专利名称：个体化用药基因型检测试剂盒及其应用方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域，涉及一种个体化用药基因型检测试剂盒及其应用方法。
背景技术：
药物疗效和不良反应的个体差异是目前药物治疗过程中的普遍现象。遗传药理学和药物基因组学的研究进展表明药物代谢酶、转运体和受体(药物作用靶点)的遗传变异是造成个体药物反应差异的主要原因。如细胞色素氧化酶CYP2D6发生基因突变，在相同剂量条件下，其所介导代谢的β受体阻滞剂在突变型纯合子中的血药浓度比野生型纯合子高2-3倍，如不根据基因型调整剂量，突变型纯合子患者可能发生严重的毒副反应；相反，如果β受体发生功能性突变，在突变型纯合子个体中依然使用β受体阻滞药，往往会导致治疗失败，这不仅延误治疗，而且导致了医疗资源的浪费。因此，根据个体与药物治疗相关的代谢酶、转运体和受体的遗传变异制定不同的治疗方案，实现药物治疗个体化不仅是当今遗传药理学和临床药物治疗学的发展方向，而且具有十分重要的社会意义和经济意义。
要实现根据病患者基因型来指导对个体化用药，就必须首先测试病患者的基因变异情况。目前有多种方法可用于检测基因型，如测序、基因芯片、荧光PCR等。这些方法各有其优缺点。国内外用于实验室的基因分型技术多为测序、荧光PCR、基因芯片等，这些检测方法分别有价格昂贵、检测速度慢、技术稳定性和结果可靠性较差、操作复杂等缺点，不易推广到临床应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对临床上药物治疗的个体差异十分普遍，而个体化的药物治疗方案难以确定的状况及现有技术中的不足之处，提供一种检测个体药物代谢与效应相关基因的基因型的个体化用药基因型检测试剂盒及其应用方法。
解决本发明技术问题所采用的技术方案是该个体化用药基因型检测试剂盒含有1、DNA抽提试剂，推荐使用Takara公司的DNA抽提试剂盒，2、PCR试剂，其中包括的引物有正向引物和反向引物，PCR试剂中的正向引物和反向引物能使PCR的扩增产物含有药物代谢及效应相关基因突变位点的基因片断，这些突变位点是在人群中的发生频率较高，与临床上针对某些疾病的药物的个体差异关系密切，且对这些药物的药代动力学或药效有明显影响、有应用价值的突变位点(下向和反向引物扩增含有药物代谢及效应相关的基因突变位点的DNA序列，根据药物基因组学的研究结果，这些突变位点在人群中的发生率较高，且对某些疾病的临床常用药的药代动力学或药效有明显影响，基因突变位点的确定是根据临床上对某些疾病的常用药查找与其药效的个体差异关系密切，发生频率比较高、有应用价值的突变位点)，还包括双蒸水(ddH2O)、Taq酶、Taq酶附带的PCR缓冲液、dNTP、MgCl2溶液；3、酶切试剂，包括内切酶、酶切缓冲液；4、电泳试剂，包括琼脂糖、溴乙锭、加样缓冲液5、标准品，包括野生型质粒DNA、突变型质粒DNA。
本试剂盒采用的是PCR-RFLP(聚合酶链式反应与限制性酶切片段长度多态性)方法。采用本试剂盒的实验技术检测基因型具有稳定、可靠、价格便宜、较快速的优点。适于推广到临床使用。
应用本发明个体化用药基因型检测试剂盒检测患者基因型的方法，其特征是取患者外周血1～2ml，使用试剂盒中的DNA抽提试剂提取DNA，用试剂盒中的PCR试剂进行PCR扩增，用试剂盒中的酶切试剂作限制性内切酶消化，再用试剂盒中的电泳试剂进行凝胶电泳分析，之后判读基因型，提供个体化用药指导意见。
利用本发明试剂盒和检测患者基因型的方法能根据所检测的各种疾病患者基因型指导临床个体化用药，降低药物不良反应发生率，减少患者调整用药方案的次数，从而大大减轻患者的痛苦和经济负担。
图1为使用本发明个体化用药基因型检测试剂盒检测患者基因型的方法流程图具体实施方式
下面以溃疡病个体化药物治疗基因型检测试剂盒为实施例对本发明作进一步的详细描述。
消化性溃疡是一种常见病，多发生在胃或十二指肠球部，统称为“溃疡病”。溃疡病多见于青壮年，或者生活节奏紧张，饮食不规律的人，约百分之八十的患者发病年龄在40岁以下，而这个年龄正处于精力充沛的阶段，因此，溃疡病的防治对于人们和社会都有重要的意义。根据大量统计数字，溃疡病是引起上消化道出血最常见的疾病。中国人群中溃疡病患病率为5～10％(男女患病率比例为3.6∶1)。溃疡病的发病率呈上升趋势。保守估计，我国溃疡病患者人数超过了6千万。减少胃酸分泌和抗幽门螺旋杆菌感染是目前和今后相当长时间内治疗溃疡病的主要途径。拉唑类药物具有强大的抑制胃酸分泌作用，在治疗溃疡病的药物中占有重要的位置。据统计，奥美拉唑可使90％的难治性溃疡(病程经12周尚未治愈)愈合。然而，因代谢拉唑类药物的CYP2C19酶存在基因变异，对于CYP2C19酶为弱代谢者的个体，在使用临床常用剂量的条件下，其血药浓度较高，治疗效果明显优于强代谢者。但是，又不能因此提高临床药物使用剂量，否则，会导致部分弱代谢者体内血药浓度过高，发生严重的不良反应。因此，按照溃疡病患者的基因型，给予合适的药物剂量，是改善拉唑类药物的疗效，减少不良反应的有效手段，并最终达到提高溃疡病患者治愈率的目的。
根据临床上对溃疡病人的常用药查找与其代谢及药效的个体差异关系密切的基因突变位点，并选择在中国人中发生频率比较高、有应用价值的2个基因突变位点CYP2C19*2和CYP2C19*3，制做检测这2个突变位点的基因型检测试剂盒。
溃疡病个体化药物治疗基因型检测试剂盒用途体外检测个体细胞色素P450酶2C19的基因型。本试剂盒采用PCR技术体外扩增待测个体的DNA，对PCR产物进行限制性酶切片段长度多态性分析，从而得出待测个体CYP2C19的基因型。
