专利名称：测试全血的方法
技术领域：
本发明涉及在利用全血作为样品分析全血中含有的特定成分的方法。
背景技术：
在血液中的成分例如抗原，抗体，蛋白质，内分泌物质等在临床上是非常重要的。通常，在许多情况中，血浆或血清被用作血液样品，并且在这样的情况中，为了避免溶血，通常将全血尽可能快地分离成血清或血浆。这是因为，例如，在免疫测试领域，如果存在血细胞成分，或在样品中引起溶血，可能出现引起扰乱的现象，如在视觉系统上影响溶血，血细胞的内部成分抑制免疫反应，和用作固相的固体载体上血细胞的细胞质膜成分的聚集或黏连。所以，在普通的临床测试中，经提取的全血首先离心除去血细胞，并且将得到的血浆或血清用作测试的样品已经是一个一般的操作了。
但是，为了除去血细胞，需要专用仪器如离心机，并且操作也是耗劳力的。所以，对于实际操作中没有这样的设备和进行暂时的空白很少的紧急的测试的技术人员，利用全血作为测试样品是需要的。
为了满足上面的需要，已经推荐了各种测试全血而不分离血清或血浆的方法。作为免疫测试，利用乳胶凝集作为均质测试(homogeneousassay)的方法(不需要B/F分离的方法)已经有报道可以作为血细胞的溶血是故意并且强迫造成的测试方法(日本专利Laid公开号(kokai)，10-48214)。其次，作为不会引起血细胞溶血的测试方法，利用乳胶分散光的均质测试方法(临床化学，43卷，1764-1770(1997))，利用塑料小管作为固相的异质测试(heterogeneous assay)方法(需要B/F分离的方法)(日本专利公开号6-265554)，和利用聚丙烯小珠或磁性颗粒作为固相的方法(日本国际专利待审公开号(kohyo)，2000-508075，WO96/04558)已经有报道。
但是，不能说利用这些方法，用全血作为样品的方便的和高度敏感的测试方法已经确定。首先，已经报道利用均质测试的一些免疫测试方法可作为方便的方法，但分析物经常是临床测试等中的血液中含有的痕量物质等，所以通常非常需要利用理论上是高灵敏的测试方法的异质测试方法来测试全血。其次，有了由于B/F分离的简单性将固体载体如磁颗粒广泛用于异质测试作为固相的背景，微颗粒如磁性颗粒似乎特别是受血细胞的影响的，虽然具有固体载体将不会聚集的这样大小的固体载体不会引起如具有微米级的直径的小珠和塑料板的情况中的问题。例如，当发生溶血时，流出血细胞内部流入反应系统的抑制物质如血红蛋白和细胞核派生物质可以引起固体载体的非特异凝集或降低免疫反应，从而严重影响测试。另外，甚至当新鲜的未溶血的全血用作样品时，如果血细胞存在，因为血细胞膜表面的物质等，固体载体似乎变成了容易在反应容器的内壁上或滴管尖上黏附，所以，可以引起伤害如不准确的测试。
另外，经常利用自动测试的仪器和筒体(cartridge)，使能够快速和方便地进行如上所述的全血测试。但是，在这样的自动测试中的每个步骤中也发生相同的问题。即，在全血中的血细胞成分和用于测试中的固体载体是随时间而沉淀的，因此必需的是包括，在测试之前有效搅拌含有全血的样品从而维持血细胞成分均一的步骤，或者在反应步骤或测试步骤中有效搅拌样品、固体载体、试剂等的步骤。在这样的搅拌步骤中，在血细胞上加了强力，血细胞被破坏了，导致极端容易溶血。另外，因为在每个步骤进行样品的抽吸和放出，以便成功地将样品根据步骤转移到靶反应容器中，在血细胞上加强力，所以容易发生溶血。另外，非特异黏附和聚集也容易发生。所以，经常会引起测试错误。
在最近几年中，如上所述的自动测试中的这样的仪器和软片也广泛用于床边检测(POCT)领域，它们作为突发测试方法或技术人员和护士容易进行的测试方法引起了注意。因此，需要开发即使使用这样的仪器和全血也可以提供准确的测试结果的测试方法。
发明内容
本发明的目的是提供快速和方便的测试全血中的分析物的方法，它的灵敏性很高，利用全血作为样品。
