组织加工的方法

专利名称：组织加工的方法
技术领域：
本发明涉及用于组织学分析的对生物样品从固定到浸渗的加工。尤其是，本发明涉及快速和安全的加工系统，该系统能够以连续生产量操作并且排除了有毒物质和可燃性性溶剂例如二甲苯的使用。
常规的制备用于组织学的样品(例如，组织)的方法包括在单独的磷酸缓冲的10％甲醛溶液中孵育以固定样品，在一系列浓度增加的醇中脱水，并在浸渗之前在二甲苯中孵育以使脱水试剂处理的组织透明化。由于这一过程需要的时间通常为8小时或更长，习惯上在设计用于这些任务的自动化机器设备中完成这些单独的步骤-固定、脱水、透明化和过夜浸渗(参见，例如US3,892,197；US4,141,312；和US5,049,510)。
组织加工的最终目标是对样品提供来自相似硬度介质的内部和外部支持物，使得样本可以经受超薄切片而不被损坏。最常见的包埋或支持介质是石蜡，但许多其他物质也可以使用。超薄切片法是在超薄切片机上用锋利的钢刀将包埋的样品或样本切割或切片成为大约2-8微米厚度的薄片的方法。然后将薄片捡在载玻片上，通常为显微镜载玻片。
标准的石蜡加工方法包括通过梯度醇溶液而暴露于化学脱水，然后浸没在过渡溶液(通常指透明剂)中，随后用石蜡浸渗。脱水指除去水分。在加工过程中，脱水被用于除去自由水分子，并且如果正确操作还除去结合的分子水。对于植物和动物组织而言，脱水通常使用醇溶液来完成，最通常使用乙醇，异丙基醇(异丙醇)；偶尔用甲醇，或丁醇。如果样本脱水不恰当而使水分留在样本中，透明剂和浸渗剂(例如石蜡)不能渗入组织，则样本会软化和成糊状。过量脱水会除去结合水，导致样本收缩，硬化，易碎，这样的样本需要在切片之前另外重新水化。
组织样品中的脂肪用溶剂除去，因为脂肪会妨碍透明和浸渗。不完全去除脂肪(脱脂)会导致组织切片的赝像的扩散，组织切片起皱和染色不佳。脂肪可以用不同溶剂从组织样本中除去，例如丙酮，氯仿和二甲苯。
在样品脱水之后，“透明”剂被用于从样品中除去脱水所用的醇，并制备样品或样本用于浸渗介质。透明剂，也称为“脱醇化”剂，必须与脱水剂和浸渗/包埋介质都能够混溶。通常由于残留在样本中的水或由于暴露时间不够而引起的透明不充分使得石蜡渗透不充分，这将使样本变软和成糊状。另一方面，过度暴露于透明剂会产生硬化的易碎的样本，这是由组织蛋白变性所引起的，这与过分脱水的效果非常相似。
二甲苯(二甲基苯)是许多年来最广泛使用的透明剂。其是迅速置换醇的芳香烃，并且其反射指数能产生组织的透明化。二甲苯的主要缺陷是其使用不便，因为其高度易挥发，易燃并怀疑致癌。因此二甲苯必须在充分通风的条件下使用，并避免与皮肤的接触。此外，二甲苯非常昂贵。
已经积极寻找二甲苯的有效替代物。第一个替代物柠檬烯出现于1981年。然而，该化合物由于一些因素对主体会投下阴影。柠檬烯是油性的，不能可靠地再循环(再循环的溶液不同于原始产物)。其气味过强，并迅速遍及相邻的房间和门厅。最麻烦的是该化合物对被暴露于其中的工作人员中引起严重的过敏反应。其他的二甲苯替代物为短链脂肪烃(烷)。精油也可以用作二甲苯替代物，但它们不常见。然而，这些二甲苯替代物没有已经证明像二甲苯一样有用并且低廉。
用于组织加工的常规方法可以手工进行或以自动化方式进行。大多数组织病理学实验室使用自动化组织加工机器，其使用多个容器并需要6-20小时来进行加工。执行这样常规加工的自动化组织加工机由例如Shandon(HYPERCENTER和PATHCENTRE型号)，Miles-Sakura(TISSUE-TEK型号)，和Mopec-Medite(TPC15型号)出售。
现有技术中的系统的缺点是这样的自动化系统不能够以连续生产量运行。由于完成组织加工所需的时间，含有组织的盒在白天被装载到系统中，而组织加工在过夜循环中完成。因此，现有技术系统的操作不能够使含有组织的盒在工作日内完成加工。