检测患者基因型测定原理PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)是利用两条与DNA链互补并位于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，和DNA聚合酶经酶促反应体外扩增特异性DNA片段的技术。它包括三个基本步骤(1)变性(Denature)目的双链DNA片段在94℃下解链成单链DNA，以提供复制的模板；(2)退火(Anneal)加入的寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的靶序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环后靶DNA的拷贝数增加一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，通常经30-35轮循环就可合成足够量靶DNA。PCR产物可用于进一步分析。
人类基因组中存在许多限制性内切酶位点，用某种限制性内切酶对某一段基因消化时，会产生大小不同的特定片段即限制性片段。核苷酸缺失，重排或置换可使DNA分子中原有的某种限制性内切酶的识别位点发生改变，导致原有的酶切位点消失或形成新的内切位点。因此用相应的酶进行酶切后形成的DNA片段长度或数目多态性可以反映基因的变异情况。
本试剂盒通过对CYP2C19基因进行PCR扩增，然后用特异性的内切酶进行消化，得到与基因型相对应的不同长度DNA片段。再利用琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段长度多态性，从而得出个体的CYP2C19基因型。
溃疡病个体化药物治疗基因型检测试剂盒中试剂的组成和配制1.基因组DNA抽提试剂推荐采用宝生物的DNA提取试剂盒。
2.PCR反应体系CYP2C19*2扩增体系见表1PCR反应程序94℃预变性5分钟，然后按94℃变性20秒钟、53℃退火20秒钟、72℃延伸20秒钟循环35轮，最后一轮循环结束后，于72℃下延伸5分钟，使反应产物扩增充分。所用的引物序列见表3中的P1(正向引物)、P2(反向引物)；CYP2C19*3扩增体系见表2PCR反应程序94℃预变性5分钟，然后按94℃变性20秒钟、53℃退火20秒钟、72℃延伸20秒钟循环35轮，最后一轮循环结束后，于72℃下延伸5分钟，使反应产物扩增充分。
所用的引物序列见表3中的P3(正向引物)、P4(反向引物)；3.酶切体系2C19*2SmaI1μl，10×A Buffer2μl，0.1％BSA(小牛血清白蛋白)2μl，ddH2O5μl，DNA扩增产物10μl2C19*3BamHI1μl，10×B Buffer2μl，ddH2O7μl，DNA扩增产物10μl缓冲液(Buffer)成分见表4；4、电泳试剂(需自备试剂)3％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液(0.5×TBE)，溴化乙锭(100ug/ml)5μl，加样缓冲液50μl；
5、标准品CYP2C19*2野生型质粒DNA 6μl(含有经引物P1、P2扩增的CYP2C19*2野生型PCR产物序列)CYP2C19*2突变型质粒DNA 6μl(含有经引物P1、P2扩增的CYP2C19*2突变型PCR产物序列)CYP2C19*3野生型质粒DNA 6μl(含有经引物P3、P4扩增的CYP2C19*3野生型PCR产物序列)CYP2C19*3突变型质粒DNA 6μl(含有经引物P3、P4扩增的CYP2C19*3突变型PCR产物序列)使用仪器微量移液枪及tip头(枪头)，DNA扩增仪(Thermo Hybaid)，电泳仪，电泳槽，台式高速冷冻离心机，恒温水浴锅。
标本采集和处理a.静脉血1ml；EDTA抗凝(7.2mg/5ml全血)，最好不用肝素抗凝；；b.如当日不进行DNA提取，保存于4℃条件下，有效期4天；保存于-80℃条件下，可保存两个月。
使用本发明试剂盒检测溃疡病个体化药物治疗基因型方法(检测步骤)如下1.基因组DNA提取以采用宝生物公司DNA提取试剂盒处理100μl的EDTA抗凝全血为例，准备1.5ml离心管，加入GenTLE Solution I 500μl；把混合均匀的100μl血液，加入到上述离心管中，立即振荡几秒钟；室温放置10分钟以上，然后室温(离心温度低会对收量和纯度有影响，请于20℃以上离心)条件下12,000rpm以上离心5分钟，离心时，注意离心管在离心机里的摆放方向统一；用移液枪小心地除去混合物，注意枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插至离心管内侧的底部，将混合物吸取干净；加入1ml的GenTLE Solution II，沿离心管内侧的内壁加入；轻柔地上下颠倒离心管数次，室温12,000rpm以上离心2分钟，用移液枪小心地除去上清；向离心管中加入GenTLE SolutionIII 500μl，轻微振荡10秒钟充分混合；室温12,000rpm离心5分钟，把上清移入另一个新的离心管中；加入等体积(500μl)的异丙醇，上下轻柔颠倒数次，直至看见白色丝状DNA；4℃，12,000rpm离心5分钟，小心除去上清；加入1ml的70％乙醇清洗沉淀，4℃，12,000rpm离心5分钟，小心除去上清；简单干燥沉淀；以10-50μl适当的缓冲液如TE缓冲液溶解沉淀。