为了达到前面所述的目的，本发明的发明人进行了各种研究。作为结果，他们发现，在测试含有全血的样品中含有的分析物的方法中，如果在存在去垢剂和在血细胞不被破坏的血细胞的状态中进行反应，测试可以在短期中进行，灵敏性高，没有通过离心等进行血清/血浆的分离。
所以，本发明提供了测试分析物的方法，其包括形成反应系统的反应步骤和测试形成反应产物的测试步骤，该反应系统包括含有全血的样品、第一物质和第二物质，并且使分析物与第一个和第二个物质反应，该第一物质为固体载体所携带并且特异结合样品中含有的分析物，该第二物质特异结合分析物，其中(1)反应步骤在血细胞不被破坏的状态下进行，和(2)至少反应步骤在足够量去垢剂的存在下进行，所述足够量去垢剂不引起溶血、不对第一和第二物质与分析物特异结合的分析物反应进行抑制，可以防止存在于反应系统中的成分对反应系统的影响。
另外，本发明的另一个实施方案是测定全血中的分析物的方法，包括(1)稀释步骤，通过将全血与全血处理溶液混合来稀释全血；(2)第一反应步骤，将固体载体携带的、特异地与分析物结合的第一物质加入到稀释的全血中，使它们反应，在反应系统中形成第一反应产物；(3)第一分离步骤，从反应系统中分离出第一反应步骤中形成的第一反应产物；(4)第二反应步骤，向分离出的第一反应产物中加入与分析物特异结合的第二物质，使它们反应，在反应系统中形成第二反应产物；(5)第二分离步骤，从反应系统中分离出第二个反应步骤中形成的第二反应产物；和(6)测定步骤，测定分离出的第二反应产物，其中全血处理溶液含有当溶液与全血混合时不会引起溶血、不抑制分析物与第一和第二物质的反应，并且可以防止每个步骤中的反应系统存在的成分对反应系统的影响的、足够量的去垢剂。
另外，在本发明的另一方面，提供了用于本发明的测定方法中的试剂盒。试剂盒的例子是测定全血中的分析物的试剂盒，其包括固体载体携带的、与分析物特异结合的第一物质，特异结合分析物的第二物质，和当与全血混合时不引起溶血、不抑制分析物与第一个物质和第二个物质的反应的去垢剂。
所以，本发明将在下面详细解释。
本发明的测试方法是测试含有全血的样品中的分析物的方法。
术语“含有全血的样品”指从患者中收集的全血，与一些处理溶液(如前所述也称为“全血处理溶液”)混合的全血等。术语“全血”指从假设它含有分析物或可能含有分析物时的从患者收集的全血，和优选地在收集后3天内更优选地是在收集后24小时内，或更优选地是在收集后立即，或在收集后12小时内使用的新鲜血液。可以通过已知的方法，利用血液收集管等收集血液，用抗凝固剂如EDTA或肝素等处理。血液优选冷藏，更优选在4到0℃存储。
对分析物没有特别的限制，只要它包含在全血中，并且是与物质特异结合而形成反应产物的物质即可。分析物和特异结合的物质的组合的例子包括抗原和抗体，抗体和抗原，蛋白质和配体，糖链和凝集素等。特别优选的是抗原和抗体或者抗体和抗原。所以，在本发明中，术语“特异结合”指通过生物化学特异的键形成反应产物。分析物的特异的例子包括肝炎B病毒表面抗原(HbsAg)，肝炎C病毒(HCV)抗体和抗原，人免疫缺陷病毒(HIV)抗体，人T细胞白血病病毒-1(HTLV-1)抗体，苍白密螺旋体(TP)抗体等。另外，各种心肌标记(肌酸激酶(CKMB)，肌红蛋白，肌钙蛋白)，各种激素，血清蛋白等也是可以的。
另外，本发明的测试方法是利用固体载体携带的、特异结合分析物的第一个物质，和特异结合分析物的第二个物质的异质测试方法。这样的方法可以是任何方法，只要它包括使含有全血的样品中前面提到的分析物与第一和第二物质反应的反应步骤和测定形成的反应产物的测定步骤。
