子宫颈癌的筛选方法

专利名称：子宫颈癌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及对于由活体采取的宫颈部细胞群的检体能够检测扁平上皮癌及其前癌状态、腺癌及其前癌状态的有无的宫颈癌诊断试剂、以及使用该诊断试剂的子宫颈癌的筛选方法、以及对腺癌和扁平上皮癌进行自动判定的自动诊断方法。
背景技术：
作为用于子宫颈癌早期发现的筛选方法，在健康诊断等中可有效利用细胞诊断。
其中，子宫颈癌的细胞诊断可以通过用棉签或刮板等擦过子宫颈部表面，然后将擦出的细胞直接涂到载玻片上制成标本，通过显微镜等观察来进行诊断。通过用显微镜观察细胞形态进行的诊断实际情况是细胞检查人员要对每一检体进行诊断，在精密度、处理速度方面需要改善。
近年来，对细胞检体进行自动检查，判断癌细胞有无的装置已经上市。该自动判别装置是将含有子宫颈部细胞的检体涂到载玻片上制作涂片标本，通过帕帕尼古劳染剂对标本的细胞核和细胞质进行染色，由对标本细胞进行形态图像处理的形态信息判别癌细胞的有无。然而，该自动细胞判别装置的性能其正常细胞的排除效率为25％，处理速度为8～10个检体/小时左右。这样的精密度、处理速度对于通过健康诊断判别癌有无的临床担当者来说，并不满意。
此外，还有不通过细胞形态观察，而通过对癌细胞特异的标志进行检测判断癌细胞有无的细胞诊断方法。
例如，在美国专利第5858683号(Keesee et al.)中提出了使用对作为子宫颈癌和其前癌状态特异标志的子宫颈癌相关蛋白质以及识别该蛋白的抗体的免疫分析。作为识别子宫颈癌相关蛋白质的抗体，已知有NMP179抗体。
在美国专利申请公开第2002/0106685号(Henning et al.)中提出了，不仅对子宫颈部涂片标本，而且对一个一个分散的细胞群的检体进行肿瘤细胞及其前体细胞的自动检测方法。该方法是对于癌细胞中的2种以上标志，通过使用对与标志特异反应的抗体或核酸探针实施荧光标记的试剂，对与上述标志结合的试剂的荧光信号的有无进行自动测定，检测癌细胞有无的方法。作为标志如her2/neu、p16、p53、MN、mdm-2、bcl-2、EGF受体、以及HPV6、11、16、18、30、31、33、34、35、45、51以及52。
子宫颈癌主要分为扁平上皮癌和腺癌，以及它们的前癌状态，在近年来的健康诊断中，期盼检出的癌细胞能够诊断出是否是扁平上皮癌、腺癌中的任一种的筛选方法。
但是，由于美国专利申请公开第2002/0106685号中使用的标志是一般癌细胞的标志，所以即使能够判断癌细胞的有无，也不能判断到子宫颈癌的种类。美国专利第5858683号中公布的标志虽然是子宫颈癌特异的标志，但由于是对扁平上皮癌与腺癌通用的标志，所以仍然不能获得判别到癌的种类的信息。
另外，据报道NMP179抗体可与一部分正常细胞反应(ActaCytologica，Volume 43，Number6/November-December19991015-1021)，性能上并不能满足需要。

发明内容
本发明是鉴于上述事实而形成的发明，其目的在于不仅提供判别子宫颈癌的有无，而且能够区别扁平上皮癌、腺癌的子宫颈癌的诊断试剂以及使用这些试剂的子宫颈癌的筛选方法、以及通过利用流式细胞计可进行高速处理的子宫颈癌的筛选方法。
根据本发明第1个观点的子宫颈癌筛选方法是通过使可彼此分辨的标记物质标记的、与腺系细胞反应的第1标记抗体、与腺癌细胞反应的第2标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3标记抗体与子宫颈部细胞反应后，制备测定用样品，对来自与上述子宫颈部细胞结合的上述各个标记抗体的标记分别进行检测，根据被检测出的标记判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的方法。