典型的这种常规方法需要在工作日的某个时间将组织样品从操作间，诊所或其他地点送到病理实验室，随后对样品进行过夜成批加工，所以最早只有在第二天早晨才能获得适合用于封闭或切片的组织样品；根据从封闭和切片的样本获得切片由病理学家的显微镜检查得出的诊断只有在第二天的晚些时候才有可能得到。在收到样本和发送病理报告之间至少需要接近24小时。
除了给从业医生(例如外科医生)病理报告需要至少一天的延迟以外，还有与病理实验室的工作流程受到阻碍相关的问题，这些问题是出于样本必要的的成批加工，使设备过夜操作的安全考虑，可能的设备故障的危险和需要监控设备，以及在自动化时这样的加工中使用大量试剂的废物。此外，需要昂贵的措施以防止实验室人员暴露于与该加工中使用的试剂(例如二甲苯)有关的有害烟雾和有毒物质。此外，常规方法产生的大量溶剂废物和石蜡残渣如果不恰当处理会污染环境。
为诊断目的，加快组织加工和分析是一直以来所追求的目标。此外，近期的保健焦点已经指向减少各种方法包括组织加工的成本。组织加工的成本与样本加工和分析的时间、在实验室中个人所需的空间和设备、试剂的体积(包括纯试剂的购买价格和处置废弃物的费用)、以及所需人员数量有关。更重要的是，病人和他们的医生依靠病理评价和诊断来指导治疗。减少完成组织加工所需的时间将减少在获得样本和将病理报告发给医生之间的这段时间内的焦虑。因此，加工组织样品所需时间的显著减少是非常受欢迎的。其他人也认识到缩短组织加工时间的需求，但他们只在常规方法中作出微小的改进。为加快组织加工，美国专利4,656,047，4,839,194和5,244,787使用了微波能量；美国专利3,961,097和5,089,288使用了超声能量；而美国专利5,023,187使用了红外能量。美国专利5,104,640公开了非水性的固定剂组合物，稳定剂和将血涂片粘附到载玻片上的增溶剂。
本发明人描述了与目前使用的任何组织加工方法都不同的组织加工方法。提供了用于组织学(或病理学)分析的生物样品的加工方法，包括将样品与组合物接触，该组合物包括超临界或接近超临界的流体，随后将样品在超过1bar的压力下浸渗于包埋介质中。
根据本发明的方法比任何报道的方法都快速，对加工的组织的损伤最小，避免使用有机溶剂包括二甲苯，使用最小量的试剂，并且令人惊奇的是产生用于后续的细胞学，组织学或解剖分析的优异的样本。此外，用本发明的方法可以不必使用具有可燃液体例如乙醇或二甲苯的大(塑料)容器。
超临界液体，有时称为超临界气流体或流质是超过其临界温度(Tc)和其临界压力(Pc)的任何物质。对各物质而言，不管施加多少压力，在超过某一温度时其不再以液体形式存在。同样，不管将温度升高多少，在超过某一压力时该物质不能再以气体形式存在。这个点称为临界点；临界温度和临界压力是纯物质相转变图(phase diagram)的限定界限。
在超临界区域只有一种流体状态。超临界流体显示介于液体和气体之间的物理化学性质之间的物理化学性质。超临界流体(也称为凝聚气体)能够比真正的液体更容易沿表面扩散，因为它们的表面张力比液体小。同时，超临界流体保持液体溶解溶于化合物的物质的能力，而气体没有这种能力。
根据本发明，(组织)样品与超临界流体接触或被其包围，包括将样品用包括(接近)超临界流体的组合物加压到超过超临界流体的临界压力(Pc)，并将样品用超临界流体加热到高于超临界流体的临界温度(Tc)。当超临界流体在高压容器中通过样品时穿透样品。并不总是必须使用处于临界点或超过临界点(即，超过其Tc和Pc)的物质，只要该物质的性质(尤其是溶解能力)适合用于组织加工的方法即可。例如，处于超临界点附近的压力和温度下的接近超临界的流体也可以优选用在此处提供的方法中。根据本发明，术语“接近超临界的流体”定义为在其Tc的大约0.7到大约1.4倍的温度范围内的和在其Pc的大约0.3到大约0.7倍的压力范围内的流体。
