专利名称：叶酸测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及叶酸的测定法和用于该测定法的试剂盒和仪器。
叶酸(folate)这一术语包括叶酸，二氢叶酸，四氢叶酸和甲基四氢叶酸，它是合成胸苷酸进而合成DNA的辅酶，且通常被认为是维生素B复合物的一部分。广泛的报道称多种疾病状态的发病机理涉及低水平的叶酸或干扰叶酸代谢，所述疾病状态尤其包括巨幼红细胞性贫血，神经管缺陷，癌症和心血管疾病。孕妇缺乏叶酸还与幼儿白血病有关。相应地，对叶酸的精确估量在临床患病和发病率的评估和监控中很重要。
然而由于叶酸存在的形式多变，其各种形式的例如蝶啶环结构和谷氨酸残基的数目不同，而且由于叶酸在血清和红细胞中的分布不同，其不同变体的分布也不同，叶酸的估量是复杂的。的确目前有两种广泛使用的叶酸测定法—一种用于测定血清叶酸而另一种用于测定全血叶酸。然而对于全血叶酸而言，不同实验室的室间测定(interassay)和室内测定(intraassay)结果有很大差异。由于红细胞叶酸表示对病人长期状况的测定并较血清叶酸更少地受到摄食的影响，通常优选测定红细胞叶酸；然而考虑到可靠地测定红细胞叶酸的问题，有些实验室建议恢复血清叶酸的测定。
预期可通过如下方法消除由叶酸的异源性引起的问题将测定样品在半浓缩的盐酸中延时煮沸(约6小时)，然后进行层析分离并接着估量(例如通过质谱分析)所有变体共有的叶酸片段，即对氨基苯甲酸(PABA)。见例如Anal.Biochem.283266-275(2000)。这种苛刻处理和分离的效果是切断喋啶环并从叶酸的所有变体中除去所有附着的甘氨酸残基留下PABA。但这种技术不适于例如实验室诊断中或急救时(thepoint of care)的常规临床应用。特别是由于层析分离步骤耗时且不适合高通量或多重平行分析的性质。
迫切需要可信且可行的生物学样品中的叶酸的测定法。
我们现在发现了这样一种测定法，该测定法可基于PABA的检测而不需要从样品中层析分离它且不需要苛刻的和不利于使用者的或者无法实施的反应条件。
因此从一方面看，本发明提供了测定含有叶酸的样品中的叶酸的方法，所述方法包括以下步骤对所述样品进行水解以释放对氨基苯甲酸，p-氨基苯甲酰谷氨酸，或其盐；使所释放的对氨基苯甲酸，PABA-glu或盐，或其重氮衍生物与其结合配偶体反应；并直接或间接地测定产生的结合配偶体对氨基苯甲酸，结合配偶体PABA-glu，或盐或衍生物的结合物。
优选本发明提供测定含有叶酸的样品中的叶酸的方法，所述方法包括以下步骤对所述样品进行水解以释放对氨基苯甲酸或其盐；将释放的对氨基苯甲酸或其盐或其重氮衍生物和其结合配偶体反应；并直接或间接地测定产生的结合配偶体对氨基苯甲酸，或盐或衍生物组合物。
根据本发明的方法测定的样品可以是任何含有叶酸的样品，但特别优选的是血液或来自血液的样品，例如浓缩红细胞或血清，尤其是浓缩红细胞(RBC)(必要时可为洗涤过的)。在RBC样品中，如需要可裂解细胞且在水解前使从中释放的蛋白质变性；但任选和优选水解处理本身引起细胞裂解和蛋白质变性。
在本发明的测定方法中，结合配偶体可在溶液中或者被固定于宏观结构上，例如固体，液体或胶体颗粒，或基质表面，例如薄片，棒，管子，纤维，网孔，网等等。例如通过特征性射线的发射或吸收或酶活性可直接检测结合偶合体PABA，结合偶合体PABA-glu等等结合物。可选地，例如其可利用结合偶合体与竞争性物质结合的能力来间接栓测，所述竞争性物质与所述结合配偶体产生可直接检测的结合物。