2.PCR反应PCR各组分浓度A管CYP2C19*2基因扩增 B管CYP2C19*3基因扩增ddH2O 13.8μlddH2O 13.8μl10×PCRBuffer2.5μl10×PCRBuffer2.5μldNTP2μl dNTP2μlP1 0.25μlP1 0.25μlP2 0.25μlP2 0.25μlTaq 0.2μl Taq 0.2μlMgCl25μl MgCl25μlgDNA1μl gDNA1μlC管空白对照 D管阴性对照ddH2O 14.8μlddH2O 13.8μl10×PCRBuffer 2.5μl 10×PCRBuffer 2.5μldNTP2μl dNTP 2μlP1 0.25μlP1 0.25μlP2 0.25μlP2 0.25μlTaq 0.2μl Taq 0.2μlMgCl25μl MgCl25μl阴性对照DNA 1μlE管阳性对照ddH2O 13.8μl10×PCRBuffer2.5μldNTP 2μlP1 0.25μlP2 0.25μlTaq0.2μlMgCl25μl阳性对照DNA 1μlPCR反应体系为25μl，在0.2ml离心管中进行，依次加入下列试剂ddH2O13.8μl，MgCl25μl，Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，P1 0.25μl，P2 0.25μl，Taq 0.2μl，gDNA 1μl，最后加酶和DNA；混匀后稍离心，按PCR反应程序开始扩增94℃预变性5分钟，然后94℃变性20秒钟，53℃退火20秒钟，72℃延伸20秒钟，循环35轮，最后一轮循环结束后，于72℃下延伸5分钟，使反应产物扩增充分。
3.酶切分析A管将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.2ml)编号，用微量移液枪分别加入DNA 10μl和相应的限制性内切酶反应10×A缓冲液2μl，0.1％BSA2μl，再加入ddH2O5μl使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl SmaI酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保温4小时，使酶切反应完全。
每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用。
B管将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.2ml)编号，用微量移液枪分别加入DNA 10μl和相应的限制性内切酶反应10×B缓冲液2μl，再加入ddH2O7μl使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl BamHI酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保温4小时，使酶切反应完全。
每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用。
4.琼脂糖凝胶的制备及电泳a、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。
b、胶液的制备称取2.5g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入100ml0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为2.5％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
c、胶板的制备将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液5μl。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
d、加样取9μl酶解液与1μl 10×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
e、电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在100V，时间30分钟后停止电泳。
f、观察和拍照在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6，曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。
5.根据基因型检测结果，提出溃疡病个体化用药方案，见表8。
质量控制设置阴阳性对照。正常操作条件下，阴性对照无电泳条带，阳性对照则可显示基因型特异的电泳条带。
结果判断方法用SmaI内切酶消化后，电泳结果与基因型关系见表5；用BamHI内切酶消化DNA后，电泳结果与基因型关系见表6试剂盒保存条件和效期保存条件如不打算立即试验，上述体系请保存于4℃冰箱中注意事项a.PCR操作各阶段应在不同的实验室中进行，合理分隔实验室将样品的处理，配制PCR反应液，PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开，最好能划分标本处理区，PCR反应液制备区，PCR循环扩增区，PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用。
b.PCR操作每个阶段使用专用的仪器和设备；c.PCR实验中注意事项加样时请注意先加容量最大的溶液，最后加酶及DNA；在加样时，注意不要将tip头过度的深入液面以下，以防tip头带出少量液体导致各种反应体系不准确。吸样时则要慢，尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染。
