分离方法及执行该方法的仪器的制作方法

专利名称：分离方法及执行该方法的仪器的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及从溶液中分离载体的一种方法，所述载体适于承载吸附在其上的生物分子，特别是，涉及用来进行遗传材料的单链样品的制备而进行分离的一种方法。本发明还涉及一种执行所述方法的仪器。最后，本发明还涉及一种适合于连接在这种仪器上的一次性单元。
背景技术：
分析遗传材料的方法经常需要将核酸的样品放大作为最初的步骤。这样，有时就需要分离双链DNA样品(dsDNA)中的两链的步骤。在进行这些步骤时，要使用一种聚合酶链反应(PCR)的相关技术方法。根据该方法的一种变化形式，通过向一个存放着容纳dsDNA样品溶液的容器提供一个其中之一为生物素的基本对而放大dsDNA样品。然后将涂有珠粒的抗生蛋白链菌素加入溶液中，再通过加入一种结合缓冲剂将该放大的dsDNA固定在珠粒上。
这些珠粒可以由琼脂糖制成，一种用来制备单链DNA(ssDNA)的相关技术的方法如下所述首先，将存放固定的dsDNA的容器放在一个真空场所。容器的底部设有一个过滤器，该过滤器的孔径小于琼脂糖珠粒的尺寸。因此，当在过滤器的下面施加一个负压时，溶液中的珠粒将留在过滤器上，而溶液通过过滤器排空，例如排入液体收集器。在下一个步骤，向容器中提供将dsDNA链分离为ssDNA的氢氧化钠，随后将氢氧化钠排空。因此，没有结合在珠粒上的ssDNA链也被排出，而结合在珠粒上的ssDNA链保留在过滤器上。在接下来的步骤中，通过添加一次或多次洗涤缓冲剂来中和剩余的氢氧化钠，在最后的步骤中，将负压力去掉，在溶液中添加用来再次悬浮过滤出来的珠粒的溶液。现在附有ssDNA链的珠粒即将从该容器中被移动到另一个用于进一步的制备或进行ssDNA分析的容器中。
然而，很难完全地再次悬浮溶液中所有的珠粒，这是因为珠粒在过滤器中过滤，并且尽管进行再次悬浮的尝试，仍很容易附着在其上。因此，试图用移液管来取得所有的珠粒是很难的。此外，当孔中液柱的高度很低时，很难进行移液，使情况变得更差。再者，容器通常为多孔容器形状，例如微量滴定板(MTP)，具有例如96，384，1536或6144分离孔，因此从应变损坏点的观点来看，重复性的移液是不利的。
在GB99 233 249中所披露的另一种相关技术方法中使用了磁性珠粒代替了琼脂糖珠粒。根据该方法，将一个磁体引入容器中，例如MTP池中，由此该磁体吸引并粘附涂有磁性珠粒的抗生蛋白链菌素。因此，可以将磁性珠粒及结合的dsDNA从该容器中移走并移到另一个容器中，在该另一个容器中容纳着链的分离溶液，例如氢氧化钠。从而，将dsDNA分离为ssDNA，因此第一链悬浮在溶液中并可以选择性地将其排空，而第二链结合在珠粒上。现在可以将这些第二链转移到另一个容器中用于进一步的制备或分析。
然而，磁性珠粒比琼脂糖珠粒更昂贵，并且琼脂糖珠粒的使用在通过合成方法进行序列的测定中还产生了更好的质量。
再者，在US6 156 550中所披露的另一种相关技术方法涉及将珠粒从一种溶液转移到另一种溶液中。这种方法描述了琼脂糖珠粒如何被附着在聚合体的表面上。珠粒结合在支撑物上的缺陷是，结合在表面上的珠粒不能象溶液中的珠粒那样表现出生物化学性或物理性，因此进一步ssDNA的分析将很困难。
在JP 58223759中所披露的另一种相关技术方法中，将珠粒移动到两个试管之间。喷嘴16浸入第一试管17中，在其中，通过真空来吸引珠粒B。然后，将喷嘴16移动到第二试管18中，在第二试管中，施加一个反压力，从而释放第二试管中的珠粒B。在整个移动的过程中，在喷嘴内为真空。然而，喷嘴只能移动大的珠粒，这些大的珠粒被吸引并粘附在喷嘴的尖端。如果是小的珠粒，这些小的珠粒就会和容纳在试管中的液体一起被排出。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种改进的方法，用来分离载体例如从溶液中分离琼脂糖珠粒，所述珠粒作为生物分子的载体而起作用。