在优选的实施方案中，样品与包含(接近)超临界的二氧化碳(CO2)的组合物接触。CO2的超临界压力大约为7.3MPa(73bar)而超临界温度为大约31℃。生物组织含有在大约60℃以上的温度变性的蛋白质。CO2相对低的超临界温度允许样品与超临界流体在基本不对生物样品造成有害的影响的温度下接触。然而，其他具有相对低超临界温度(优选低于60℃)的(接近)超临界流体也适合用于本发明的方法，例如，氙，一氧化二氮，乙烷，HFC-116，三氟氯甲烷，乙烯，六氟化硫和三氟甲烷。CO2在工业应用中非常具有价值，因为它是地球上次最丰富的和次最便宜的溶剂。其不可燃，无毒，容易获得高纯度。
包埋或支持介质为样品提供了机械支持使得可以制备例如用于显微镜检查的切片。根据本发明优选的包埋介质是液体包埋介质例如液体石蜡。此处的实施例中石蜡被选作包埋介质是因为其可溶于超临界的CO2(或相反，CO2可溶于石蜡)，便宜，易于处理，并且由于这一材料提供的一致结构而便于切片成带状。其他合适的包埋或浸渗材料是可市售获得的蜡配方，不同熔点蜡(例如，液体矿物油和固体石蜡)的混合物，paraplast，bioloid，embedol，塑料等。
根据本发明，样品通常首先被浸没在乙醇或其他类型的脱水剂中以替换样品中的水。然后样品用(接近)超临界流体加压以除去脱水剂诸如乙醇。在(接近)超临界条件下，脱水剂和流体是可以混溶的，即它们能完全彼此溶解而不论各组分的比例如何。随后在保持高压即超过1bar的压力(1大气压，1kg/cm2)的同时，通过渗透包埋介质而取代(接近)超临界的流体。样品内(接近)超临界流体被溶解在包埋介质中，同时其逐渐被石蜡所取代。渗透步骤中的高压确保组织中不捕获气体并且保持细胞的结构。优选，施加的压力至少为50bar，更优选至少100bar，例如120或150bar或更高，例如大约200bar。一般说来，施加的压力越高，(接近)超临界的流体在包埋介质中的溶解度越高并且流体被包埋介质取代的效率越高。例如，已经观察到CO2在液体石蜡中的溶解度在55℃ 80bar下为大约15％(w/w)，在120bar为大约30％(w/w)和在180bar为大约50％。本发明进行浸渗的温度可以是不同的，并且依赖于使用的包埋介质和其他因素。通常，选择高于包埋介质熔点的温度。就石蜡而言，这个温度是56-58℃。然而在高压下，熔点通常降低。例如，在压力110bar下，石蜡在51℃开始熔化并在57℃完全熔化。当将包含样品的反应器(参见

图1)的温度升高到熔点温度，反应器内的压力也增加。在本发明的一个实施方案中，样品与CO2在压力150bar大约40℃下接触大约0.5-1小时以从样品中除去乙醇。随后，样品被加热到65℃同时保持CO2的密度使得压力增加到大约220-250bar。液体石蜡被允许进入反应器，同时CO2被允许离开反应器并尽量保持常压。在经过大约30分钟后反应器完全被石蜡充满以从样品中除去和/或溶解CO2。在加工的这个阶段，压力可能下降到例如100-140bar。一旦样品完全浸没在石蜡中，压力可以逐渐降低以允许CO2从组织扩散进入石蜡并避免CO2气泡被捕获在组织中。
当样品被减压后，优选地将样品在温暖的石蜡中放置一段时间(例如，10-60分钟)。
超临界流体溶解性增强的现象自从19世纪以来就是已知的。它们用于食品加工行业以提取调味化合物例如咖啡因和酒花油已有几十年。超临界流体的溶解力对操作条件的微小变化敏感，并且可以微调压力和温度以调节超临界流体的溶解能力用于具体方法。超临界流体的合乎需要和独特的性质已经提供了施用超临界流体技术用于各种其他问题的动力，这些问题例如为，织物的清洗和污染土壤的卫生处理。