具体地，形成了包括前面提到的样品、固体载体所携带的、特异结合分析物的第一物质、和特异结合分析物的第二物质的反应系统，并且分析物与第一和第二物质反应。虽然第一和第二物质可以同时或依次地与分析物反应，优选依次地反应。在前一实施方案中，例如，第一物质和第二物质是加入到样品中的。在后一实施方案中，方法包括两个反应步骤，例如，在样品中加入第一物质使它们反应形成第一反应产物的第一反应步骤，在第一反应产物中加入第二物质使它们反应形成第二反应产物的第二反应步骤。所以，在本发明中，表达语“形成包括样品、第一物质和第二物质的反应系统”包括其中三个成分同时反应的例子(即，包括一个反应步骤)和依次反应的例子(即，包括两个反应步骤)。
在分析物与第一物质反应形成第一反应产物的第一反应步骤后，优选地进行B/F分离(第一分离步骤)。另外，在B/F分离后进行第二物质与第一反应产物反应的第二个反应步骤，然后优选地进行第二B/F分离(第二分离步骤)。通过这样的操作，可以在更高的灵敏度下进行测定。在这些步骤中的每一个步骤中的条件可以适当地根据分析物和与其特异结合的物质的组合来选择。
具体地说，例如，当抗体和抗原反应并且测定反应产物的量时，可以如下进行测定。即，在全血中含有的抗原或抗体、携带有与其特异结合的抗体或抗原(第一物质)的固体载体、和另一种标记抗体或抗原(第二物质)，混合形成免疫复合物。然后，通过洗涤除去未反应的抗体和抗原(B/F分离)，测定与固体载体结合的标记物质的量。更具体地说，例如，将含有全血的样品和携带有第一物质的磁性颗粒(固体载体)放置于反应容器中，并且搅拌，然后，在预定的温度下、预定的时间内进行抗原抗体反应。在反应后，利用磁力作用，通过B/F分离，从反应容器中除去未反应的物质。随后，在反应容器中放置标记的第二物质，在预定的温度和预定的时间内反应，再次利用磁力进行B/F分离除去未反应的物质。最后，通过测定产生的反应产物中含有的标记物质的量可以测定分析物的量。
固体载体没有特别限制，只要它基本在用于测定中的各种溶液中不溶。但是，优选利用磁性颗粒、聚合物诸如聚苯乙烯或其乳胶、明胶、脂质体等。其中，从实现快速和简单的B/F分离的观点来看，磁性颗粒是特别优选的。其具体例子包括，由金属的微颗粒组成的磁性颗粒，这样的金属如四氧化三铁(Fe3O4)、三氧化二铁(Fe2O3)、各种铁氧体、铁、镁、镍、钴和铬、以及钴、镍、镁等的合金。另外，使这些磁性颗粒在聚合物如聚苯乙烯的乳胶中、明胶、脂质体等中包含，或固定在这些物质的表面也是优选的。
这些固体载体的颗粒大小没有特别的限制，只要可以准确地进行B/F分离即可。但是，过小的颗粒大小导致分离效率很小，所以容易发生聚集。另一方面，过大的颗粒大小容易导致沉淀。所以，颗粒大小的下限是0.05μm，优选是0.1μm，上限适宜的是10μm，优选是4μm，更优选是2μm。颗粒大小范围是这些上限和下限的组合来确定的。载体的具体的颗粒大小范围通常是0.05到10μm，优选地是0.05到4μm，更优选地是0.1到2μm。
利用已知的方法，可以使与分析物特异结合的第一物质被这样的固体载体所携带。具体地说，例如，可以为化学结合方法，物理黏附方法等。
测试方法中，利用如上所述制备的固体载体的B/F分离可以通过过滤方法、抗体捕获技术、沉淀方法等进行。特别是，当利用磁性颗粒时，可以利用永磁体、电磁体等产生磁场，以利用磁力快速方便地进行B/F分离。
本发明的测试方法，其特征在于(1)在血细胞不被破坏的状态下进行前面提到的反应步骤，和(2)至少反应步骤在足够量大的不引起溶血并且不抑制分析物与特异结合分析物的第一和第二物质的反应、并且可以防止在反应系统上的反应系统中存在的成分的影响的去垢剂存在下进行。
表达语“血细胞不被破坏的状态”是不受限制的，只要反应步骤可以在不破坏全血中的血细胞下进行即可。这一状态意味着血细胞不被破坏的状态，或者有小数目的血细胞被破坏但不足以使测试受到影响的状态。作为实现血细胞不被破坏状态的方法，可以有以下方法，加入在反应系统中不引起溶血的去垢剂的方法，用等渗溶液如生理盐调节反应系统的等渗压的方法，在反应系统中加入镁离子等防止细胞核等的破裂的方法。另外，这些方法可以组合使用。