该目的可以通过本发明从溶液中分离载体的方法而实现，所述载体适于承载生物分子，例如附着在其上的DNA，RNA，蛋白质，多肽或碳水化合物，其中，该方法包括将管状元件插入容纳所述载体的溶液的容器中；将管状元件的末端浸入溶液中；吸引所述载体并将其保持在所述末端；将所述管状元件和保持的载体一起从溶液中去掉。该方法的特征在于，所述吸引和保持的步骤包括在管状元件中提供负压力的步骤，从而能将该载体吸引和保持到设置于管状元件末端上的过滤器上。
该目的还可以通过在不同的容器之间移动载体的仪器而实现，所述载体适于承载生物分子，例如附着在其上的DNA，RNA，蛋白质，多肽或碳水化合物，其中，该仪器包括至少一个被插入到容器中的管状元件，该容器含有容纳所述载体的溶液，所述管状元件具有一个浸入溶液中的末端；以及将所述载体吸引并附着在所述末端的装置。该仪器的特征在于，所述装置包括设置在末端的过滤器。
该目的还可以通过由双链DNA(dsDNA)中制备单链DNA(ssDNA)的方法，该方法包括将两个所述dsDNA链中的一个固定在含有第一溶液的第一容器中的载体上，其中溶液含有所述载体所述dsDNA；将所述载体吸引并附着在浸入第一溶液中的管状元件中；将所述管状元件和所附着的载体一起从第一容器移动到第二容器；在第二容器中将dsDNA分离为ssDNA；将管状元件从第二容器中移走，从而将载体和固化的ssDNA从第二容器中移走。该方法的特征在于，所述吸引和附着的步骤包括在管状元件中提供一个负压力的步骤，从而能将载体吸引并附着在设置于管状元件中的过滤器中。
该目的还可以通过适合连接在一个仪器的管状元件上的一次性单元而实现，所述仪器是按照权利要求9的前序部分而制造的，其中，所述一次性单元由容纳所述载体的过滤器所提供。
通过这种方法和仪器，载体例如涂有珠粒的抗生蛋白链菌素可以在含有不同溶液的容器中转移出来。因此，与相关技术中的琼脂糖方法相比，制备例如ssDNA的整个过程或其他手工样品的制备就得到简化，并使用更少的劳动力，而且由于可以避免使用磁性珠粒而使成本降低。当然也可能将磁性珠粒和本发明的方法与仪器一起使用，而磁性珠粒起着生物分子的载体的作用。
相应地，所述方法包括通过在管状元件中去掉负压力或产生一个过压力将所述载体从过滤器上释放的步骤。因此，从过滤器中释放载体的步骤得到改善。
有利地，每个前述步骤可以在多个位置同时进行。因此，该方法适合与多孔容器一起使用，例如具有96，384，1536或6144孔的微量滴定板(MTR)。
优选地，该方法用于净化蛋白质，较佳地，用于净化经标记的蛋白质，最优为，用于净化His标记的蛋白质。因此，多孔形式的净化能够应用于蛋白质产品的细菌重组体的筛分。
相应地，所述仪器包括一个壳体，该壳体具有一个连接在一个真空源上的密封的内部空腔，所述真空源用来在内部空腔中产生一个负压力，其中，管状元件与所述内部空腔保持液体流通，更相应的，管状元件伸入内部空腔中。由于其伸入空腔中，如果将负压力从内部空腔中去掉，溶液将不产生回流，其中所述内部空腔防止不同溶液的混合。
优选地，该仪器包括多个管状元件，所述管状元件具有与多孔容器的配置相应的交互配置。因此，该装置可以和微量滴定板(MTP)一起使用。
有利地，所有的管状元件在一个单独的支撑元件中整体制成，该支撑元件可以从壳体中分离。因此，可以提供一个一次性的单元。此外，能够简化管和过滤器的清洗工作。
相应地，该仪器包括用于在内部空腔中产生过压力的装置。因此，可以方便地进行释放在过滤器中所收集的载体。
优选地，该仪器包括用于控制负压力和/或过压力的装置。因此，可以实现不同装置的适应性。