超临界流体提取已经被用于制备掺入到异种移植物和生物假体装置中的无菌组织。美国专利申请US2003/0072677描述了使用超临界流体以从组织中除去传染性材料和用化学试剂处理组织。与本发明不同的是，US2003/0072677没有涉及加工样品用于进一步检查，更没有提及在组织(包埋)方法中应用超临界流体。美国专利6,493,964描述了用于制备电子显微镜样品和生产半导体晶片的超临界点干燥装置。其利用的技术是用超临界的“过渡(transitional)”流体取代细胞结构中的脱水流体然后除去该过渡流体。然而，美国6,493,964没有涉及样品浸渗，并且没有教导或暗示超临界流体被有利地用作脱水剂和包埋介质之间的媒介并同时保持高压，而这一应用与常规方法相比产生品质非常优异的样本(参见下文)。EP0822403涉及使用惰性气体在高压下加工有机组织用于进一步的研究，使得样品可以在更高温度下被处理。可以通过在包含组织样品的容器中引入惰性气体，例如CO2来逐渐增加压力。已经提到优选在压力高至10bar和温度从室温直至90℃的同时进行脱水/透明化步骤。在这些条件下，CO2不处于超临界状态或接近超临界状态。因此，EP0822403的方法包含与本发明的方法完全不同的概念，并且不包含(接近)超临界流体。此外，EP0822403提到了优选在真空中进行浸渗。
在本发明用于组织加工的方法中，样品用(接近)超临界流体处理随后用包埋介质在高压下浸渗。在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括在浸没之前对样品脱水、脱脂和/或脱钙。所述其它加工步骤可以使用上述的常规方法进行。然而优选使用超临界流体进行。在一个实施方案中，提供了处理样品的方法，其中所述加工包括使用超临界流体对所述样品脱水。例如，样品与超临界流体接触以在用包埋介质浸渗样品之前从样品中溶解和除去水。超临界流体可以与其他溶剂混合以帮助从样品中提取某种物质(例如，水)。在一个实施方案中，样品用包含超临界流体和脱水剂的组合物脱水，优选脱水剂为醇，例如乙基醇(乙醇，EtOH)或去污剂，例如吐温。此处提供的使用超临界流体脱水通常迅速完成，有时甚至在数分钟内完成。因此，本发明将改进的包埋方法与替代使用梯度醇溶液耗时的传统逐步脱水有利的方法相组合。有利的是，超临界流体从样品中溶解和提取其他物质，诸如脂肪和脂类，由此促进将样品切成薄的切片。在具体的实施方案中，样品的加工，尤其是钙化组织例如骨样本的加工包括从样品中除去钙。样品的脱钙对于将骨组织和组织中其他钙化的颗粒切成薄切片而言是重要的，因为钙化的结构通常是难以切割的。传统的脱钙方案需要将固定的样品另外在酸性脱钙溶液(通常是甲酸、乙酸，盐酸和硝酸)中孵育1-5个晚上。脱钙也使用钙螯合剂例如EDTA(乙二胺四乙酸)来进行。与目前的脱钙方法相比，根据本发明的样品脱钙更简单和快速地完成。有关于此，生物样品与包含(接近)超临界流体的组合物接触，其中所述组合物另外包含脱钙剂。合适的脱钙剂包括酸例如羧酸，例如甲酸和乙酸，和其他能够结合和螯合钙的化学物质。
当使用包含超临界流体和另外包含辅溶剂(例如用于溶解水和/和钙)的组合物时，超临界流体和辅溶剂(例如，醇和/或酸)可以以量筒中的混合物形式提供。另一种提供另外的辅溶剂的方法可以通过原位(onsite)使用另外的泵系统将所需的辅溶剂与超临界流体混合得以实现。