在优选的一方面，结合偶合体是能够结合PABA，PABA-glu或PABA衍生物等等的抗体或抗体类似物，例如抗体，抗体片段，单链抗体或抗体片段，寡肽，寡核苷酸或小有机分子。使用合适的抗原，例如PABA，PABA-glu，或PABA(或PABA-glu)偶联物或衍生物，可使用传统技术筛选此种结合偶合体，所述传统技术包括例如体内抗体生成，文库技术例如噬菌体显示技术；组合的化学技术和计算机支持的分子设计。
然而在尤其优选的实施方案中，结合配偶体是芳香族叔胺或苯酚或苯酚衍生物，该衍生物能够与对重氮苯甲酸(PDBA)或对重氮苯甲酰谷氨酸(PDBA)偶联以形成具有特征性光吸收或发射的重氮化合物(所述光包括除可见光波长范围之外的射线，例如IR和UV，尤其是近IR的射线)。
在本实施方案中，例如通过与亚硝酸盐反应，优选在与结合偶合体反应前，将释放的PABA或PABA-glu分别转化成PDBA或PDBA-glu。
当抗体的生成被用于筛选结合配偶体时，优选用共价连接于抗原巨分子载体的基团取代了其位置2或3的PABA或PABA-glu作为抗原，这种载体例如诸如破伤风毒素，匙孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)，或其它通常用于此目的的蛋白。产生此种抗原的一个优选的起始点是羟基和/或硝基取代的PABA或PABA-glu衍生物，例如2-羟基-4氨基苯甲酸，和2-羟基-4-硝基苯甲酸，3-羟基-4-氨基苯甲酸，3-羟基-4-硝基苯甲酸或其单谷氨酰胺化合物(monoglutamyl amides)等等。所述2-羟基基团易于和偶联剂反应，优选在诸如甲苯磺酰化的活化后。在偶联反应过程中，可能需要保护4-氨基基团(某些情况下还有一个或多个羧基基团)。可用于本发明的传统的保护基团如Fmoc，Boc或乙酰胺用于保护氨基，形成酯用于保护羧酸基团。
可选地，使用传统的化学技术可将与偶联剂反应的偶联基团或功能基团引入PABA或PABA-glu的2或3位置。需要将基团引入2位置时，优选使用对硝基苯甲酸或其单谷氨酰化合物并在引入2位取代基后将硝基还原成氨基(例如使用Li/H2)。
将PABA或PABA-glu连接到载体的基团优选提供连接二者的1到50个原子的桥，更优选5到20个原子的桥。桥的主链(backbone)原子可以是也可以不是不可变结构(例如芳香族环或脂肪族骨架结构(aliphaticcage))的一部分，例如用来保证PABA或PABA-glu残基的正确方向。
可用传统方式将2或3位取代的PABA或PABA-glu与载体偶联，例如使用末端为硫醇的2/3位取代物(例如以Cys残基为末端)和二硫化物或马来酰亚胺功能化的载体实现。
次优选的，可通过偶联抗原巨分子载体(例如蛋白)和PABA本身的羧基或氨基功能团或PABA-glu的氨基或一个羧基制备用于激发抗-PABA或抗-PABA-glu抗体的抗原。如果与氨基功能团相偶联，Fmoc保护的NHS-活化的氨基链烷酸(例如氨基丙酸)间隔基可与PABA或PABA-glu反应，去保护化后与载体蛋白偶联。可选地，与带有醛基的间隔基偶联的蛋白可与PABA或PABA-glu的氨基缩合形成抗原。进一步可选的是将异硫氰酸盐活化的氨基链烷酸间隔基和PABA或PABA-glu反应，或者将异硫氰酸盐活化的PABA或PABA-glu与氨基链烷酸间隔基反应，任选在第一次将间隔基与载体蛋白偶联之后。