用于本发明中的去垢剂不受特别限制，只要它是不引起溶血，不抑制分析物和第一和第二物质与分析物的特异结合、可以防止反应系统中存在的成分对反应系统的影响的浓度和类型。本文中所用表达语“不引起溶血”是指，在去垢剂与全血中含有的样品混合时不引起溶血或者溶血很弱不足以使测试受到影响。表达语“不抑制分析物和特异结合分析物的第一和第二物质的反应”指，去垢剂并不对由生物化学地特异结合这些物质而形成反应产物进行抑制，或者抑制很弱以致测定不受影响。表达语“防止反应系统中存在的成分对反应系统的影响”指，去垢剂对由存在于反应系统中的血细胞、其它成分或其类似物所引起的、在反应容器或滴管尖的内壁上的非特异聚集、黏附、目标特异结合以外的结合等进行抑制，从而防止它们在反应步骤过程中的影响。
如上所述通过在反应系统中加入去垢剂，可以防止溶血，可以防止固体载体如磁性颗粒在反应容器或滴管尖的内壁上的非特异黏附，在测定过程中可以避免血细胞成分和血细胞引起的影响，从而可以进行准确的测定。
在本发明中，特别优选使用聚氧乙烯山梨糖醇酐酯型或磺基甜菜碱型去垢剂。
聚氧乙烯山梨糖醇酐酯型去垢剂包括聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween 20)，聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80)等。在这些中，聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80)，具有微弱的溶血作用，使用较为理想。
磺基甜菜碱型去垢剂的例子包括二甲基乙基铵丙磺酸盐，3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐，二甲基苄基铵丙磺酸盐，n-辛基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐，n-癸基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐，n-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐，n-十四烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐，n-十六烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐等。在这些中，二甲基乙基铵丙磺酸盐，3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐，二甲基苄基铵丙磺酸盐和n-辛基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐，具有弱的溶血作用，使用较为理想。
在形成包括样品、与样品中含有的分析物特异结合的第一、第二物质并使分析物与第一、第二物质反应的反应系统的反应步骤之前，作为预处理，可以将去垢剂加入到全血处理溶液中，使其与全血混合。但是，因为前面提到的去垢剂基本上不抑制分析物和特异结合的第一、第二物质的反应，因此，例如，当固定在固相上的抗体的溶液用作固体载体所携带的第一物质时，去垢剂可以预先加入到溶液中，从而使溶液直接与含有全血的样品反应。另外，将去垢剂加入到至少第一反应步骤中就足够了，其中许多血细胞包含在反应混合物中。但是，因为它们也具有抑制固体载体的非特异黏附或聚集的效果，优选地也将去垢剂在第二反应步骤中加入。它们可以在包括测试步骤在内的所有的步骤中加入。