有利地，该方法和/或装置用于自动机器人系统中。因此，由于需要很少的人工干预而使性能得到改善。因此，机械臂可以运行该仪器，从而在自动和没有人工控制的情况下，可以在溶液和/或孔之间转移载体。在这一方面，也可以通过摇晃、振动或刮削来执行释放步骤，从而在去掉负压力之后能够从过滤器中释放载体。


现在参考附图对本发明的优选实施方式进行描述，其中图1a示出了根据本发明优选实施方式的仪器的立体图。
图1b示出了图1a中的仪器的分解图。
图2a示出了该仪器的俯视图。
图2b示出了该仪器将顶盖去掉后的俯视图。
图2c示出了沿图2a中的截面B-B剖开的视图。
图2d示出了沿图2a中的截面C-C剖开的视图。
图3示出了根据本发明的另一个方面的一次性单元的主视图，以及图4a-b示出了洗脱的蛋白质的SDS-PAGE的分析，其中图4a示出了CBB染色，图4b示出了银染色。
具体实施例方式
图1a-b示出了根据本发明的一个优选实施例的仪器10的立体图。该仪器包括一个顶盖1和一个底板3，顶盖1和底板3一起形成了壳体5。在顶盖和底板之间设置密封件7。导管9的一端通过联接器11连接在壳体上，在另一端可以连接在真空源、液体分离装置和/或压力源上(图中未示出)。呈管状件13形式的多个细长的管状元件的每一个都连接在设置在底板3的下侧17上的孔15上。密封环19上设有用来密封管状件13的开口。该管状件13相应于多孔容器例如微量滴定板(MTP)的孔的结构而以平行的行和列配置。支撑板21通过螺钉22连接在底板的下侧，其中支撑板上设有多个与管状件相应的孔23，并且所述孔23与底板上的孔对齐。过滤器25设置在每个管状件13的末端的横截面上。
如图2c所示，当顶盖1和底板3装配在一起时，在顶盖1和底板3之间产生一个内部空腔27。该内部空腔与导管9通过设置在壳体壁部的凹槽29保持液体连通，因此也和例如前述的真空源保持流体连通。底板的孔15延伸到内部空腔中，因此每个管状件与内部空腔保持流体连通(其中一个管状件如图2c所示)。如图2b-c所示，每个管状件还伸入内部空腔中一个很短的距离，因此形成烟囱状的凸起31。
操作该仪器的操作将只是通过一个例子进行描述，该例子解释了通常包括50-2000个核苷酸的单链DNA样品的制备。然而，本领域的普通技术人员会明白该仪器不仅限于这种器具，而是可以用在很多器具中，其中，生物分子的载体需要从溶液中分离出来或在不同的容器之间移动。作为一个例子，即使在上述的例子中使用抗生物素蛋白链菌素-生物素作为结合分子对，也可以使用其他的结合分子。
在该例子中，设有多孔容器，例如MTP(图中未示出)，在该容器中，每个孔都具有容纳了放大的双链DNA的样品的溶液，所述双链DNA的样品固定在珠粒上，例如涂有琼脂糖珠粒的抗生物素蛋白链菌素。将仪器10放置在MTP上，随后被降低，因此该仪器的管状件13被插入MTP的孔中，然后再浸入溶液中。启动真空源，由此在壳体5的内部空腔27中提供负压力，因此也在过滤器25的第一侧上的每个管状件上提供负压力。通过选择一个合适的负压力，将溶液吸入管状件中并通过过滤器25。溶液进入内部空腔中，随后从导管9排到液体分离装置中。带有固定珠粒的载体也朝着过滤器方向排出，但是被保持在过滤器的第二侧上，亦即与第一侧相对的方向上，而溶液通过过滤器排出。虽然可以使用其他材料，但是优选地，过滤器由烧结材料制成，例如烧结的聚丙烯塑料，并且当珠粒由直径约为38μm的琼脂糖制成时，过滤器孔的直径要求大约为10μm。
现在该仪器10可以被提高，并保持有负压力，因此将具有附着在过滤器上的载体的管状体去掉。将该仪器移动到另一个容器中，该容器中还含有一种溶液，溶液中具有一种链的分离溶液，例如含有氢氧化钠。因此，当管状体浸入到溶液中时，dsDNA将分离为ssDNA，因而第一链悬浮在溶液中，而第二链保留结合在珠粒上。然后将该仪器移动到另一个MTP中，其中每个孔中仍含有溶液。将管状体浸入孔的溶液中，使真空源停止，因此载体从过滤器中释放出来，然后再次悬浮在溶液中。当真空源停止时，烟囱状凸起31的作用是防止容纳在内部空腔中的溶液回流到容器中。否则该回流的流体有使存在于后来的容器中的溶液发生污染的风险。