此处使用的组织学分析指可以用于研究组织、细胞、器官或生物体的外观和行为的任何类型的分析。分析可以通过在显微镜下检查加工过的样品而完成。加工过的样品(的组分)可以与一种或多种试剂诸如染料、特异性与样品中的一种或多种组分(诸如蛋白质，核酸，碳水化合物)反应的试剂或探针接触，以鉴定和标记某种细胞类型或组织。组织指细胞集群或数层细胞，其基本相似并共同作用完成特定功能。典型的探针包括抗体(例如用于免疫组织化学)，核酸(RNA；DNA)探针(例如用于原位杂交或PCR技术)，用于酶组织化学的底物(如用于检测乙酰胆碱酯酶或ATP-酶活性的NADH)和传统的染色化学物质诸如苏木精和曙红(H&E)；用于硫酸化的粘物质(mucosubstances)的阿尔新蓝(Alcian Blue)；用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的Brown-Brenn革兰氏染色剂；用于淀粉样蛋白的刚果红；用于幽门螺杆菌(H.pylori)的Giemsa；和骨髓；Gomori′s改进的铁染色剂；和本领域技术人员已知用于鉴定或标记某种细胞类型或组织的许多其他探针，不管上述细胞或组织是正常的或病理的。
病理分析指与病理学相关的组织分析。典型的是病理分析由病理学家在显微镜下通过研究含有细胞或组织的样品而诊断疾病来完成。在优选的实施方案中，病理分析包括分析人的样品以对疾病划分阶段和级别。
根据本发明，样品包括生物样品诸如组织样本。在本发明的上下文中，“组织样本”是可以用此处公开的方法加工的任何组织。其还可以指来自任何生物液体(例如腹水，血液，胸膜分泌物)的单个细胞，或由实体器官吸引术或体腔灌洗获得的细胞悬液。单个细胞可以通过在加工之前沉降或浮力离心而沉淀得到。其还可以指完整的器官，甚至完整的生物体或其部分。生物体包括单细胞和多细胞生物体，并且其范围包括细菌，真菌，昆虫，植物和哺乳动物。来自人体对象的实体片(pieces)(即，组织切片和针吸的活组织检查样本)被通常加工用于组织学和病理学。用于固定和包埋器官(例如脑)的常规方法需要直至6-8周，而本发明的方法可以用固体包埋介质在一天内浸渗(完整的)器官或其部分而不使用有毒的(透明剂)溶剂。
用本发明的方法，有可能将总加工时间(从固定到浸渗)从常规的8-12小时减少到少于2小时，优选少于1.5小时，更优选少于1小时。在现有技术中没有教导或暗示制备诊断性组织载玻片的整个加工可以在少于1.5-2小时内完成，该加工从固定的或未固定的组织制备样本开始，至浸渗结束，样本可以连续加工，避免使用有毒物质、可能致癌性的透明剂并且样品品质优异。WO 01/44783公开了组织加工系统，其包括允许在2小时内快速加工的改进的微波单元，并任选不使用二甲苯透明剂。然而WO 01/44783的方案只能加工厚度小于3mm的组织样本。与之对比，本发明的方法可以使用超临界流体快速加工厚度直至5mm，诸如8mm或者甚至超过1厘米的样品。如上所述，本发明的方法与WO 01/44783不同，其不限于组织样品或小的组织切片。根据本发明的方法可以加工体积范围从大约0.001cm3(如活组织检查样品)或1cm3(如皮肤样本)直至10cm3(如小的肿瘤)或甚至直至更大的样品如体积为2000cm3的样品(如器官，诸如完整的脑)。总的来说，根据本发明的方法，样品越大加工样品需要的时间越长。然而，与现有技术相比，利用本发明获得的时间增益还可以随样本大小的增加而提高。例如，根据本发明的方法20×15×5mm的组织样本被迅速脱水和浸渗。这提供了相当多的优点，因为样品能够以这样的大体积或大小被加工，从而有可能从所述样品获得多个(超薄切片机)切片。例如，在样品的组织学检查之后，病理学家可能想要检查用特定试剂例如抗体染色的上述相同样品，以帮助组织学分析。根据本发明的方法加工样品可以只提供所述相同样品的1/2，1/3或更多分之一的(平行)切片。如果样本在加工前已经小于3mm，如WO 01/44783所述的情况，则这是明显不可能的。事实上，需要在开始时得到多个样品并且其相对的定向必须仔细记录以重建它们在原位的联系。