根据本发明第2个观点的子宫颈癌的筛选方法是通过向使可彼此分辨的荧光标记的、与腺系细胞反应的第1荧光标记抗体、与腺癌细胞反应的第2荧光标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3荧光标记抗体与子宫颈部细胞反应后制备的测定用样品照射激发光，对来自上述测定用样品发出的荧光进行检测，根据被检测的荧光判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的方法。
本发明的子宫颈癌诊断试剂包含可彼此分辨的荧光标记的、与腺系细胞反应的第1荧光标记抗体、与腺癌细胞反应的第2荧光标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3荧光标记抗体。
本发明的子宫颈癌的自动诊断方法是在上述本发明的第1以及第2个观点的筛选方法中自动判定有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的同时，当判定为腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的细胞对测定用样品中含有的细胞集合体的含有比例在规定值以上时，判断为腺癌或扁平上皮癌的方法。
根据本发明的第3个观点的子宫颈癌的筛选方法是通过使可彼此分辨的标记物质标记的、与腺系细胞反应的抗腺系细胞标记抗体以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的抗扁平上皮系异型细胞抗体与子宫颈部细胞反应，制备测定用样品，对来自与上述子宫颈部细胞结合的上述各标记抗体的标记分别进行检测，根据被检测的标记判别有无扁平上皮系异型细胞的方法。
另外，本发明的子宫颈癌筛选装置备有用于导入使可彼此分辨的荧光标记的、与腺系细胞反应的第1荧光标记抗体、与腺癌细胞反应的第2荧光标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3荧光标记抗体与子宫颈部细胞反应制备的测定用样品的流动池，用于向流过流动池内的测定样品中细胞照射激发光的光源，用于检测由被照射了激发光的上述细胞发出的第1荧光标记抗体的荧光的第1荧光检测器，用于检测由被照射了激发光的上述细胞发出的第2荧光标记抗体的荧光的第2荧光检测器，用于检测由被照射了激发光的上述细胞发出的第3荧光标记抗体的荧光的第3荧光检测器，以及对被检测的荧光进行解析、判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的解析部。还可备有用于检测散射光的散射光检测部，解析部也可再对被检测的散射光进行解析。另外还可备有摄像装置，解析部再对被摄像的图像进行解析。
本发明的子宫颈癌筛选方法考虑到腺细胞和扁平上皮细胞的各个特征之后，着眼于对各个细胞癌特异的标志，通过研究它们对各个抗体有无反应性，不用说能够判别癌细胞与正常细胞，而且由于能够对腺癌细胞与扁平上皮癌细胞、甚至他们的前癌状态进行区别、判定，所以可以有效地用于子宫颈癌种类判断所必需的诊断。另外还可使用流式细胞计，由此可以有效地进行子宫颈癌的筛选。
本发明的子宫颈癌的筛选方法由于高精密度、而且高效率，对子宫腺癌和/或扁平上皮癌的有无进行筛选，所以可用于在必须对大量检体进行处理的健康诊断等中进行的子宫颈癌的细胞诊断。


图1是用于说明本发明筛选方法的一种实施方式的流程图。
图2是表示适用于本发明筛选方法的流式细胞计的一个例子的构成方框图。
图3是用于说明作为本发明筛选方法原理的荧光参数分布图。
图4是用于说明本发明筛选方法的其他实施方式流程图。
图5是用于说明在本发明筛选方法中对细胞图像进行摄像时的实施方式流程图。
图6是表示备有摄像装置的流式细胞计的构成的一个例方框图。