结合偶合体优选是与基质结合的，例如与多孔网状结构(例如纤维素)或与聚合珠结合，尤其优选可收集的磁性珠(例如自Dynal AS，Oslo，Norway可得的磁性珠)。有了固定的结合偶合体，就可能在将基质与PABA或PABA-glu溶液一同温育后洗涤基质，从而除去样品中其它可能干扰测定PABA结合偶合体或PABA-glu结合偶合体的物质。这在样品含有血红蛋白且结合偶合体与PDBA或PDBA-glu反应形成偶氮化合物时尤其可取。可使用标准技术将结合偶合体偶联于基质。
在实施本发明的测定法时，通过使用强酸性介质，例如110℃下，使用6M盐酸6小时或在密封的容器中使用盐酸蒸气水解或使用4N甲磺酸可轻易将叶酸转化为PABA。在例如强盐酸(例如≥4M，优选≥5M，特别是≥6M)的酸性溶液中，可选地在和一种或多种蛋白酶初始温育后，使用例如过渡金属或其化合物，尤其是铂或铂化合物的金属催化剂可实现所需的水解。
在一个可选的，高度优选的实施方案中，在微波辐射的条件下实现叶酸酸解成PABA。该步骤可将水解所需时间降低5或更多倍，甚至可能超过25倍。
在进一步高度优选的实施方案中，可用诸如过氧化氢氧化之类的试剂进行氧化，和/或使用诸如硼氢化钠的还原剂进行处理，通过将样品中各种形式的叶酸转化成酸敏感的衍生物，极大提高各种形式的叶酸对酸性水解的敏感性。随后这些衍生物迅速降解成PABA或PABA-glu。优选，可连续使用还原和氧化方法。这种方法包括，例如用硼氢化钠处理样品，随后用过氧化氢和高锰酸钾氧化，最后降低PH值到约PH1，从而将各种形式的叶酸转化为酸敏感的叶酸衍生物，并使大多数或最优选所有叶酸的衍生物快速水解成单一形式的PABA或PABA-glu产物用于分析。
此外，通过氧化光解也可水解叶酸，尤其在诸如核黄素的光敏剂存在的条件下。此种方法形成进一步优选的实施方案，并可采用可见的红外光，或尤其是紫外光。这种光解的主要产物通常是PABA，PABA-gl和蝶啶-6-羧酸(PCA)。可通过上述方法或类似方法，例如PCA的免疫分析测定这些产物的任何一种并优选任何两种或所有三种产物。
通过用高强度光源照射样品实现叶酸的氧化光解，通常在约室温进行＞5分钟。光解的有效性主要有赖于溶解氧的存在，照射时间，光源强度和溶液中的温度和PH值。特定的添加剂例如核黄素作为光敏剂起作用并且显著增加光解产物的产量。因此高度优选使用此种光敏剂。优选低PH(即pH1-5，特别是pH2-4例如pH＝3)，但不是必要的。即使在PH6-9之间也可以完成该反应。快速氧化优选UV光线(例如波长约350nm或更短)但由于即使是使用可见光波长(即＞500nm)，氧化的发生也很快，因此不是必要的。
可直接对细胞溶解的样品或用酶预处理的样品进行氧化光解。叶酸的不同形式降解的主要产物均为PABA，PABA-glu和蝶啶-6-羧酸。尽管通过具有必要特异性的抗体使用免疫学方法可测定所有这些种类，优选检测PABA或PABA-glu，因为抗内源性化合物的抗体的交叉反应的危险性被最小化了。通过使用上述荧光偶氮技术可测定PABA和PABA-谷氨酸。
通过最初的蛋白水解也可使酸解更有利于使用者，例如单独使用诸如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶和羧肽酶A之类的酶或者使用两种或多种酶的组合物，可选地使用上述酶与诸如淀粉酶和接合酶之类的酶的进一步组合。随后通过上述的酸解或通过酶或金属催化降解可将释放的叶酸的形式转化为PABA。技术的这种结合可使得在数分钟之内，PABA从含有叶酸的样品中释放出来。