根据本发明使用超临界流体加工的不同类型人组织样本的组织学分析出人意料地显示该样本与根据常规方法加工的相同组织样本比较具有更优异的性质。例如，显示于图3的使用二氧化碳加工后的人结肠样本角蛋白染色图谱比图2的角蛋白染色模式更强烈，图2显示的是使用常规方法加工的相同结肠样本。同样，可以对根据本发明的方法加工的波形蛋白染色的人胆囊样本(比较图3和4)和对S-100染色的人神经样本(比较图6和7)进行改进的组织学分析。
在本发明的一个实施方案中，按照本发明的方法在根据本发明的方法加工之前固样品定，例如使用甲醛溶液(也称为福尔马林)。甲醛(CH2O)与蛋白质的末端-NH2自由基团反应，并形成蛋白的两个组分之间和两个不同蛋白之间的共价亚甲基桥。然而，常规的固定和组织加工(即进入石蜡块内)的主要缺点是可能导致核酸(如DNA，尤其是RNA)结构不可逆的损坏(例如，磷酸二酯键的水解和/或脱酰胺作用)。因此，将(组织)样品固定和加工到石蜡块内限制了用于诊断和研究的遗传技术的应用。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明方法加工预冷冻的样品。本领域内已知大多数DNA和某些RNA分析需要特别小心处理样品材料，例如将新鲜组织立即(“速冻(snap)”)冷冻在液氮中以防止核酸降解。本发明的方法可用于浸渗(速冻)冷冻的样品，因而本发明提供了获得加工的生物样品的方法，该样品随后被分析用于各种类型的组织学分析，包括核酸(DNA，RNA)分析。然而，另一方面，冷冻切片的组织学诊断可能受到与从石蜡块制备的切片相比的缺点的影响。例如，冷冻样品易于脱水。因此冷冻样品的储存需要防止脱水的措施。重要的是，冷冻组织常常显示许多赝像，这是由于样品中存在的冰晶所导致的。因此，有时可能难以充分衡量固定的或冷冻的样品彼此之间相互的优点和缺点。
根据本发明加工样品的方法目前提供了对这些问题良好的解决方案，因为除了加工固定的或冷冻的样品外，还可以在与超临界流体接触之前快速加工没有被固定或冷冻的新鲜样品。代替使用冷冻或使用化学固定剂的是，样品在与超临界流体接触时遭遇的高压和在高压下用包埋介质(例如石蜡)快速浸渗保证最大程度保持结构(structure andarchitecture)。出人意料的是，如果压力增加并随后逐渐降低，则对于组织样品没有损伤。对样品的加压可以相对快速地完成。组织内的细胞充满能承受迅速加压的液体。然而，样品应当逐渐减压以避免液体迅速膨胀并破坏细胞。因此，本发明提供了速冻冷冻样品有吸引力的替代方法，并允许制备适用于各种类型(病理)分析的样品而不使用福尔马林，所述分析包括组织学、生物化学和核酸的分析。
重要的是，除了减少组织加工所需的时间，使用超临界流体的快速组织制备允许保存细胞结构和形态，而这些是用常规方法会丢失的。强化生物结构的重要化合物糖原几乎总是在使用常规方法时丢失。淋巴管，尤其是子宫肌层的淋巴管，其在常规加工中会萎陷，而使用本发明的方法则基本保持完整。此外，对本发明方法加工的组织的研究显示与常规加工方法比较DNA和RNA提取物的完好保存。在医院和其他外科手术场所中获得的组织可以在送到实验室后很快被加工用于组织学和遗传学研究。此外，因为根据本发明加工的样品通常保存较好，可以制备档案样品材料用于日后研究和其他应用。
本发明不禁止从加工的样品中制备核酸、DNA或RNA。因此有可能对临床病理实验室收集的样本进行遗传研究。这些技术组合的力量是强大的。组织学观察可以与遗传研究得到的结果相关联，该遗传研究通过染色或免疫组织化学而分析一个组织化学切片，并且分析来自相邻切片的核酸用于遗传分析(使用例如PCR技术)。例如，可以比较相同切片的患病和正常的区域以检测遗传差异(例如，突变，转录水平)，可以通过在若干时间点比较样品的遗传差异而表征疾病进程，以及可以在积累从原发癌症到癌症转移的遗传差异之后评估肿瘤的发展。