图7是用于说明在本发明筛选方法中进行核染色时的实施方式流程图。
图8是在本发明筛选方法中用于说明对散射光参数进行计测时的应用例的荧光分布图(a)、侧方散射光分布图(b)以及前方散射光分布图(c)。
图9是在本发明筛选方法中用于说明核染色时的应用例的侧方散射光分布图(a)以及荧光分布图(b)。
图10是表示含有第1标记抗体的试剂与HeLa细胞、C33A细胞、或临床检体1、2的反应结果的荧光显微镜照片(400倍)。
图11是将HeLa细胞与含有第1标记抗体的试剂用于流式细胞计时得到的直方图。
图12是将C33A细胞与含有第1标记抗体的试剂用于流式细胞计时得到的直方图。
图13是将正常腺细胞与含有第1标记抗体的试剂用于流式细胞计时得到的直方图。
图14是将正常扁平上皮细胞与含有第1标记抗体的试剂用于流式细胞计时得到的直方图。
图15是表示含有第2标记抗体的试剂与HeLa细胞、C33A细胞、或临床检体1、2反应的结果的荧光显微镜照片(400倍)。
图16是将HeLa细胞与含有第2标记抗体的试剂用于流式细胞计时得到的直方图。
图17是将C33A细胞与含有第2标记抗体的试剂用于流式细胞计时得到的直方图。
图18是将正常腺细胞与含有第2标记抗体的试剂用于流式细胞计时得到的直方图。
图19是将正常扁平上皮细胞与含有第2标记抗体的试剂用于流式细胞计时得到的直方图。
图20是表示含有第3标记抗体的试剂与C33A细胞或正常腺细胞反应的结果的荧光显微镜照片(400倍)。
图21是将(a)正常腺细胞、(b)C33A细胞与含有第3标记抗体的试剂用于流式细胞计时得到的直方图。
图22是通过实施例2的方式得到的核染色荧光分布图以及侧方散射光分布图的合成分布图。
图23是通过实施例2的方式得到的N/C分布状态的分布图。
图24是在实施例3中，对来自子宫颈部腺癌细胞模型检体的第1荧光标记的荧光强度和前方散射光脉冲宽度进行测定后得到的二维分布图。
图25是在实施例3中，对来自子宫颈部腺癌细胞模型检体的第2荧光标记的荧光强度和前方散射光脉冲宽度进行测定后得到的二维分布图。
图26是在实施例3中，对来自子宫颈部腺癌细胞模型检体的第3荧光标记的荧光强度和前方散射光脉冲宽度进行测定后得到的二维分布图。
图27是在实施例3中，对来自子宫颈部扁平上皮癌细胞模型检体的第1荧光标记的荧光强度和前方散射光脉冲宽度进行测定后得到的二维分布图。
图28是在实施例3中，对来自子宫颈部扁平上皮癌细胞模型检体的第2荧光标记的荧光强度和前方散射光脉冲宽度进行测定后得到的二维分布图。
图29是在实施例3中，对来自子宫颈部扁平上皮癌细胞模型检体的第3荧光标记的荧光强度和前方散射光脉冲宽度进行测定后得到的二维分布图。
图30是在实施例3中，对来自子宫颈部正常扁平上皮细胞模型检体的第1荧光标记的荧光强度和前方散射光脉冲宽度进行测定后得到的二维分布图。
图31是在实施例3中，对来自子宫颈部正常扁平上皮细胞模型检体的第2荧光标记的荧光强度和前方散射光脉冲宽度进行测定后得到的二维分布图。
图32是在实施例3中，对来自子宫颈部正常扁平上皮细胞模型检体的第3荧光标记的荧光强度和前方散射光脉冲宽度进行测定后得到的二维分布图。
具体实施例方式
根据本发明第1个观点的子宫颈癌筛选方法是通过使以可彼此分辨的标记物质标记的与腺系细胞反应的第1标记抗体、与腺癌细胞反应的第2标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3标记抗体与子宫颈部细胞反应制备测定用样品，对来自与上述子宫颈部细胞结合的上述各标记抗体的标记分别进行检测，根据被检测的标记判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的方法。上述标记中至少一种优选荧光标记。