为了便于悬浮，该过滤器可以刮擦到孔的底部。也可以将该仪器摇晃或振动以进一步地提高载体的释放。在另一种情况下，可以启动压力源，由此在壳体的内部空腔中设有过压力，因此也在每个过滤器的第一侧作用过压力。通过从过滤器的一个喷吹的动作，而且是通过在溶液中产生涡旋运动，压力的复原将使载体从过滤器的第二侧的释放得到进一步的提高，因此过滤器会有一个清洗效果。当载体悬浮在溶液中时，压力源停止，将该仪器提高因而将管状体从孔中去掉。现在，ssDNA的制备完成了，可以开始分析容纳在溶液中的ssDNA了。这种分析可以分别如专利US5 405 746和WO98/13523中所描述的那样测定序列或通过合成方法进行序列的测定。
使用完该仪器之后，就需要进行过滤器的清洗了。即使将该仪器分解开以完全地清洗该仪器，也只是将管状体浸入水或乙醇中，从而冲洗过滤器。为了进一步改善清洗效果，可以启动真空源和/或压力源。在这种情况下，可以进行负压力和过压力之间的替换，这将改善清洗效果。
当然也可以用一体制成的管状体和过滤器设计支撑板，从而产生一个一次性的元件，当使用完该一次性单元后，可以将其丢弃。如果需要的话，这种元件可以很容易替换。
也可以将过滤器从每个管状体的最远端移动一个短距离。因此，如果溶液具有很高的载体密度，或在每个孔中产生很高的液柱，就可以增加容纳载体的容量。
也可通过用超声进行处理，例如将其放置在超声波水槽中，而将载体从管状元件中的过滤器上移走。这样，在下一步的使用之前将清洗管状元件和过滤器。
再者，也可以向管状元件13提供一次性的尖端元件50。该元件如图3所示，并且该元件具有连接在管状元件13上的第一端52和浸入容器的溶液中的第二端54。单元50具有一个逐渐变细的形状，并设有用于存放前述载体的过滤器25，因此不必给管状元件自身提供过滤器。当使用后，这些元件可以随意处置，通常将其丢弃。
实验也进行了一项研究，该研究的目的是研究是否可能从细菌溶解产物中提纯His标记的蛋白质(HisKlenow)，同时具有良好的选择性和产量。在下面的描述中，只是以通常的方式对根据本发明的仪器的使用进行描述，并且只是作为本发明仪器的参考。然而结合上述具体实施方式
部分和操作部分，本领域的普通技术人员可以理解在His标记的蛋白质的净化过程中如何借助于本发明的仪器，执行单个的步骤。
His-Klenow是DNA聚合酶的克列诺(Klenow)片段，其中具有添加了N末端的6-组氨酸(hexa-Histidine)。为了生产的目的，蛋白质在大肠杆菌中过量表达。所引入的修正有可能通过固化的金属亲和性层析法(IMAC)来提纯蛋白质，并使用可通过商业上得到的基体。该过程包括将蛋白质附着在固化的Ni2+离子上，将未结合的物质冲洗除去，以及最后洗脱出来结合的蛋白质和包含0.2M咪唑的缓冲剂。
本研究是通过采用相关工艺方法将His-Klenow层析法提纯为本发明仪器的形式而完成的。由于建立了所有的关键参数，例如结合和洗脱特性，因而不必对此进行进一步的研究。唯一的变量是加入每个孔中的凝胶量，这是因为怀疑该变量会影响回收率(recovery)。
材料HiTrap螯合柱(1ml) Amersham Biosciences裂解产物His-Klenow第1012批PCR-板，96-孔 MilliporeNaH2PO4MerckNaClMerck咪唑USB本发明仪器 PyrosequencingPhast电泳设备 Amersham BiosciencesPhast 10-15％凝胶 Amersham BiosciencesSDS缓冲剂带 Amersham Biosciences低分子重量标定工具箱 Amersham BiosciencesCommassie亮蓝染色剂 Amersham BiosciencesPhast银染色剂工具箱 Amersham BiosciencesEDTA(乙二胺四乙酸) Merck去离子水NiCl2x6(H2O) Sigma缓冲型结合和冲洗缓冲剂10mM NaPi，0,5M NaCl，10mM 咪唑，Ph7,4洗脱缓冲剂10mM NaPi，0,5M NaCl，0,2M 咪唑，Ph7,4凝胶准备按照制造商所提供的用法说明可以完成凝胶的准备。
