一种用刺激细胞增殖的方法测定神经生长因子的生物活性的方法。
人源神经生长因子(hNGF)可应用于糖尿病性周围神经病变、老年痴呆病、帕金森氏病、面神经炎，以及神经损伤(包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植、脑损伤，周围神经损伤等中枢及外围神经系统的损伤)等神经系统疾病，是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。定性和定量地测定神经生长因子的活性，这一点对于医药领域具有重大的作用。现有的神经生长因子的活性测定方法是采用鸡胚背根神经节法。首先是鸡胚背根神经节培养分离大鼠尾神经，剪成数段，用75％的酒精消毒，然后浸泡于1/1000冰醋酸溶液中12小时，离心取上清液，每10ml加入1/100酚红1ml，混匀，高压灭菌，于2cm平皿中加入1ml均匀铺平，凉至室温，置干燥盒内，用氨水熏30分钟，再用无菌水反复冲洗至中性。DMEM培养基(美国GIBCO公司产品)，加入10％灭能胎牛血清，适量青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺，混匀。取已过滤除菌的rhNGF半成品，用配好的培养液稀释不同倍数。取7～9天的鸡胚，无菌条件下在解剖显微镜下取出背根神经节，分置于涂有鼠尾胶的培养皿中，加含有不同稀释度rhNGF的培养基1ml，于37℃、含5％CO2的培养箱中培养24～48小时，用倒置显微镜观察。比较神经节周围突起的生长情况，选择突起最长最密者，每ml培养基中所含的NGF量定为一个活性单位。原液的稀释倍数即为半成品的活性，表示为A万u/ml。
采用这种活性测定方法步骤烦琐、费时、测定的精确度差，急需要一种可以方便快捷的方式对神经生长因子活性进行测定的方法。这一方法的改进不仅可以为高效测定神经生长因子的有效性提供方便，而且对于定量测定神经生长因子活性，确定药物的有效性提供有效的对比数据。
实现本发明的目的所采用的技术方案是用已知生物活性的神经生长因子刺激特定细胞系进行增殖，在增殖后的培养基中加入显色物质，在酶标仪上比色，作出标准曲线；然后将未知生物活性的神经生长因子刺激特定细胞系进行增殖，在增殖后的培养基中加入显色物质，在酶标仪上比色，将比色结果与标准曲线对比后即得出未知生物活性的神经生长因子的生物活性。
实现本发明的一个具体技术方案是生长因子所刺激增殖的特定细胞可以是TF-1细胞系(人体髓样细胞系)。由于TF-1细胞系是一个依赖于GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子)的细胞系，其细胞表面具有NGF高亲和力受体TrkA蛋白，高亲和力受体TrkA蛋白与NGF结合后能诱导TrkA蛋白自身磷酸化，从而引起TF-1细胞的增殖。将已知的不同浓度的NGF加入TF-1细胞培养物中，观察TF-1细胞的生长情况，发现0.5～50ng/ml NGF可明显促进其增殖，当NGF的浓度达到50ng/ml以上时饱和。具体测量时，将已知的不同浓度的NGF加入TF-1细胞培养物中，在增殖后的培养基中加入显色物质后，在酶标仪上比色，作出标准曲线。将需测定未知浓度的NGF加入TF-1细胞培养物中进行培养，在培养后的培养物中，加入显色物质后，在酶标仪上比色，与标准曲线对比，得出未知浓度的具体值。
本发明的技术方案中所使用的细胞显色物质是MTT或XTT。
本发明的公开的具体技术方案可以是在用GM-CSF培养的TF-1细胞悬液中，加入已知浓度和生物活性情况的NGF的药物后继续培养，由于不同浓度的NGF对细胞的增殖生长情况是不相同，在加入细胞显色物质MTT后，将培养物在酶标仪上进行比色，测量其波长，作出标准曲线。然后在用GM-CSF培养的TF-1细胞悬液中，加入需要测量神经生长因子生物活性情况的药物后继续培养，由于不同浓度的NGF对细胞的增殖生长情况是不相同，在加入细胞显色物质MTT后，将培养物在酶标仪上进行比色，测量其波长，以已知生物活性的NGF标准曲线作为对比参照，通过对照标准曲线，计算出待测NGF样品的生物活性数值。
