专利名称：NFκB信号通路的重要调控蛋白PAK7的制作方法
技术领域：
本发明涉及NFκB信号通路的重要调控蛋白，尤其涉及一种筛选通过影响NFκB信号通路而抑制细胞凋亡、影响细胞骨架形成、促进细胞的生长和发育的方法。
背景技术：
基因功能研究，因其可以在分子层面上揭示人类健康和疾病的奥秘，寻找出最重要的致病基因，而成为确定基因能否成为药靶的关键步骤。国外大型制药厂已发现，单靠基因序列数据和生物信息分析虽然能够找到大量潜在药物靶点基因，但这类基因只能被归类为“低质量”药靶。药物开发人员面对数目巨大的低质量药靶变得无所适从，迫切需要大量的基因功能研究加以验证，才能筛选出新药开发可以依赖的“高质量”靶点。所以，功能基因组学研究蕴藏着巨大的应用价值和商业前景。
在目前可以作为靶点的5,000个基因中，磷酸激酶(kinase)的序列有很大的保守性，是公认的药物筛选基因靶点，与磷酸酶(phosphatase)、蛋白酶(protease)以及各类受体统称为一类靶点。磷酸激酶(kinase)将ATP或GTP位的磷酯基转移到底物蛋白质氨基酸残基上，催化蛋白质磷酸化。蛋白质的磷酸化和去磷酸化是蛋白质调节其功能/活性的一种重要方式。如MAPK和转录因子CREB，Jun等，在磷酸化状态时具有活性，而在非磷酸化状态时没有活性；而转录因子IkBa等则相反，在磷酸化状态时没有活性，而在非磷酸化状态时具有活性。
蛋白质的磷酸化-去磷酸化是细胞信号转导过程中的重要环节。细胞信号转导是指细胞通过位于胞膜或胞内的受体，感受细胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换，发挥生物学效应，进而几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。人类很多疾病都与信号转导通路密切相关，如在肿瘤坏死因子(TNF)导致的炎症反应中，肿瘤坏死因子通过结合受体激活一系列蛋白磷酸激酶之间的相互作用，最终激活NFκB而引起炎症反应。生物化学家以及不少公司都在通过研究蛋白之间的相互作用来揭示信号传递通路的关键部位，并开发影响信号传递的药物，以达到治疗疾病的目的。信号转导过程的顺利进行有赖于多种蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化，而这个过程正是由磷酸激酶催化完成的。
鉴于信号转导通路在细胞增殖、分化和多种疾病发生过程中的重要、甚至决定性的作用，以及磷酸激酶在信号转导通路极其重要的地位，设计和开发以磷酸激酶为靶点的新药，通过调节、控制信号转导通路治疗疾病，无疑是一种针对性强、高效的理想途径，具有治疗多种疾病的潜在前景。目前针对激酶的药物包括PKC活性调节剂、PKA抑制剂、PTK抑制剂和受体介导的钙通道调节剂等，其中部分已经进入临床试验。但现有的激酶药物靶点尚远远不能满足人类战胜疾病、攻克肿瘤的需求，本领域仍需更特异、更有效的新的激酶作为药靶，从而有效拓宽治疗疾病的途径，增进人类的健康。
PAK7，又名PAK5，就是我们利用本公司已经建立的克隆平台而得到的一个新的功能未明的激酶。它具有完整的激酶域和GTPase结合域，属于丝/苏氨基酸激酶-PAK家族(p21-activated protein kinases，p21激活的蛋白酶，Paks)第二家族的成员。PAK家族在GTP存在下与RAC/CDC42 GTPase结合并被激活，有可能参与了细胞骨架动力的调节，与细胞增殖和细胞生存信号等有关。
但作为第二家族的PAK7与PAK4，PAK6一样，其激酶活性的调控有可能以不同与RAC/CDC42 GTPase方式调控，并且，PAK7在哺乳动物脑组织中高表达，而在其它多数组织中不表达，估计其参与神经树突的生长和发展。但对于PAK7是如何参与及行使这些功能，未见文献报道。
NFκB能够激活许多参与抗调亡，炎症和免疫反应的重要基因的表达。寻找能够调控NFκB信号传导的调控蛋白已成为当前发掘药物靶点的一个热点，包括Genentech、Amgen/Immunex和Tularik在内的几个美国最大的生物工程公司都在筛选调控NFκB信号传导途径的分子化合物。特别值得指出的是，利用NFκB对抗调亡基因的激活也可被利用于肿瘤的配合治疗(避免对正常组织细胞的损伤)。
发明内容
我们首次发现了PAK7能够很强的刺激NFκB的活性。PAK7有可能通过NFκB的信号通路调控某些基因的转录，从而抑制细胞的调亡和影响细胞骨架的形成，促进细胞的生长和发育。由于PAK7只在人脑组织中高表达，提示PAK7与脑组织细胞的生长、抗调亡、及功能信号传导密切相关，这一重要发现为彻底研究PAK7的功能乃至在此基础上开发新的药物靶点奠定了基础。
因此，本发明一方面涉及一种新颖的PAK7蛋白，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，它含有SEQ ID NO2所示的PAK7蛋白或其保守性变异多肽以及药学上可接受的载体。
另一方面，本发明涉及PAK7蛋白的用途，用于制备与NFκB通道有关的疾病的药物。在一实施例中，所述疾病为炎症或肿瘤。
另一方面，本发明涉及PAK7蛋白的用途，用于筛选通过其影响NFκB活性的物质。
在一方面，本发明涉及一种筛选通过PAK7蛋白影响NFκB表达的物质的方法，所述方法包括(1)在适合于PAK7表达的条件下，将PAK7转染入宿主细胞中，同时加入待测物，作为测试组；在同样条件下，将PAK7转染入宿主细胞中，不加入待测物，作为对照组A；在同样条件下，将待测物加入宿主细胞中，作为对照组B；(2)观察各组中NFκB活性的变化，测试组NFκB活性在统计学上明显高于对照组A和对照组B的活性的，表明该测试物通过PAK7刺激了NFκB的表达，为激动剂；测试组NFκB活性在统计学上明显低于对照组A和对照组B的，表明该待测物通过PAK7抑制了NFκB的表达，为拮抗剂。