1.用50mM的EDTA冲洗柱，2ml2.用水冲洗，5ml
3.加入0,1M的NiCl2，2ml4.用水冲洗，5ml5.用结合缓冲剂冲洗，5ml随后打开柱，回收凝胶并通过添加结合缓冲剂制成50％的浆液。
SDS-PAGE和染色SDS-PAGE方法SDS10-15CBB染色方法SDS银染色方法Ag这些方法参照Phast电泳设备中的方法。
使用本发明仪器提纯1.向PCR-板(柱A)上的7个孔分配25μl裂解产物2.向每个孔添加25μl结合缓冲剂3.分别向A-G孔添加10，5，4，3，2，1和0,5μl的凝胶浆液4.将板放在摇床上培养5分钟5.使用本发明仪器从所使用的孔中吸出凝胶6.通过移动本发明仪器通过含有结合缓冲剂对凝胶冲洗10-20秒7.通过将本发明的仪器移动到一个新的含有50μl洗脱缓冲剂的PCR板上，洗脱掉已结合的蛋白质8.从每个用于分析的孔上撤回样本。原始材料的样本，亦即裂解产物也同时获得9.完成SDS-PAGE后使用CBB或者进行银染色结果SDS-PAGE分析结果显示Hisklenow与凝胶结合，并且能够通过使用洗脱缓冲剂处理进行回收，见图4a-b。这两幅图经过处理以提高扫描图像的可见度。数字表示加入每个孔内的凝胶(50％的浆液)体积(μl)。“lys”表示原始材料。
讨论在最初的实验中，使用常用的96孔板进行结合和洗脱，这种板具有更大的孔。这个实验清楚地显示没有很多凝胶可以从这些更宽的孔中吸出，因为在干燥后的孔内可以明显地看到剩余的凝胶。
随后的实验是在所添加的凝胶体积同时变化的一个PCR板上进行的。正如可以在图4a-b中看到，回收率得到提高而添加的凝胶量得以降低(见图4a，CBB染色)。这可能是当使用较少量的凝胶时，凝胶的回收部分较大的一种反映，从而导致回收更多的蛋白质。因此在本实验中凝胶的结合能力似乎不是一个问题。
与原始材料相比，由于在所洗脱的部分中没有发现杂质，因此提纯的效率是非常高的，(见图4b，银染色)。
结论本发明的仪器可以成功地用于从复杂的混合物中分离出蛋白质，此处指的是细菌溶解产物。在本研究中，使用与金属亲和性凝胶结合的His标记的蛋白质作为典型，但是这种原理也可用于其它系统，例如一种亲和性凝胶，或者蛋白质-蛋白质，或者相互作用的受体和配体。
本应用系统没有进行任何优化，有理由认为关于回收率和速度都可以进一步提高。
权利要求
1.一种用来从溶液中分离载体的方法，所述载体适于承载生物分子，例如附着在其上的DNA、RNA、蛋白质、多肽或碳水化合物，其中该方法包括以下步骤将管状元件(13)引入装有容纳所述载体的溶液的容器；将管状元件的末端浸入溶液中；将所述载体吸引并保持在所述端部；将所述管状元件和所保持的载体一起从溶液中去掉；其特征在于，所述吸引并保持的步骤包括以下步骤在管状元件中设有一个负压力，从而将所述载体吸引并保持在设置于管状元件的末端的过滤器(25)。
2.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤通过将管状元件中的负压力去掉或在管状元件中产生一个过压力，而将所述载体从过滤器中释放。
3.如权利要求1或2所述的方法，还包括以下步骤通过摇晃，将所述载体从过滤器中释放。
4.如权利要求1-3的任一项所述的方法，还包括以下步骤通过刮削，将所述载体从过滤器中释放。
5.如前述权利要求的任一项所述的方法，在多个位置上同时进行每个步骤。