本发明的一个较佳的方案是将多个已知生物活性的rhNGF对照品按一定的数值做成梯度，分别加入GM-CSF培养的TF-1细胞悬液调整至浓度为1×105～2×105/ml，加入96孔培养板，每孔100μl，含1-50IU/ml GM-CSF。NGF按一定的比例稀释后每孔加10μl，以10μl无血清RPM1 1640培养基作空白对照。培养板置37℃、5％CO2孵箱内培养48h。然后每孔加5mg/ml MTT 20μl继续培养4～6h，培养结束时，每孔加入15％SDS 100μl，充分混匀后在酶标仪上比色，测量波长为570nm。每个实验取3次实验的平均结果，绘制标准曲线。将待测的NGF样品稀释后加入GM-CSF培养的TF-1细胞悬液调整至浓度为1×105～2×105/ml，加入96孔培养板，每孔100μl，含1-50IU/mlGM-CSF。NGF按一定的比例稀释后每孔加10μl，以10μl无血清RPM11640培养基作空白对照。培养板置37℃、5％CO2孵箱内培养48h。然后每孔加5mg/ml MTT 20μl继续培养4～6h，培养结束时，每孔加入SDS 100μl，充分混匀后在酶标仪上比色，得出数值与标准曲线对照，得出NGF的生物活性数值。
采用本发明的神经生长因子的测量方法，能定性和定量测量NGF的生物活性，具有简便、精确、快速地优点。
图2是实施例中所绘制的标准曲线图。
图3是测量方法的流程框图。
如图3所示，测量未知生物活性的对照品A570，加入GM-CSF培养的TF-1细胞悬液调整至浓度为1×105～2×105/ml，加入96孔培养板，每孔100μl，含1-50IU/ml GM-CSF。将对照品A570按比例稀释后每孔加10μl，以10μl无血清RPM1 1640培养基作空白对照，培养板置37℃、5％CO2孵箱内培养48h。然后每孔加5mg/ml MTT 20μl继续培养4～6h，培养结束时，每孔加入SDS 100μl，充分混匀后在酶标仪上比色，所测得的波长值对照图2所示的已知生物活性梯度所做标准曲线。所测样品活性可从标准曲线上查出，表示为A万u/ml。
权利要求
1.一种测量神经生长因子生物活性的方法，其特征在于将未知生物活性的神经生长因子刺激特定细胞系进行增殖，在增殖后的培养基中加入显色物质，在酶标仪上比色，将比色结果与标准曲线对比后即得出未知生物活性的神经生长因子的生物活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于神经生长因子所刺激增殖的特定细胞可以是TF-1细胞系；将未知浓度的NGF加入TF-1细胞培养物中进行培养，在培养后的培养物中，加入显色物质后，在酶标仪上比色，与标准曲线对比，得出未知浓度的具体值。
3.如权利要求1或2所述的任一方法，其特征在于所使用的细胞显色物质是MTT或XTT中的任一一种。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于是在用GM-CSF培养的TF-1细胞悬液中，加入需要测量神经生长因子生物活性情况的药物后继续培养，加入细胞显色物质MTT继续培养后，将培养物在酶标仪上进行比色，以已知生物活性的NGF标准曲线作为对比参照，通过对照标准曲线，计算出待测NGF样品的生物活性数值。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于是将待测的NGF加入GM-CSF培养的TF-1细胞悬液调整至浓度为1×105～2×105/ml，加入96孔培养板，每孔100μl，含1-50IU/ml GM-CSF。