上述产生PABA的任何温和的蝶啶环分解方法，或这些方法的任何组合，可被简单修改以产生PABA-glu。具体而言，将血或来源于血的样品在约生理温度下温育短时间(例如10分钟到6小时，优选30分钟到3小时，最优选1到2小时)，通过天然存在的接合酶的作用，通常导致从各种叶酸中除去末端谷氨酸残基以外的所有谷氨酸残基。可选地，或此外，可使用包含诸如接合酶，蛋白酶和α-淀粉酶的成分的酶或酶混合物。在优选的实施例中，接合酶，蛋白酶和α-淀粉酶用作三酶混合物以加速谷氨酸残基的去除。这些酶再次使得最后的，末端谷氨酸残基以外的所有谷氨酸残基被去除。
通过这种方法，和随后进行的上述的蝶啶环分解，样品的各种叶酸被转化成单一种类(PABA-glu)。如上述，随后可通过用来检测PABA或其简单变体的方法分析这种单一形式的PABA-glu产物。因此PABA-glu的形成和分析在反映总体叶酸含量方面与在也去除谷氨酸残基的条件下形成的PABA的分析是等效的。
如果最后的谷氨酸在本发明优选的温和条件下被有利地去除，则可用诸如羧肽酶G2之类的酶在适合的条件下处理PABA-glu或其衍生物。可选地，该酶或其等价酶(equivalent enzyme)可被包括于上述用于去除其它谷氨酸残基的酶处理混合物中，通过该方法与蝶啶环的分解的组合产生PABA。
酸解产生PABA或PABA-glu后，如果结合配偶体是PH敏感的，可调节样品的PH(例如通过加入诸如氢氧化钠或缓冲液之类的碱)例如到接近PH7。
结合配偶体被固定在基质上的时候，随后将样品与基质接触，并进行温育使得PABA结合配偶体或PABA-glu结合配偶体的结合发生。可取地随后冲洗基质以便在估量PABA结合配偶体或PABA-glu结合配偶体组合物之前去除未结合的物质。这种情形中，优选使用第二种标记的结合配偶体，该标记的结合配偶体或者与PABA/PABA-glu结合配偶体复合物结合或者与未与PABA/PABA-glu结合的固定的结合配偶体结合。标记物的检测因此给出了PABA或PABA-glu浓度的直接或间接值。使用的标记物可以是诸如荧光团，发色团，放射性标记物等。
如果结合配偶体是芳族胺或苯酚，例如通过与亚硝酸钠和盐酸反应PABA首先被转化成PDBA，或PABA-glu被首先转化成PDBA-glu。随后将含有PDBA或PDBA-glu的样品与可能和基质结合或可能没有和基质结合的芳族胺或苯酚反应。芳香族胺或苯酚必须具有与氨基或羟基相邻或相对的未被取代的环位置，但可以在其他环位置或在氨基氮上可被取代，而且如下所述，这种取代可用来筛选通过与PABA或PABA-glu的反应形成的偶氮化合物的所需颜色或荧光波长，以及将胺或苯酚与基质相偶联。如果胺或苯酚是与基质结合的，将它们与含有PDBA或PDBA-glu的样品一同温育后，可冲洗基质以除去未结合的物质，并随后间接通过光谱学方法间接测定偶氮化合物的浓度。如果胺或苯酚没有与基质结合，也可通过光谱学方法间接测定偶氮化合物的浓度。但由于样品将含有血红素降解产物，在这种情况下优选选择胺或苯酚使得偶氮化合物可发出荧光或在来自血红素降解产物的“本底(background)”相对较小的波长下具有特征性的吸收值。
羟基和氨基，尤其是它们在偶氮键的邻位或对位时可增强偶氮化合物的颜色。可以在349nm下具有最大吸收值的对羟基偶氮苯(乙醇＝26300)和在408nm下具有最大吸收值的对二甲基氨基偶氮苯(乙醇＝27540)作为例证。与偶氮苯自身相比，这两种偶氮化合物吸收的波长较长且摩尔吸收率较高。