根据本发明方法的另一个优点涉及样品或样本的定向。样本定向对于得到最终结果-准确诊断是非常关键的。在现有的方法中，加工的(包埋的)样本被放置在样本载台或模子中使得可以在超薄切片机上对组织进行切片。将通常是小而精细的样品以正确的定向固定和定位到载台中常常是非常麻烦的。因为大多数胶与组织加工使用的有机溶剂不匹配，具有粗糙的或“粘性”表面的模具通常被用来将样本附着于模子或载台的底部。然而，这些载台通常不能充分固定样本使得样本可以被切片。提供其他具有嵌入式(snap-on)盖子的样本载台以通过简单地在顶部和盖子之间将样品夹紧(clamping)而固定样品。可是，这些载台不适合用于精细的样本例如皮肤或上皮组织，因为将样本夹紧所需的压力容易破坏这些组织的完整性，例如，表现为血管的萎陷。本发明目前提供对这些问题的解决方案。由于本发明的方法不再需要使胶水不适于使用的以前的有机溶剂，现在样本可以简单地用胶水以所需的定向粘在载台底部。此外，如前所述，本发明的方法适用于浸渗比适合用于至今使用的方法的样品大相当多的样品。结果，现在甚至有可能在加工之前首先定位完整的组织，器官或甚至生物体。例如，在手术室除去肿瘤。取代将肿瘤切成多个小的样本并仔细记录它们的相对定向，本发明现在允许定位和包埋整个完整的肿瘤。
我们已经开发了简单、安全、低成本、迅速和可靠的方法，其允许在从收到病理实验室的组织起1.5小时内制备适合超薄切片机切片的浸渗的组织块。本发明允许连续加工和流动样本，不管是新鲜的、固定的或冷冻的样本都适合于自动化，避免了使用福尔马林和二甲苯造成的有毒烟雾，允许组织加工标准化，并且比常规方法需要的试剂体积小很多。通过“连续”加工，我们指的是另外的组织样本以完成该方法的个别步骤所需的时间确定的间隔(即，数分钟)进入本发明的系统，而不是以完成整个方法所需的时间(即，一到数小时)确定的间隔。在任何给定的时间，可以有处于不同加工阶段的样品。换句话说，本发明使得沿着组织加工的不同阶段连续的通量和样本的流动成为可能。连续加工可以手工完成或者可以通过自动化仪器诸如组织加工器来完成。
在本发明的一个方面，提供了用于本发明方法的加工器。根据本发明的该加工器的实施方案现在将通过参考附图的图1而以实施例的方式描述。
图1图示了根据本发明的加工器的例子。
图1的加工器1包括储存槽3和管道系统4。管道系统4具有进口2用于向加工器提供物质，在该例子中假设是液体二氧化碳。二氧化碳通过管道系统4的管道运输穿过冷却器13进入储存槽3。加工器1包括储存槽3下游的加压装置5和加热装置6，两者均用于使二氧化碳达到所需的条件。二氧化碳被提供给加工反应器9。该反应器9可以包含待由加工器1制备用于组织学分析的样品10。反应器9包括加热和/或冷却装置14以保持反应器9中的二氧化碳处于所需的条件。利用反应器9的这些调节装置14，如上所述本发明的不同方法的不同步骤可以在加工反应器9中完成。在加工反应器9下游的加工器1还包括压力控制阀16，随后是用于从离开反应器9的物质的混合物中分离不同物质的分离装置11。提取的物质诸如醇，石蜡，水等可以通过出口12离开提取装置。某些这种物质，例如石蜡可以再次使用。从混合物剩下的二氧化碳可以循环使用。为此，其从分离装置11通过管道4进入循环装置13，例如包含在加工器1的管道系统4中的二氧化碳气体冷却器13，随后液化的二氧化碳被再次进料到储存槽3。当反应器9充满二氧化碳时，泵5被关闭并且通过打开阀17而将含有包埋介质(例如石蜡)的压力容器7清空到反应器9中，使得包埋剂在重力作用下沿着管道8流动并流入反应器9中。由于压力容器7连接到管道4而使其保持在压力下。这里样品10被包埋介质浸渗，此后，反应器9和压力容器7可以随后通过管道4A减压进入分离容器11并通过出气口15而清空。