在一优选实施例中，所述宿主细胞为293T细胞。
在另一优选实施例中，所述方法还包括，观察未转染PAK7也未加入待测物的宿主细胞中NFκB的表达情况，作为空白对照组。
在一优选实施例中，本发明方法的步骤(2)是通过观察荧光素酶的表达而实现，所述荧光素酶处于NFκB转录因子的控制之下。
在另一实施例中，使用加入具有K478A突变的PAK7突变体作为另一对照组。
图1显示PAK7的激酶域的ATP结合位点K478变成A经突变改造后的表达。与野生型(wt)表达一样正常。
图2显示对人PAK7的编码区与小鼠基因序列进行同源性对比的结果，其同源性达94％。图中，“Homo Sapiens”指人的PAK7编码区，而“mus musculus”指小鼠的基因序列。
图3显示PAK7在293t细胞中对NFκB活性的影响。图中“mock”指阴性对照，纵坐标“LUC”表示荧光素酶活性。
具体实施例方式
PAK7蛋白及其编码序列如SEQ ID NO2和1所示。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括PAK7的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然PAK7相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“PAK7”指具有PAK7活性的SEQ ID NO2序列的多肽。该术语还包括具有与PAK7相同功能的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括PAK7的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与PAK7的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗PAK7的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含PAK7或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了PAK7的可溶性片段。通常，该片段具有PAK7序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供PAK7或多肽的类似物。这些类似物与天然PAK7的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“PAK7保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码PAK7的多聚核苷酸。
本发明的PAK7核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或PAK7编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的PAK7。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码PAK7的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，PAK7多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含PAK7编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本发明还提供了一种药物组合物，它包括本发明的PAK7蛋白或其编码序列，以及药学上可接受的载体。当给予该药物组合物时，可增强NKκB的表达，从而实现抑制细胞凋亡、影响细胞骨架形成、促进细胞的生长和发育等目的。
可将药用组合物制备成各种剂型，如粒剂、片剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。
另外，本发明的药物组合物的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。
通常，给药的常规和药学上可接受的途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径。
药物组合物可以单剂量或多剂量给予。给予的剂量应足以引起足够的NFκB活性的表达。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例实施例1.PAK7基因的获得我们从已建立的由Genebank中的EST序列合成、没有任何功能注释或注释不完全的“新”基因的cDNA文库中，应用现代生物信息学PFAM/Profile模式对磷酸激酶、磷酸酶、蛋白酶、单过膜受体进行优先筛选，得到一个没有功能注释的基因，含有磷酸激酶结构域，为PAK7。为了获得PAK7基因的全长，我们设计了如下引物，以人体组织混合RNA为模板，通过常规PCR方法进行扩增。