在上述筛选方法中，上述判别对于上述测定用样品中的细胞优选通过对第1标记抗体的第1标记进行检测的装置，判定该细胞对第1标记抗体的反应为阳性或阴性，对于判定为对上述第1荧光标记抗体为阳性的细胞通过对第2标记抗体的第2标记进行检测的装置，判定上述测定样品中的细胞对第2标记抗体的反应为阳性或阴性，对于判定为对上述第1荧光标记抗体为阴性的细胞通过对第3标记抗体的第3标记进行检测的装置，判定上述测定样品中的细胞对第3标记抗体的反应为阳性或阴性来进行。
根据本发明第2个观点的子宫颈癌筛选方法是通过向使以可彼此分辨的荧光标记的与腺系细胞反应的第1荧光标记抗体、与腺癌细胞反应的第2荧光标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3荧光标记抗体与子宫颈部细胞反应制备的测定用样品照射激发光，对来自上述测定用样品发出的荧光进行检测，根据被检测的荧光判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的方法。
在根据本发明第1个观点以及第2个观点的子宫颈癌筛选方法中，上述第1标记抗体的抗体优选选自MUC1抗体、细胞角蛋白7抗体、以及细胞角蛋白18抗体的至少一种，上述第2标记抗体的抗体优选选自细胞角蛋白8抗体和HIK1083抗体的至少一种，上述第3标记抗体的抗体优选选自NMP179抗体、p16INK4A抗体、Ki-67抗体、p53抗体、p21抗体、EMA抗体、CEA抗体以及MIB-1抗体的至少一种。
在根据第2个观点的子宫颈癌的筛选方法中，上述判别对于由上述测定用样品中细胞发出的荧光可以通过测定来自第1荧光标记的荧光强度判定该细胞对第1荧光标记抗体的反应为阳性或阴性，对于由判定对上述第1荧光标记抗体为阳性的细胞发出的荧光通过测定来自第2荧光标记抗体的荧光强度判定该细胞对第2荧光标记抗体的反应为阳性或阴性，对于由判定对上述第1荧光标记抗体为阴性的该细胞发出的荧光通过测定来自第3荧光标记抗体的荧光强度判定该细胞对第3荧光标记抗体的反应为阳性或阴性(第1判别方法)，或者使上述测定用样品流过流式细胞计的流动池，向流过流动池的上述测定用样品中的细胞照射激发光，对于由上述细胞发出的荧光分别计测来自第1荧光标记的荧光参数、来自第2荧光标记的荧光参数以及来自第3荧光标记的荧光参数，通过组合各荧光参数值也可以进行判别(第2判别方法)。
在上述第2判别方法中，上述荧光参数优选选自荧光强度、荧光脉冲宽度以及荧光脉冲面积。另外对有关上述测定用样品中细胞的散射光参数进行计测也可以判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞。此时，上述散射光参数优选选自前方散射光强度、前方散射光脉冲宽度以及侧方散射光脉冲宽度。
另外，采用上述第2判别方法时，做成以选自来自第1荧光标记的荧光参数、来自第2荧光标记的荧光参数以及来自第3荧光标记的荧光参数的一种荧光参数和上述散射光参数作为两个轴的二维分布图，也可以判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞。
或者在采用上述第2判别方法时，上述测定用样品中的子宫颈部细胞还可预先用可进行核染色的荧光色素染色，从子宫颈部细胞的来自核染色的荧光分布和由该子宫颈部细胞发光的来自核染色以外的发光分布以及前方散射光分布以及侧方散射光分布的比较，也可以判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞。
另外，采用上述第2判别方法时，上述流式细胞计也可以配备摄像装置，对于判定第3荧光标记抗体的反应为阳性的细胞，对细胞图像进行摄像。
本发明的子宫颈癌筛选方法，其中上述子宫颈部细胞也可以是分散为单细胞的细胞的集合体，在不采用第2判别方法时，上述子宫颈部细胞也可以是涂片标本上的细胞。