这样的去垢剂可以任何浓度加入，只要它们以这样的浓度加入，可以发挥前面提到的效果即可。具体地说，它们在反应步骤中加入的最终浓度范围是，例如0.1到10％，优选0.5到5％，更优选是0.5到2％。可以单独加入一个这样类型的去垢剂，或者可以利用两个或多个类型的混合物。当利用两个或多个类型的混合物时，它们也可以浓度在前面提到的效果得到发挥的范围内进行任意的组合。另外，当在全血溶液中使用去垢剂时，可以制备全血处理溶液使去垢剂浓度的范围在0.1到50％，优选0.5到30％。如上所述制备的含有去垢剂的全血处理溶液的混合比例，全血的比例可以是使混合后去垢剂在含有全血的样品中的浓度是前面提到的浓度范围。另外，混合的比例优选是考虑样品中含有的分析物的量来确定的。当待测定少量的样品中含有的痕量物质时，全血处理溶液的比例优选地测定为小的。具体地说，例如，全血和全血处理溶液的混合比例可以是99∶1到5∶95的范围。
用于本发明的全血处理溶液可以任意选择并且利用，只要溶液的量或特征是使全血中的血细胞成分不溶血。或各种成分不变性。具体的例子包括调节生理pH、等渗压、盐浓度等的溶液，如磷酸盐缓冲液(磷酸缓冲盐水；PBS)，生理盐水，生理盐溶液。另外，还可以混合除了如上所述制备的溶液以外的任何溶液，只要它的量使血细胞成分和其他成分不受影响即可。但是，如果分析物仅为全血中含量很小的物质，优选用全血本身或将全血与全血处理溶液以低混合比例混合来进行测试。
第二物质优选是经标记的。标记物质的例子包括酶，发光物质，荧光物质，放射性同位素，着色物质，各种着色颗粒等。其中，优选使用酶。在化学发光酶免疫测试(CLEIA)中经常利用的酶的例子包括碱性磷酸酶，过氧化物酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶(glucoxidase)等。作为这些酶的底物，对应于这些酶的底物是可以选择的。例如，对于碱性磷酸酶可以使用金刚烷基甲氧基苯基磷酰基二氧杂环丁烷(AMPPD)，对于过氧化物酶可以使用鲁米诺/过氧化物，对于半乳糖苷酶可以利用金刚烷基甲氧基苯基-β-D-半乳糖基二氧杂环丁烷(AMPGD)。
作为反应产物的测定方法，可以利用任何常规的方法。例如，当使用如上所述标记的第二物质时，通过在反应产物中测定标记产物的量可以方便地进行测定。例如，当利用化学发光酶免疫测试(CLEIA)方法时，利用光电倍增管(PMT)或类似物可以测定反应产物中的标记物质的发光强度。
即，在本发明中，表达语“测定反应产物”不仅指直接测定反应产物本身的量，而且包括测定与反应产物有量关系的物质的量。在样品中待测定的分析物的量可以从如上所述测定的反应产物的量来计算。另外，测定反应产物的存在或不存在的定性测定，也属于本发明的测定反应产物的范围内。
另外，当利用全血进行测定时，在测定后通常需要血细胞比容校正。在大多数样品中，血细胞比容变成约40到50％。另外，当作为感染疾病的情况中的阳性或阴性测定的测定项进行定性测定时，血细胞比容就不那么重要了。所以，即使并不对对每个样品都测定血细胞比容值时，都没有实际的问题。当血细胞比容值可得时，更准确的测试结果当然可以是通过进行血细胞比容校正来得到(测试结果X100/(100-血细胞比容值(％)))。
本发明的试剂盒是测定全血中的分析物的试剂盒，其包括固体载体携带的、特异结合分析物的第一物质，特异结合分析物的第二物质，和当与全血混合时不引起溶血和不抑制分析物与第一、第二物质的反应的去垢剂。本发明的试剂盒，除了包括前面提到的去垢剂以外，其它与测定血浆或血清中的分析物的常规试剂盒具有相同的组成。即，本发明的试剂盒用于前面提到的本发明的测试方法中。
试剂盒优选进一步包括全血处理溶液。全血处理溶液可以含有如上所述的去垢剂。作为任意的成分，试剂盒可以进一步包括反应稀释剂，底物溶液，底物溶解溶液，洗涤溶液，反应终止溶液等。利用这样的试剂盒，本发明的测试方法可以快速而方便地进行，准确度和稳定性良好。