完成加样后，请盖紧eppendorf管盖，以手指弹匀，在离心机上快速离心数秒，保证体系的稳定。
所用的酶在常温下具有活性，在进行上述操作步骤时请在冰上进行。
所有的PCR试剂都应小量分装，或预先配制好PCR反应液，然后小量分装。可以将多组体系相同的溶液加入一个管中，混匀后再分别加入到各自管中。如要做10管PCR，则可按表7配制反应体系待混匀，分装到10个管中(每管24μl)后，再分别加入gDNA 1μl。
d.使用自卸管(滴头)移液器(加样器)或填塞性滴管(滴头)；e.在试剂和标本准备阶段使用负压超净工作台；f.穿工作服和一次性手套；g.在每批检测中设置阴阳性对照实验；h.具有专门经验和培训过的人员进行操作；i.使用一次性用品，并用10％次氯酸或70％酒精或紫外线灯处理工作台和加样器；j.EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
标准品使用说明标准品为经过提纯的质粒DNA，浓度为0.02μg/μl。可按照上述PCR、酶切、电泳条件分析。
实验室结果经过小批量样本的验证，PCR-RFLP检测vs测序符合率为100％。见表9。
表1
表2
表3引物序列
4缓冲液成分
表5
表6
表7
表8
表9溃疡病个体化药物治疗试剂盒验证结果
权利要求
1.一种个体化用药基因型检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有(1)、DNA抽提试剂，(2)、PCR试剂，其中包括正向引物、反向引物、Taq酶、Taq酶附带的PCR缓冲液、dNTP、MgCl2溶液、双蒸水(ddH2O)，(3)、酶切试剂，包括内切酶、酶切缓冲液，(4)、电泳试剂，包括琼脂糖、溴乙锭、加样缓冲液，(5)、标准品，包括野生型质粒DNA、突变型质粒DNA。
2.根据权利要求1所述的个体化用药基因型检测试剂盒，其特征在于PCR试剂中的正向引物和反向引物能使PCR的扩增产物含有药物代谢及效应相关基因突变位点的基因片断，这些突变位点是在人群中的发生频率较高，与临床上针对某些疾病的药物的个体差异关系密切，且对这些药物的药代动力学或药效有明显影响、有应用价值的突变位点。
3.根据权利要求1或2所述的个体化用药基因型检测试剂盒，其特征在于用于检测溃疡病个体基因中CYP2C19*2的PCR试剂中的正向引物(P1)为5’-CAGAGCTTGGCATATTGTATC-3’反向引物(P2)为5’-GTAAACACACAACTAGTCAAT-3’
4.根据权利要求1或2所述的个体化用药基因型检测试剂盒，其特征在于用于检测溃疡病个体基因中CYP2C19*3的PCR试剂中的正向引物(P3)为5’-AAATTGTTTCCAATCATTTAGCT-3’反向引物(P4)为5’-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3’
5.根据权利要求1或2或3所述的个体化用药基因型检测试剂盒，其特征在于酶切试剂中的内切酶为SmaI内切酶、BamHI内切酶；酶切缓冲液为
6.一种应用个体化用药基因型检测试剂盒检测患者基因型的方法，其特征是取患者外周血1～2ml，使用试剂盒中的DNA抽提试剂提取DNA，用试剂盒中的PCR试剂进行PCR扩增，用试剂盒中的酶切试剂作限制性内切酶消化，再用试剂盒中的电泳试剂，制备琼脂糖凝胶，进行凝胶电泳分析，之后判读基因型，提供个体化用药指导意见。
7.根据权利要求6所述的应用个体化用药基因型检测试剂盒检测患者基因型的方法，其特征是检测溃疡病个体化药物治疗基因型步骤中DNA提取采用宝生物公司DNA提取试剂盒处理100μl的EDTA抗凝全血准备1.5ml离心管，加入GenTLE Solution I 500μl；把混合均匀的100μl血液，加入到上述离心管中，立即振荡几秒钟；室温放置10分钟以上，然后室温(离心温度低会对收量和纯度有影响，请于20℃以上离心)条件下12,000rpm以上离心5分钟，离心时，注意离心管在离心机里的摆放方向统一；用移液枪小心地除去混合物，注意枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插至离心管内侧的底部，将混合物吸取干净；加入1ml的GenTLE Solution II，沿离心管内侧的内壁加入；轻柔地上下颠倒离心管数次，室温12,000rpm以上离心2分钟，用移液枪小心地除去上清；向离心管中加入GenTLE SolutionIII 500μl，轻微振荡10秒钟充分混合；室温12,000rpm离心5分钟，把上清移入另一个新的离心管中；加入等体积(500μl)的异丙醇，上下轻柔颠倒数次，直至看见白色丝状DNA；4℃，12,000rpm离心5分钟，小心除去上清；加入1ml的70％乙醇清洗沉淀，4℃，12,000rpm离心5分钟，小心除去上清；简单干燥沉淀；以10-50μl适当的缓冲液如TE缓冲液溶解沉淀。
8.根据权利要求7所述的应用个体化用药基因型检测试剂盒检测患者基因型的方法，其特征是PCR反应体系为25μl，在0.2ml离心管中进行，依次加入下列试剂ddH2O 13.8μl，MgCl25μl，Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，P1 0.25μl，P20.25μl，Taq 0.2μl，gDNA 1μl，最后加酶和DNA；混匀后稍离心，按PCR反应程序开始扩增94℃预变性5分钟，然后94℃变性20秒钟，53℃退火20秒钟，72℃延伸20秒钟，循环35轮，最后一轮循环结束后，于72℃下延伸5分钟，使反应产物扩增充分。