其中一个芳香环上的给电子体取代基与另一环上的夺电子基团偶联的偶氮化合物具有特别深的颜色。恰当的实例包括一组偶氮苯，其中与偶氮连接相邻或相对的一个环上的硝基被取代且另一个也和偶氮连接相对的环上的二烷基氨基基团被取代。这是由于这些化合物的一个共振贡献者具有醌型结构，该特征通常与偶氮化合物的深颜色相关。显示这种性质的化合物的实例是4-二甲氨基-4’-硝基苯，它在478nm下具有最大吸收，在该波长下，乙醇中的ε＝33110。
通常在芳香族的并含有具有高度共振稳定性的多重偶联双键的分子中可预期荧光。这两种物质均具有移位的π-电子，所述π-电子可被置于低能级的激发单重态(low-lying excited singlet states)。增加偶氮化合物的荧光的一种方法是阻止激发单重态通过分子内非辐射性跃迁而丢失能量，即将激发能量转化成分子内的振动运动。分子刚性通过减小振动降低竞争的非辐射性跃迁的可能性—这就使得发生系统间横越到三重态最小化和碰撞引起的热降解最小化。通过延伸4-二烷基氨基-4’-羧基偶氮苯中的第三个氨基基团的烷基链可清楚地说明这一点。许多短烷基链长度的偶氮苯实际上是没有荧光的，而长链(≥C3)的偶氮苯是有荧光的。而且，荧光强度随着氨基基团的烷基链的长度的增加而增加。然而，由于这种情形不可避免地增加了该化合物的疏水性，这些长链荧光偶氮化合物的降低的溶解性可能限制它们的使用。因此，尤其优选4-二(C3-6烷基)氨基-4′-羧基偶氮苯。
由于烷基链的降低的可变性是涉及荧光性质的关键因素，克服溶解性问题并进一步“固定”烷基链的一种方法是使用其中的烷基链形成稳定的环结构的芳香族胺。这种化合物的一个实例是久洛尼定(julolidine)。该结构被引入偶氮结构中，所述偶氮结构中氨基与偶氮键相对，从而极大降低了由于分子振动导致的激发能量的丢失，使得荧光增强。此外，将额外的苯基环加入偶氮化合物中，例如具有氨基和/或羟基取代基(萘酚/萘胺)的萘衍生物(或由更高级(order)稠合成的苯基环化合物)与PDBA或PDBA-glu的重氮基团反应时，可增强荧光。
通常，一系列有机化合物中最平面的，刚性的和空间上不拥挤的分子是最具有荧光性的分子。与金属离子形成螯合物通常也通过促进刚性和使内部震动最小化而增强荧光。因此，羟基或被取代的或未被取代的氨基优选包括在胺或苯酚中，在氨基或羟基基团之后的位置上。这些基团能够与金属离子配位。
这样的取代基极强地影响荧光。使π电子移位的取代基，例如-NH2，-OH，-OCH3，-F，-NHCH3或N(CH3)2基，通常增强荧光，而夺电子取代基，例如-Cl，-Br，-I，-NHCOCH3，-NO2或-COOH降低或完全淬灭荧光。
此外，如果系统PH的变化影响发色团的电荷状态，它可能也影响荧光。对比共振形式的阴离子和阳离子结构可解释这种改变。
增强偶联系统和/或产生醌型化合物结构的取代模式和偶联的环系统通常造成红移(bathochromic shift)，产生在光谱红色部分内的吸收带，可能与血红素降解产物的吸收带不同。认识到血红蛋白的水解将产生具有与天然血红素不同的吸收特性的血红素降解产物，而且这些化合物的大多数在光谱的蓝色部分内吸收可见光(并因此显示浅黄-褐色的颜色)是很重要的。与天然血红素的情况相比，由于血红素来源的发色团和重氮化合物之间的光谱交迭会被极大地降低，因此这显然是一种有利的情况。