上游引物(SEQ ID NO3)5’ACGCTGGCCAATCCGGCCATGTTTGGGAAGAAAAAGAAAAAGATTGAAATATCTGG 3’下游引物(SEQ ID NO4)5’ACGCTGGCCTCTAACGGCCTCAGTGATGCCTGTATTGTCTCATGAGGGG 3’该对引物含有SfiI穿梭克隆位点、起始密码子和终止密码子，在该酶切位点之间是PAK7的编码序列。利用该对引物PCR扩增获得了一个大小约为2.1kb的条带，将此片断回收、克隆入载体后测序得到PAK7基因的全长序列，共2160bp。
实施例2.PAK7及无激酶活性形式的蛋白表达实施例1所获得的2160bp的序列如SEQ ID NO1所示，其中第1-2157位为PAK7基因的完整编码区，编码一个由719个氨基酸组成的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。根据序列分析，将激酶结构域ATP结合位点K478变成A(本文也表示为K478A)，使其丧失激酶活性(为进一步研究功能做基础，采用设计突变引物，经过PCR，亚克隆获得)通过瞬时转染(磷酸钙，常规方法，见分子克隆)在哺乳动物细胞中表达(见图1)常规的Western-Blot检测其表达。将人的编码区与小鼠基因序列进行同源性比对，同源性达94％(图2)(Bioedit Sequence Alignment Editor)。
实施例3.PAK7基因的功能鉴定利用报告基因系统研究在293T细胞中过量表达PAK7基因的野生型或ATP结合位点突变型。将含有NFκB的结合位点的荧光素酶基因的质粒(NFκB-Luc)与PAK7、PAK7ATP结合位点突变型共转染至293T细胞中(fugen 6脂质体转染试剂(得自Roche)，DNA∶脂质体＝1∶5)，其荧光素酶的活性可以在转染24小时后得到。细胞裂解后加入荧光素酶底物，进行检测。每组实验数据独立重复三次以上以求得平均值。结果在293T细胞中转染PAK7基因对的NFκB活性有影响。
结果显示在图3中。图中显示，野生型PAK7能极大地刺激NFκB的活性，而突变形式则没有刺激NFκB的活性。
实施例4.筛选通过PAK7蛋白影响NFκB表达的物质将PAK7转染至含有NFκB-Luc稳定表达的293T细胞中，以一定细胞数量(1-2×105)铺板(96孔板)，将待测药物以一定浓度梯度加到细胞中孵育，比照对照组，上流式细胞仪分析结果。可通过荧光酶(luciferase)荧光的强弱评估药物对293T细胞活化水平的高低，并与转染了PAK7但不加入待测物的宿主细胞，以及仅加入待测物的宿主细胞在相同条件下的活性水平相比，找出PAK7-NFκB通路中的促进剂或抑制剂。
序列表<110>上海睿星基因技术有限公司<120>NFκB信号通路的重要调控蛋白PAK7<130>054240<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2160<212>DNA<213>PAK7蛋白的编码序列<400>1atgtttggga agaaaaagaa aaagattgaa atatctggcc cgtccaactt tgaacacagg 60gttcatactg ggtttgatcc acaagagcag aagtttaccg gccttcccca gcagtggcac 120agcctgttag cagatacggc caacaggcca aagcctatgg tggacccttc atgcatcaca 180cccatccagc tggctcctat gaagacaatc gttagaggaa acaaaccctg caaggaaacc 240tccatcaacg gcctgctaga ggattttgac aacatctcgg tgactcgctc caactcccta 300aggaaagaaa gcccacccac cccagatcag ggagcctcca gccacggtcc aggccacgcg 360gaagaaaatg gcttcatcac cttctcccag tattccagcg aatccgatac tactgctgac 420tacacgaccg aaaagtacag ggagaagagt ctctatggag atgatctgga tccgtattat 480agaggcagcc acgcagccaa gcaaaatggg cacgtaatga aaatgaagca cggggaggcc 540tactattctg aggtgaagcc tttgaaatcc gattttgcca gattttctgc cgattatcac 600tcacatttgg actcactgag caaaccaagt gaatacagtg acctcaagtg ggagtatcag 660agagcctcga gtagctcccc tctggattat tcattccaat tcacaccttc tagaactgca 720gggaccagcg ggtgctccaa ggagagcctg gcgtacagtg aaagtgaatg gggacccagc 780ctggatgact atgacaggag gccaaagtct tcgtacctga atcagacaag ccctcagccc 840accatgcggc agaggtccag gtcaggctcg ggactccagg aaccgatgat gccatttgga 900gcaagtgcat ttaaaaccca tccccaagga cactcctaca actcctacac ctaccctcgc 960ttgtccgagc ccacaatgtg cattccaaag gtggattacg