已经描述了根据本发明的加工器1的实例，对本领域技术人员而言可以对之进行许多修改而不偏离本发明权利要求所定义的范围。例如，可以在单个加工器中应用大量反应器，压力容器，储存槽，泵，控制装置，阀等。例如泵可以用来添加辅溶剂或脱水剂(例如，乙醇，丙酮，甲醛等)。
实施例乙醇浸渗的人胆囊，结肠和神经样本被放置在1升反应器中。反应器保持在温度40℃。关闭反应器并使二氧化碳在40℃加压到150bar。在维持压力为150bar的同时使用控制阀，反应器用泵以10千克/小时的速率充入新鲜二氧化碳。在45分钟后，关闭泵并将温度升高到60℃。提高压力到大约230bar。熔化的60℃石蜡被以2升/小时的速率缓慢倒进反应器，浸渗样本，同时保持压力在210bar。在反应器几乎完全充满石蜡后，反应器被减压10分钟。过量的石蜡从反应器排出，并且反应器被冷却到40℃，其后从反应器收集包埋的样本。根据常规方法对该样本作组织学分析。
权利要求
1.用于组织学分析的生物样品的加工方法，包括将样品与包含超临界或接近超临界的流体的组合物接触，随后将样品在超过1bar压力下用优选石蜡的包埋介质浸渗。
2.权利要求1的方法，其中所述超临界或接近超临界的流体是二氧化碳。
3.权利要求1或2的方法，其中所述生物样品是新鲜的、冷冻的或固定的组织样品，优选新鲜的未固定的样品。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述生物样品包括器官或其部分。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述样品在浸渗之前优选使用包含超临界流体的组合物脱水、脱脂和/或脱钙。
6.权利要求5的方法，其中所述组合物另外包含脱水剂，优选醇。
7.权利要求5或6的方法，其中所述组合物另外包含脱钙剂，优选酸。
8.制备至少一种用于组织学分析的样品(10)的加工器(1)，包括用于至少一种样品(10)的至少一种加工反应器(9)，其特征在于加工器(1)包括向反应器(9)提供至少一种物质的供料装置(4)，所述物质中至少一种处于超临界相或接近超临界相，和至少一种用于通过管道(8)向反应器(9)添加包埋介质的供料装置(7)。
9.权利要求8的加工器(1)，进一步包括用于使物质达到所需压力和/或温度的加压和/或加热装置(5，6)。
10.权利要求8或9的加工器(1)，进一步包括用于从离开反应器(9)的物质的混合物分离物质的分离装置(11)。
11.权利要求8-10任一项的加工器(1)，进一步包括用于将由反应器(9)排出的物质再循环的再循环装置(13)。
12.权利要求8-10任一项的加工器在用于组织学分析的生物样品的加工中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于组织学分析的生物学样品的加工。尤其是，本发明涉及能够以连续生产量操作的快速自动化加工系统，并且排除了对有毒溶剂例如二甲苯的使用。提供了加工用于组织学分析的生物样品的方法，包括将样品与含超临界或接近超临界的流体的组合物接触，随后将样品在超过1 bar的压力下用优选为石蜡的包埋介质浸渗。还提供了制备至少一种用于组织学分析的样品(10)的加工器(1)，包括用于至少一种样品(10)的至少一个加工反应器(9)，特征在于加工器(1)包括向反应器(9)提供至少一种物质的供料装置(4)，所述物质中至少有一种物质处于超临界相或接近超临界相，和至少一个用于通过管道(8)向反应器(9)添加包埋介质的供料装置(7)。
文档编号G01N1/31GK1816737SQ200480018826
公开日2006年8月9日 申请日期2004年6月30日 优先权日2003年6月30日
发明者埃里克·彼得·布洛伊尔, 杰勒德·威廉·霍夫兰德 申请人:格罗宁根大学医学中心