9.根据权利要求8所述的应用个体化用药基因型检测试剂盒检测患者基因型的方法，其特征是酶切分析A管将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.2ml)编号，用微量移液枪分别加入DNA 10μl和相应的限制性内切酶反应10×T缓冲液2μl，0.1％BSA2μl，再加入ddH2O 5μl使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl SmaI酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加，使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低，混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保温4小时，使酶切反应完全，每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用；B管将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.2ml)编号，用微量移液枪分别加入DNA 10μl和相应的限制性内切酶反应10×K缓冲液2μl，再加入ddH2O7μl使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl BamHI酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低，混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保温4小时，使酶切反应完全，每管加入2μl0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用。
10.根据权利要求9所述的应用个体化用药基因型检测试剂盒检测患者基因型的方法，其特征是琼脂糖凝胶的制备及电泳为a、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用，b、胶液的制备称取2.5g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入100ml0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里或电炉上加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为2.5％琼脂糖凝胶液，加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液，加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发，c、胶板的制备将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏，宽约1cm，紧密封住，将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液5μl，用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡，待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面，因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液，d、加样取9μl酶解液与1μl 10×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量，每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿，e、电泳加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在100V，时间30分钟后停止电泳，f、观察和拍照在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带，经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6，曝光时间10-120秒，根据荧光条带的深浅选择。
全文摘要
本发明属于基因技术领域，涉及一种个体化用药基因型检测试剂盒及其应用方法。个体化用药基因型检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有(1)DNA抽提试剂，(2)PCR试剂，其中包括正向引物、反向引物，正向引物和反向引物能使PCR的扩增产物为含有药物代谢及效应相关基因突变位点的基因片断。(3)酶切试剂，包括内切酶、酶切缓冲液，(4)电泳试剂，包括琼脂糖、溴乙锭、加样缓冲液，(5)标准品，包括野生型质粒DNA、突变型质粒DNA。应用本发明个体化用药基因型检测试剂盒检测患者基因型的方法，其特征是取患者外周血1～2ml，使用试剂盒中的DNA抽提试剂提取DNA，用试剂盒中的PCR试剂进行PCR扩增，用试剂盒中的酶切试剂作限制性内切酶消化，再用试剂盒中的电泳试剂，制备琼脂糖凝胶，进行凝胶电泳分析，之后判读基因型，提供个体化用药指导意见。
文档编号G01N27/447GK1690702SQ200410023138
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月23日 优先权日2004年4月23日
发明者周宏灏, 赵震宇 申请人:周宏灏, 赵震宇