本发明的子宫颈癌诊断试剂包含以可彼此分辨的荧光标记的与腺系细胞反应的第1荧光标记抗体、与腺癌细胞反应的第2荧光标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3荧光标记抗体。上述第1标记抗体的抗体优选选自MUC1抗体、细胞角蛋白7抗体、以及细胞角蛋白18抗体的至少一种，上述第2标记抗体的抗体优选选自细胞角蛋白8抗体以及HIK1083抗体的至少一种，上述第3标记抗体的抗体优选选自NMP179抗体、p16INK4A抗体、Ki-67抗体、p53抗体、p21抗体、EMA抗体、CEA抗体以及MIB-1抗体的至少一种。
本发明的子宫颈癌自动诊断方法是在上述本发明的第1以及第2个观点的筛选方法中自动判定有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的同时，当判定为腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的细胞对测定用样品中含有的细胞集合体的含有比例在规定值以上时，判断为腺癌或扁平上皮癌的方法。
另外，根据本发明的第3个观点的子宫颈癌筛选方法是通过使以可彼此分辨的标记物质标记的与腺系细胞反应的抗腺系细胞标记抗体以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的抗扁平上皮系异型细胞抗体与子宫颈部细胞反应制备测定用样品，对来自与上述子宫颈部细胞结合的上述各标记抗体的标记分别进行检测，根据被检测的标记判别有无扁平上皮系异型细胞的方法。与腺系细胞反应的标记抗体的抗体优选选自MUC1抗体、细胞角蛋白7抗体、以及细胞角蛋白1 8抗体的至少一种，与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的标记抗体的抗体优选选自NMP179抗体、p16INK4A抗体、Ki-67抗体、p53抗体、p21抗体、EMA抗体、CEA抗体以及MIB-1抗体的至少一种。
以下对本发明进一步详细说明。
首先，就本发明的子宫颈癌筛选方法中使用的子宫颈癌诊断试剂进行说明。
本发明的子宫颈癌诊断试剂包含与腺系细胞反应的第1抗体、与腺癌细胞反应的第2抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3抗体，各个抗体都用可相互可识别的标记物质进行了标记。
作为与腺系细胞反应的第1抗体使用从MUC1抗体、细胞角蛋白7抗体、以及细胞角蛋白18抗体中选出的至少一种。
其中，所谓MUC1抗体是与细胞表面粘液反应的抗体。与腺细胞产生粘液相反，由于扁平上皮细胞不产生粘液，所以通过与MUC1抗体有无反应可以辨别细胞内含有粘液的腺细胞和不含有粘液的扁平上皮细胞。
细胞角蛋白7抗体、细胞角蛋白18抗体分别是与细胞角蛋白7、细胞角蛋白18特异反应的抗体。所谓细胞角蛋白是细胞质内纤维状结构物之一，属于形成其中中间径纤丝的蛋白质群。细胞角蛋白7、18存在于包括腺细胞的多种上皮细胞中，但在扁平上皮细胞中很少。另外细胞角蛋白7、18既存在于良性肿瘤，也存在于恶性肿瘤中，但在扁平上皮癌中非常少。因此，细胞角蛋白7、18抗体对于区别腺细胞系细胞是有用的。
作为与腺癌细胞反应的第2抗体，使用细胞角蛋白8抗体和HIK1083抗体中的至少一种。
所谓细胞角蛋白8抗体是与细胞角蛋白8特异反应的抗体。细胞角蛋白8除了腺癌细胞含有外，扁平上皮癌细胞、正常的腺细胞、扁平上皮细胞中也含有，但其含量在腺癌细胞中要多得多。因此，细胞角蛋白8抗体由于在正常细胞、扁平上皮癌细胞、腺癌细胞中，优先与腺癌细胞特异性结合，所以可以检测出腺癌细胞。
HIK1083抗体是与胃的腺粘液细胞产生、分泌的粘蛋白反应的抗体，已知使用该抗体的免疫染色在子宫颈部腺癌中特别是恶性腺瘤为阳性(Ishii K等人，Cancer 1999年；74(3)245-253)。