NGF按一定的比例稀释后每孔加10μl，以10μl无血清RPM11640培养基作空白对照；培养板置37℃、5％CO2孵箱内培养48h；然后每孔加5mg/ml MTT 20μl继续培养4～6h，培养结束时，每孔加入SDS 100μl，充分混匀后在酶标仪上比色，测量波长吸收值与标准曲线对照，得出NGF的生物活性数值。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于用已知生物活性的神经生长因子刺激特定细胞系进行增殖，在增殖后的培养基中加入显色物质，在酶标仪上比色，作出标准曲线；然后将未知生物活性的神经生长因子刺激特定细胞系进行增殖，在增殖后的培养基中加入显色物质，在酶标仪上比色，将比色结果与标准曲线对比后即得出未知生物活性的神经生长因子的生物活性。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于神经生长因子所刺激增殖的特定细胞是TF-1细胞系；用已知浓度的神经生长因子加入TF-1细胞培养物中进行培养，在培养后的培养物中，加入显色物质后，在酶标仪上比色，绘制标准曲线；将未知浓度的NGF加入TF-1细胞培养物中进行培养，在培养后的培养物中，加入显色物质后，在酶标仪上比色，与标准曲线对比，得出未知浓度的具体值。
8.如权利要求3或7所述的任一方法，其特征在于是在用GM-CSF培养的TF-1细胞悬液中，加入已知神经生长因子生物活性情况的药物后继续培养，在加入细胞显色物质MTT继续培养后，将培养物在酶标仪上进行比色，绘制标准曲线；用GM-CSF培养的TF-1细胞悬液中，加入需要测量神经生长因子生物活性情况的药物后继续培养，加入细胞显色物质MTT继续培养后，将培养物在酶标仪上进行比色，以已知生物活性的NGF标准曲线作为对比参照，通过对照标准曲线，计算出待测NGF样品的生物活性数值。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于是将已知的重组人神经生长因子和鼠源神经生长因子加入GM-CSF培养的TF-1细胞悬液调整至浓度为1×105～2×105/ml，加入96孔培养板，每孔100μl，含1-50IU/ml GM-CSF；rhNGF按一定的比例稀释后每孔加10μl，以10μl无血清RPM11640培养基作空白对照，并以rhNGF对照品按0.025，0.1，0.4，1.6，6.4，25.6/ml做成梯度，培养板置37℃、5％CO2孵箱内培养48h；然后每孔加5mg/ml MTT 20μl继续培养4～6h，培养结束时，每孔加入SDS 100μl，充分混匀后在酶标仪上比色，测量波长，得出数值绘制标准曲线；将待测的NGF加入GM-CSF培养的TF-1细胞悬液调整至浓度为1×105～2×105/ml，加入96孔培养板，每孔100μl，含1-50IU/ml GM-CSF。NGF按一定的比例稀释后每孔加10μl，以10μl无血清RPM11640培养基作空白对照；培养板置37℃、5％CO2孵箱内培养48h；然后每孔加5mg/ml MTT 20μl继续培养4～6h，培养结束时，每孔加入SDS 100μl，充分混匀后在酶标仪上比色，测量波长得出数值与标准曲线对照，得出NGF的生物活性数值。
全文摘要
一种测量神经生长因子生物活性的方法，其特征在于将未知生物活性的神经生长因子刺激特定细胞系进行增殖，在增殖后的培养基中加入显色物质，在酶标仪上比色，将比色结果与标准曲线对比后即得出未知生物活性的神经生长因子的生物活性。采用本发明的神经生长因子的测量方法，能定性和定量测量NGF的生物活性，具有简便、精确、快速的优点。
文档编号G01N33/52GK1390950SQ02134339
公开日2003年1月15日 申请日期2002年7月11日 优先权日2002年7月11日
发明者王革, 柴向东, 王妍 申请人:深圳海王英特龙生物技术有限公司