结合配偶体既不与基质结合也不与芳香族胺或苯酚结合时，含有PABA或PABA-glu的样品期望与标记的结合配偶体首先温育，并随后与第二种与基质结合的结合配偶体反应，第二种结合配偶体能够结合PABA/PABA-glu结合配偶体复合物或游离的结合配偶体。随后根据需要冲洗基质以除去未结合的物质并随后检测与基质结合的标记物得到PABA或PABA-glu浓度的直接或间接值。
可选地，通过由PABA/PABA-glu结合配偶体复合物的形成导致的荧光偏振中的改变测定PABA或PABA-glu浓度，可使用未结合的荧光团标记的结合配偶体。然而，该荧光团仍优选具有特征性发射波长，在该波长下血红素降解产物具有最小的本底。
从进一步的方面看，本发明提供用于实施本发明的测定法的试剂盒，所述试剂盒包括a)叶酸水解试剂；b)可选的酶混合物；c)PABA，PABA-glu，PDBA或PDBA-glu结合配偶体；d)可选的[PABA到PDBA或PABA-glu到PDBA-glu]的转化试剂；和e)可选的第二结合配偶体。
本发明优选提供用于实施本发明的测定法的试剂盒，所述试剂盒包括a)叶酸水解试剂；b)PABA或PDBA结合配偶体；d)可选的[PABA到PDBA]的转化试剂；和e)可选的第二结合配偶体。
本发明的测定法优选与高半胱氨酸测定和/或全钴胺传递蛋白II(holo transcobalamin II)测定法一起实施，例如US-A-6063581，US-A-5631127，WO 00/40973，WO00/11479和WO 00/17659中所述的方法。
现在参考以下非限制性实施例进一步说明本发明实施例1叶酸到PABA的转化将200μl的全血样品与500μL的8.5M的盐酸在具有衬有特氟隆(Teflon lined)的螺丝帽的硼硅酸盐玻璃管中混合，并在110℃下温育6小时。
实施例2
PABA到PDBA的转化将实施例1中含有PABA的组合物冷却至室温，用500μl纯化水稀释后加样于C18固相提取管中。按1∶10v/v用水稀释无色的洗脱剂得到大约0.3M的盐酸浓度。按体积比2∶1(样品NaNO2溶液)加入亚硝酸钠水溶液(50mg/ml)并在4℃使混合物反应10分钟。
实施例3PDBA到重氮化合物的转化按32(PDBA溶液胺/苯酚溶液)的体积比将实施例2中的PDBA溶液与芳香族胺或苯酚溶液(4 mg/ml，在10mM磷酸盐缓冲水溶液，0.15M的NaCl中，pH值为7.4)混合，并使混合物反应30分钟。随后使用光谱测定法检测重氮化合物。
在该实施例中，通常使用以下的芳香族胺/苯酚N，N-二-n-丙基氨基苯；N，N-二-n-丁基-氨基苯；久洛尼定(julolidine)；苯酚；和2-羟基萘。
实施例4联合使用过氧化氢和PH将所有种类的叶酸分解成PABA-单谷氨酸1.加入25μL全血并使用皂苷(加至终浓度为100mg/L)或抗坏血酸(加入终浓度为1％的抗坏血酸)溶解细胞。37℃温育2小时使样品中存在的接合酶除去除了末端谷氨酸残基以外的所有谷氨酸残基。
2.使用分子筛(例如离心浓缩用的分子筛)从全血中除去无关分子而留下较纯的叶酸/结合蛋白复合物。
3.使用0.1％(终浓度)的DTT从结合蛋白中分离叶酸并煮沸15分钟或可选地加入DTT和0.15N(终浓度)的氢氧化钠并在37℃温育2.5分钟。
4.调节pH到6.0并加入硼氢化钠(6mg/ml)，在室温温育10分钟以减少叶酸。