本发明的测试方法可以利用已知的自动测试中使用的仪器、筒体等来进行。其具体的例子包括WO01/84152，日本专利Laid公开号11-316226等中所述的筒体和仪器。另外，本发明的试剂盒也包装在自动测试中使用的筒体中，和适当用于前面提到的自动测试的仪器中。通过将本发明的试剂盒与用于自动测试的仪器和柱体相组合，可以提供快速、方便并且灵敏度高的测试方法。
实施本发明的最佳方案参考下面的实施例，本发明将更详细地得到解释。但是，本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1制备B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)化学发光酶免疫试剂(1)制备磁性颗粒在50mM磷酸盐缓冲液(pH4.0)中，将抗HBsAg多克隆抗体物理地黏附于磁性颗粒(0.3μm)上，然后用含有0.2％BSA的Tris缓冲液(0.1M，pH8.0)在37℃处理1天，得到抗HBsAg抗体结合颗粒。将得到的磁性颗粒悬浮于0.1M Tris缓冲液(pH 8.0)中，浓度为100到200μg/ml。
(2)制备标记的抗体将抗HBsAg单克隆抗体与小牛碱性磷酸酶(ALP)通过马来酰亚胺方法结合，得到ALP标记的抗HBsAg抗体。得到的标记抗体悬浮于0.1M Tris缓冲液(pH8.0)中，浓度为0.2到0.5μg/ml。
(3)制备B/F洗涤溶液制备含有1％Tween 20和0.15M NaCl的0.1Mtris缓冲液(pH8.0)。
(4)发光底物作为发光底物，使用25mM AMPPD溶液(Tropix)。
实施例2抗HBsAg抗体结合颗粒和标记抗体的测试首先，证实了实施例1中产生的试剂的效能。利用HBsAg阳性对照血清和阴性对照血清作为样品评价效能，不利用全血评估效能。在测试中，将60μl样品与150μl磁性颗粒一起加入，搅拌，在42℃温育10分钟。然后，用磁铁收集磁性颗粒，用B/F洗涤溶液洗涤。随后，将洗涤的磁性颗粒与150μl的标记抗体一起加入，搅拌，在42℃再次温育10分钟，然后，用磁铁收集磁性颗粒，用B/F洗涤溶液充分洗涤。另外，洗涤的磁性颗粒与200μl的AMPPD溶液一起加入，充分混合，在42℃温育5分钟。然后，利用光电倍增管(PMT)测定发光强度。
重复上面的测试12天，检测每天测定中的再现性。结果，如表1中所示得到了有利的结果。
表1
实施例3检测全血处理溶液设定去垢剂是通过预先在全血处理溶液中加入去垢剂来加入反应系统中的，如此进行测定。在含有1％BSA和0.15M NaCl的0.1M Tris缓冲液(pH8.0)中溶解各种去垢剂制备全血处理溶液，检测适于本发明的检测方法的去垢剂。
利用EDTA血液收集试管收集血液。然后，向在4℃下放置3天的各全血中和由全血经离心而得到的各血浆中加入HBsAg 1U/ml，利用使用血浆作为100％的测试中得到的发光强度进行HBsAg的回收实验。全血中的血细胞成分，在4℃放置过程中沉淀，在血浆部分观察到轻微溶血。通过另一个方法测定溶血细胞的量，发现总的红细胞的约5％发生了溶血。
以实施例2中相同的方法进行测试。全血和各全血处理溶液的混合比例是9∶1，血浆与净化水的混合比例是9∶1，立即测定HBsAg。另外，代替全血处理液，而是全血与前面提到的缓冲液(含有1％BSA和0.15 M NaCl的0.1M Tris缓冲液(pH 8.0))混合，其中没有加入去垢剂，以相同的方式测定HBsAg。在反应系统中存在或不存在溶血的情况下，都可以通过目测证实反应过程中磁性颗粒在反应容器(聚丙烯制造)上的非特异黏附和磁性颗粒的非特异聚集。其结果示于表2中。
表2