6.如前述权利要求的任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用来提纯蛋白质。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法用来提纯经标记的蛋白质。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法用来提纯His标记的蛋白质。
9.一种用来在不同的容器之间移动载体的仪器，所述载体适于承载生物分子，例如附着在其上的DNA、RNA、蛋白质、多肽或碳水化合物，其中该仪器包括至少一个引入容器中的管状元件(13)，该容器装有容纳所述载体的溶液，所述管状元件具有浸入溶液中的端部；将所述载体吸引并保持在所述端部的装置；其特征在于，所述装置包括一个设置在端部的过滤器(25)。
10.如权利要求9所述的仪器，还包括一个壳体(5)，所述壳体(5)具有一个密封的内部空腔(27)，内部空腔(27)与用来给内部空腔提供负压力的真空源相连接，其中管状元件与所述内部空腔保持液体连通。
11.如权利要求10所述的仪器，其特征在于，管状元件伸入内部空腔中。
12.如权利要求9-11的任一项所述的仪器，还包括多个管状元件，所述管状元件具有与多孔容器例如微量滴定板的结构相应的交互配置。
13.如权利要求12所述的仪器，其特征在于，所有的管状元件都在一个单独的支撑元件(23)中一体制成，所述支撑元件可以从壳体中拆卸下来。
14.如权利要求9-13的任一项所述的仪器，还包括在内部空腔中产生一个过压力的装置。
15.如权利要求9-14的任一项所述的仪器，还包括用来控制负压力和/或过压力的装置。
16.如权利要求9-15的任一项所述的仪器，其特征在于，过滤器由烧结材料制成。
17.如权利要求9-16的任一项所述的仪器，其特征在于，过滤器由烧结聚丙烯塑料制成。
18.一种从双链DNA(dsDNA)中制备单链DNA(ssDNA)的方法，包括以下步骤将所述dsDNA的两链中的一链固定在装有第一溶液的第一容器中的载体上，其中，所述溶液容纳有所述载体和所述dsDNA；将所述载体吸引并保持在浸入第一溶液中的管状元件(13)中；将所述管状元件和所保持的载体从第一容器移动到第二容器中；在第二容器中将dsDNA分离成ssDNA；将管状元件从第二容器去掉，因此将载体和固化的ssDNA从第二容器中去掉，其特征在于，所述吸引和保持步骤包括以下步骤在管状元件中设有负压力，从而将载体吸引并保持在设置于管状元件中的过滤器(25)中。
19.如权利要求18所述的方法，在多个位置同时执行每个步骤。
20.适于连接在根据权利要求9的前序部分所述的仪器的管状元件的一次性单元，其特征在于，所述一次性单元上设有用于保持所述载体的过滤器(25)。
21.根据权利要求1-8和/或18-19的任一项所述的方法和/或根据权利要求9-17的任一项所述的仪器，其被用在一个自动的机器人系统中。
全文摘要
本发明涉及一种从溶液中分离载体的方法，所述载体适于承载生物分子，例如附着在其上的DNA、RNA、蛋白质、多肽或碳水化合物。该方法包括以下步骤将管状元件(13)引入装有容纳所述载体的溶液的容器；将管状元件的末端浸入溶液中；将所述载体吸引并附着在所述末端；以及将所述管状元件和所附着的载体一起从溶液中去掉。该方法的特征在于，所述吸引并附着的步骤包括在管状元件中设置一个负压力的步骤，从而将所述载体吸引并附着在设置于管状元件的末端的过滤器(25)。本发明还涉及执行这种方法的仪器(10)。
文档编号G01N33/543GK1628171SQ03803205
公开日2005年6月15日 申请日期2003年2月12日 优先权日2002年2月12日
发明者安德斯·阿尔德波恩, 戴维·彼得森, 安娜－洛塔·席勒, 比约恩·英厄马松 申请人:碧奥塔格股份公司