5.使用HCl进行酸化以调节PH并破坏硼氢化物。
6.调节pH到9.0并加入过氧化氢和高锰酸钾(分别为0.015％H2O2和0.1％KMNO4)进行氧化，随后加入过量的过氧化氢(0.3％H2O2)以沉淀过量的高锰酸盐。以4000g离心10分钟除去被沉淀的MnO2。
7.加入过氧化氢酶(0.1％的过氧化氢酶到终浓度为当前H202的体积的1/3)以破坏过氧化氢。
8.用HCl降低pH到1，并在室温温育2小时以催化叶酸转化成PABA-glu。
9.调节样品的酸度到中性PH，并通过使用特异性的抗体或将PABA-glu转化成例如实施例3所述的发荧光的偶氮染料测定存在的PABA-glu的量。从标准曲线测定PABA-glu的量，所得的浓度反映样品中叶酸的总浓度。
实施例5非末端谷氨酸的加速去除对于实施例4，除了步骤1以外，加入额外的接合酶，诸如γ-Glu-X羧基肽酶；EC 3.4.19.9，或由接合酶，蛋白酶和淀粉酶形成的三酶混合物帮助促进叶酸的释放和转化以及加速反应。
实施例6联合使用过氧化氢和PH将所有种类的叶酸分解成PABA1.如实施例4和5的步骤1，但蛋白水解酶羧肽酶G2被单独使用或附加于实施例5中的酶中一同使用。该加入的酶造成所有谷氨酸残基从叶酸中的去除，从而导致PABA而不是PABA-glu的生成。
2.使用分子筛(例如离心浓缩的分子筛)去除全血中的无关分子，留下相当纯的叶酸/结合蛋白复合物。
3.使用0.1％(终浓度)的DTT从结合蛋白中分离叶酸并煮沸15分钟或可选地加入DTT和0.15N(终浓度)的氢氧化钠并在37℃温育2.5分钟。
4.调节pH到6.0并加入硼氢化钠(6mg/ml)，在室温温育10分钟以减少叶酸。
5.使用HCl进行酸化以调节PH并破坏硼氢化物。
6.调节pH到9.0并加入过氧化氢和高锰酸钾(分别为0.015％H2O2和0.1％KMNO4)进行氧化，随后加入过量的过氧化氢(0.3％H2O2)以沉淀过量的高锰酸盐。以4000g离心10分钟除去被沉淀的MnO2。
7.加入过氧化氢酶(0.1％过氧化氢酶，终浓度为已有H2O2的体积的1/3)以破坏过氧化氢。
8.用HCl降低pH到1，并在室温温育2小时以催化叶酸转化成PABA。
9.通过使用特异性抗体(首先将PH调整到最佳免疫反应的合适的PH，例如调整到PH7.0到8.5之间以后)进行免疫检测或者可选地通过将PABA转化成例如实施例3中所述的荧光偶氮染料来测定存在的PABA的量。从标准曲线测定PABA的量，所得的浓度反映样品中叶酸的总浓度。
实施例7利用氧化光解将各种叶酸转化成PABA光解，但不使用内源性酶1.使用皂角苷(加至终浓度为100mg/L)或抗坏血酸(加入终浓度为1％的抗坏血酸)溶解细胞，并在37℃温育1小时。
2.同实施例4的第二步。
3.同实施例4的第三步。
4.用UV光源在室温照射样品10分钟。主要的光解产物是PABA，PABA-glu和蝶啶-6-羧酸，它们都反映了样品中叶酸的起始总浓度。
5.通过使用特异性抗体(首先将PH调整到最佳免疫反应的合适的PH，例如调整到PH7.0到8.5之间以后)进行免疫检测或者可选地通过将PABA转化成例如实施例3中所述的荧光偶氮染料来测定存在的PABA或PABA-glu的量。从按包含血液样品中的叶酸的浓度范围的适当标准所做的标准曲线测定样品中PABA或PABA-glu的量。
权利要求