atcgagcaca gatggtcctc 1020agccctccac tgtcagggtc tgacacctac cccaggggcc ctgccaaact acctcaaagt 1080caaagcaaat cgggctattc ctcaagcagt caccagtacc cgtctgggta ccacaaagcc 1140accttgtacc atcacccctc cctgcagagc agttcgcagt acatctccac ggcttcctac 1200ctgagctccc tcagcctctc atccagcacc tacccgccgc ccagctgggg ctcctcctcc 1260gaccagcagc cctccagggt gtcccatgaa cagtttcggg cggccctgca gctggtggtc 1320agcccaggag accccaggga atacttggcc aactttatca aaatcgggga aggctcaacc 1380ggcatcgtat gcatcgccac cgagaaacac acagggaaac aagttgcagt gaagaaaatg 1440gacctccgga agcaacagag acgagaactg cttttcaatg aggtcgtgat catgcgggat 1500taccaccatg acaatgtggt tgacatgtac agcagctacc ttgtcggcga tgagctctgg 1560gtggtcatgg agtttctaga aggtggtgcc ttgacagaca ttgtgactca caccagaatg 1620aatgaagaac agatagctac tgtctgcctg tcagttctga gagctctctc ctaccttcat 1680aaccaaggag tgattcacag ggacataaaa agtgactcca tcctcctgac aagcgatggc 1740cggataaagt tgtctgattt tggtttctgt gctcaagttt ccaaagaggt gccgaagagg 1800aaatcattgg ttggcactcc ctactggatg gcccctgagg tgatttctag gctaccttat 1860gggacagagg tggacatctg gtccctcggg atcatggtga tagaaatgat tgatggcgag 1920cccccctact tcaatgagcc tcccctccag gcgatgcgga ggatccggga cagtttacct 1980
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<210>3<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>4acgctggcct ctaacggcct cagtgatgcc tgtattgtct catgagggg 49
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于，它含有SEQ ID NO2所示的PAK7蛋白或其保守性变异多肽以及药学上可接受的载体。
2.PAK7蛋白的用途，其特征在于，用于制备与NFκB通道有关的疾病的药物。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述疾病为炎症或肿瘤。
4.PAK7蛋白的用途，其特征在于，用于筛选通过该PAK7蛋白影响NFκB活性的物质。
5.一种筛选通过PAK7蛋白影响NFκB表达的物质的方法，其特征在于，所述方法包括(1)在适合于PAK7表达的条件下，将PAK7转染入宿主细胞中，同时加入待测物，作为测试组；在同样条件下，将PAK7转染入宿主细胞中，不加入待测物，作为对照组A；在同样条件下，将待测物加入宿主细胞中，作为对照组B；(2)观察各组中NFκB活性的变化，测试组NFκB活性在统计学上明显高于对照组A和对照组B的活性的，表明该测试物通过PAK7刺激了NFκB的表达，为激动剂；测试组NFκB活性在统计学上明显低于对照组A和对照组B的，表明该待测物通过PAK7抑制了NFκB的表达，为拮抗剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，观察未转染PAK7也未加入待测物的宿主细胞中NFκB的表达情况，作为空白对照组。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)是通过观察荧光素酶的表达而实现，所述荧光素酶处于NFκB转录因子的控制之下。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，使用加入具有K478A突变的PAK7突变体作为另一对照组。
10.一种PAK7蛋白，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及NFκB信号通路的重要调控蛋白，尤其涉及一种筛选通过影响NFκB信号通路而抑制细胞凋亡、影响细胞骨架形成、促进细胞的生长和发育的方法。
文档编号G01N33/68GK1923276SQ20051002934
公开日2007年3月7日 申请日期2005年9月2日 优先权日2005年9月2日
发明者秦燕, 孙筱清, 罗楹, 吴骏 申请人:上海睿星基因技术有限公司