曲通X-100聚氧乙烯辛基苯基酯吐温20聚氧乙烯山梨糖醇酐单肉桂酸酯吐温80聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯Brj78聚氧乙烯硬脂酸酯SDS十二烷基硫酸钠CHAPS3-((3-胆酰胺基丙基)二甲基胺基}-1-丙磺酸盐如表2所示，当利用全血作为样品时，回收比例的测试结果是，在与吐温20、吐温80或3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐混合的样品中，或在不含有去垢剂(含有1％BSA和0.15M NaCl的0.1M Tris缓冲液(pH8.0))的样品中为85％或更高。在这些中，不含有去垢剂的样品中的回收比例最好。但是，在反应容器的内壁上黏附了非常大量的磁性颗粒，所以B/F洗涤没有很好地进行，所以，这不能认为已经得到了准确的测试结果。所以，然后再进一步检测与吐温20，吐温80和3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐混合的样品。
另外，在这一实验中证明，通过如上所述的技术，可以容易地从各种去垢剂中选择出，基本上不引起溶血、不抑制分析物和特异结合分析物的物质和能够防止目标反应系统中反应系统中存在的成分对反应系统的影响的去垢剂的浓度和类型。
实施例4利用全血检测去垢剂的类型和浓度利用肝素作为抗凝固剂处理的血液收集管来收集血液。向在4℃过夜储存的全血中和由该全血得到的血浆中各加入0.5U/ml的HBsAg，以和实施例3相同的方法，利用血浆为100％的发光强度进行添加和回收测试方法。对于全血处理溶液，利用选自实施例3中的吐温20，吐温80和3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐以及曲通X-100进行比较。以与全血混合后最终浓度0.01、0.1、0.5、1和10％加入各去垢剂。在反应系统中存在或没有溶血时，在反应系统中通过肉眼观察各去垢剂，证实反应过程中磁性颗粒在反应容器(聚丙烯制造)上的非特异黏附和磁性颗粒的非特异聚集，测定相对于加入量的回收比例。结果表示在表3。
根据测试的结果，选择对于加入的量有好的回收比例，没有引起溶血或磁性颗粒在反应容器上非特异黏附的去垢剂。作为结果，当吐温80加入的浓度为0.5到10％，或3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐加入的浓度为1％，得到特别良好的结果。当曲通X-100加入的浓度为0.5％时，尽管回收比例为75％，通常是有利的，但观察到了溶血。另外，当吐温20加入的浓度是1到10％时，尽管没有观察到溶血和磁性颗粒在反应容器上的非特异黏附，但不能得到相对于加入量的充分的回收比例。
表3
实施例5利用新鲜全血检测随后，利用新鲜血液检测选自实施例4中的3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐和吐温80。在紧急的测试中，具体说是需要在收集血液后立即进行测试，以及全血中的血红细胞在存储的过程中可能逐步溶血、可能影响测试。所以，在血液收集后，立即利用新鲜血液进行测试。以和实施例3相同的方法进行HBsAg的添加和回收实验。加入3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐，吐温80和其混合物以制备全血处理溶液。结果如表4所示。
表4
作为测试的结果，甚至当利用新鲜的全血时，得到良好的比例为86到102％。
工业可利用性根据本发明的方法，可以快速和方便地利用全血作为样品在高灵敏度下对分析物进行测试。
权利要求
1.测试分析物的方法，其包括反应步骤和测定步骤，该反应步骤形成含有包括全血的样品、固体载体所携带的、特异结合样品中含有的分析物的第一物质和特异结合分析物的第二物质的反应系统，并且使分析物与第一和第二物质反应，该测试步骤测试形成的反应产物，其中(1)反应步骤是在血细胞不被破坏的状态下进行的；和(2)至少反应步骤是在存在足够量的不引起溶血、不抑制分析物与特异结合分析物的第一和第二物质的反应、并且可以防止反应系统中存在的成分对反应系统的影响的去垢剂下进行的。