1.测定含有叶酸的样品中的叶酸的方法，其中至少部分所述叶酸包含至少一个附着的谷氨酸残基。所述方法包括以下步骤对所述样品进行水解以释放对氨基苯甲酸，p-氨基苯甲酰谷氨酸或其盐；使所释放的对氨基苯甲酸，p-氨基苯甲酰谷氨酸，其盐或其重氮衍生物与其结合配偶体反应；并直接或间接地测定产生的结合配偶体对氨基苯甲酸，结合配偶体p-氨基苯甲酰谷氨酸，或盐或衍生物的结合物。
2.权利要求1要求的方法，其中所述方法不包括任何层析分离步骤。
3.权利要求1或2要求的方法，其中所述样品是来自血液的样品。
4.权利要求1到3中任一项要求的方法，其中所述结合配偶体选自以下物质抗体，抗体片段，单链抗体，单链抗体片段，寡肽，寡核苷酸或小的有机分子。
5.权利要求5要求的方法，其中所述小的有机分子是芳香族叔胺，苯酚或能够与对重氮苯甲酸(PDBA)或对重氮苯甲酰谷氨酸(PDBA-glu)形成重氮化合物的苯酚衍生物。
6.权利要求1到5中任一项要求的方法，其中所述水解包括在酸性条件下用金属催化剂处理所述样品。
7.权利要求1到6中任一项要求的方法，其中所述水解包括用微波射线处理所述样品。
8.权利要求1到7中的任一项要求的方法，其中所述水解包括使用氧化剂处理。
9.权利要求8要求的方法，其中的氧化剂是过氧化氢和/或高锰酸钾。
10.权利要求1到9中任一项要求的方法，其中所述水解包括使用还原剂处理。
11.权利要求10要求的方法，其中所述还原剂是硼氢化钠。
12.权利要求1到11中的任一项要求的方法，其中所述水解包括氧化光解。
13.权利要求12要求的方法，其中所述氧化光解在光敏剂存在的条件下进行。
14.权利要求1到13中的任一项要求的方法，其中在天然存在的酶和/或添加的酶存在的条件下温育所述样品，从而从所述叶酸中除去末端谷氨酸残基以外的所有谷氨酸残基，且其中的水解产物是PABA-glu。
15.权利要求1到13中的任一项要求的方法，其中在存在至少一种添加的酶的条件下温育所述样品，从而从所述叶酸中除去所有的谷氨酸残基，且其中水解的产物是PABA。
16.权利要求1到15中的任一项要求的方法，其中通过吸收或荧光直接测定所述结合配偶体对氨基苯甲酸，结合配偶体p-氨基苯甲酰谷氨酸，或盐或衍生物的结合物。
17.权利要求1到15中的任一项要求的方法，其中通过第二结合配偶体间接测定所述结合配偶体对氨基苯甲酸，结合配偶体p-氨基苯甲酰谷氨酸，或盐或衍生物的结合物。
18.用于实施本发明测定法的试剂盒，所述试剂盒包括i)叶酸水解试剂；和ii)PABA，PABA-glu，PDBA或PDBA-glu结合配偶体。
19.权利要求18要求的试剂盒，还包括酶或酶混合物。
20.权利要求18或权利要求19要求的试剂盒，还包括PABA到PDBA或PABA-glu到PDBA-glu的转化剂。
21.权利要求18到20中的任一项要求的试剂盒，还包括第二结合配偶体。
全文摘要
本发明涉及测定含有叶酸的样品中的叶酸的方法，其中至少部分叶酸包含至少一个附着的谷氨酸残基。该方法包括以下步骤对所述样品进行水解以释放对氨基苯甲酸，p－氨基苯甲酰谷氨酸或其盐；使所释放的对氨基苯甲酸，p－氨基苯甲酰谷氨酸，其盐或其重氮衍生物与其结合配偶体接触；并直接或间接地检测产生的结合配偶体对氨基苯甲酸，结合配偶体p－氨基苯甲酰谷氨酸，或盐或衍生的组合物。本发明进一步涉及用于本发明的方法中的试剂盒。
文档编号G01N33/82GK1625688SQ03802993
公开日2005年6月8日 申请日期2003年2月6日 优先权日2002年2月6日
发明者弗兰克·弗兰岑 申请人:阿克西斯-希尔德公司