2.权利要求1所述的方法，其中去垢剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐酯类型去垢剂和磺基甜菜碱类型去垢剂。
3.权利要求1或2所述的方法，其中反应系统中去垢剂的浓度的范围是0.1到10％。
4.根据权利要求1到3的任何一个所述的方法，其中含有全血的样品含有全血和全血处理溶液，该全血处理溶液含有足够量的去垢剂，该去垢剂当全血处理溶液与全血混合时不会引起溶血、不抑制分析物与特异结合分析物的第一和第二物质的反应、可以防止存在于反应系统中的成分对反应系统的影响。
5.根据权利要求4所述的方法，其中去垢剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐酯类型去垢剂和磺基甜菜碱类型去垢剂。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中全血处理溶液中的去垢剂的浓度的范围是0.1到50％。
7.根据权利要求4到6的任何一个所述的方法，其中全血和全血处理溶液的比例的范围是99∶1到5∶95。
8.根据权利要求4到7的任何一个所述的方法，其中全血处理溶液进一步包括特异结合分析物的第一物质。
9.根据权利要求1到8的任何一个所述的方法，其中使分析物与第一、第二物质反应的反应步骤包括，使第一物质与含有全血的样品反应形成第一反应产物的第一反应步骤，和使第二物质与第一反应产物反应形成第二反应产物的第二反应步骤。
10.根据权利要求1到9的任何一个所述的方法，其中第二物质是用标记物质标记的。
11.根据权利要求1到10的任何一个所述的方法，其中特异结合分析物的第一和第二物质，是抗原或抗体。
12.测定全血中的分析物的方法，包括(1)稀释步骤，将全血与全血处理溶液混合稀释全血；(2)第一反应步骤，将固体载体携带的、特异结合分析物的第一物质加入到稀释的全血中，使它们反应，在反应系统中形成第一反应产物；(3)第一分离步骤，从反应系统中分离出第一反应步骤中形成的第一反应产物；(4)第二反应步骤，在分离出的第一反应产物中加入特异结合分析物的第二物质，使它们反应，在反应系统中形成第二反应产物；(5)第二分离步骤，从反应系统中分离出第二反应步骤中形成的第二反应产物；和(6)测定步骤，测定分离出的第二反应产物，其中全血处理溶液含有足够量的去垢剂，该去垢剂当溶液与全血混合时不引起溶血、不抑制分析物与第一和第二物质的反应，并且可以在各个步骤中防止反应系统中存在的成分对反应系统的影响。
13.权利要求12所述的方法，其中第二物质是用标记物质标记的。
14.权利要求13所述的方法，其中特异结合分析物的第一和第二物质，是抗原或抗体。
15.测试全血中的分析物的试剂盒，其包括固体载体携带的、特异结合分析物的第一物质和特异结合分析物的第二物质，以及当与全血混合时不引起溶血、不抑制分析物与第一物质和第二物质的反应的去垢剂。
16.权利要求15所述的试剂盒，其进一步包括全血处理溶液。
全文摘要
在测定分析物的方法中，其包括反应反应步骤和测试形成的反应产物的测试步骤，该反应步骤形成含有全血的样品、固体载体携带的、且特异结合样品中含有的分析物的第一物质，和特异结合分析物的第二物质的反应系统，并使分析物与第一和第二物质反应，其中(1)反应步骤是在血细胞不被破坏的状态下进行的，(2)至少反应步骤是在存在足够量的去垢剂时进行的，该去垢剂不引起溶血、不抑制分析物与特异结合分析物的第一和第二物质的反应、并且可以防止反应系统中存在的成分对反应系统的影响。
文档编号G01N33/543GK1507566SQ02809599
公开日2004年6月23日 申请日期2002年3月7日 优先权日2001年3月9日
发明者横井宏行 申请人:株式会社三菱化学药得论