作为上述第3抗体优选使用选自NMP179抗体、p16INK4A抗体、Ki-67抗体、p53抗体、p21抗体、EMA抗体、CEA抗体以及MIB-1抗体中的至少一种。
所谓NMP179抗体是识别与子宫颈癌相关的核基质抗原的单克隆抗体，是对子宫颈部的前癌状态的扁平上皮内损伤(squamousintraepithelial lesions)的初期发现有用的标志，对于发现高度的扁平上皮内疾病(HSIL)以及轻度的扁平上皮内疾病是有用的。
p16INK4A蛋白质已知可以通过HPV的E7蛋白质诱导表达，子宫颈癌由于人体乳头瘤病毒(HPV)感染发病情况非常高，所以作为子宫颈癌的细胞诊断标志，使用p16INK4A抗体进行了很多研究(Bibbo M等人，ActaCytol.2002年；46(1)25-29、Klaes R等人，Int.J.Cancer、2001年；92276-285)。
Ki-67蛋白质由于在增殖中的细胞中表达亢进，所以Ki-67抗体可用于肿瘤增殖的监测。也有一些在有关子宫颈部细胞诊断的研究中使用Ki-67抗体的报道。MIB-1抗体是Ki-67抗体的一种亚型(PirogEC等人，2002年，26(1)70-75、Pesnick M等人，Hum.Pathol.1996年；27(3)234-239)。
p53蛋白质虽然具有抑癌作用，但如果其结构产生变异，就失去抑癌作用。因此变异型p53抗体广泛用作癌的标志物。也有对子宫颈癌细胞诊断也使用变异型p53抗体的研究(Maeda MY.等人，Pathologica，2001年；93(3)189-195、Kerstens HM等人，J.Histochem.Cytochem.2000年；48(5)709-718)。
p21、p27蛋白质与p53、p16INK4A等同样是细胞周期相关蛋白质，在癌细胞中表达亢进在各种癌中已被证实。因此包括子宫颈癌在内的癌症使用p21抗体作为标志的研究已有很多报道(van de Putte G等人，Gynecol.Oncol.2003；89(1)140-147、Graflund M等人，Int.J.Gynecol.Cancer，2002；12(3)290-298)。
EMA由于是肿瘤细胞特异的膜蛋白，所以已有一些用作子宫颈部腺癌细胞诊断的标志的研究报告(Sincock AM等人，J.Clin.Pathol.1983年；36(5)535-538、Moncrieff D等人，Acta.Cytol.1984年；28(4)407-410)。
CEA蛋白质由于在癌细胞中表达很多，作为子宫颈癌细胞诊断的标志，使用CEA抗体的研究报告也有很多(Bamford PN.等人，Obstet.Gynecol.1983年；61(5)603-608)。
本发明中使用的抗体无论哪一个只要是具有与作为反应对象的标志结合的结合部位的抗体都可以，Fc片段结构、Fab恒定区等没有特别限制，可以使用市场销售产品。例如，作为MUC1抗体可以使用ExaphaBiologicals Inc.的Anti-MUC1抗体，作为细胞角蛋白8抗体，可以使用Daco公司销售的“抗细胞角蛋白8、35H11小鼠单克隆抗体”。NMP179抗体是Matritech公司产品。
p16INK4A抗体、Ki-67抗体、p53抗体、p21抗体、p27抗体、CEA抗体无论哪一种都是由Daco公司销售的产品。MIB-1抗体可以从Immunotech公司获得。
本发明的诊断试剂含有第1抗体、第2抗体、第3抗体，作为溶剂优选含有生理盐水、磷酸系或Tris-HCl系缓冲液、表面活性剂等，具体来说，作为溶剂可以使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)和Tween系或Triton系表面活性剂的混合液。
诊断试剂中含有的第1抗体、第2抗体、第3抗体被各个可识别的标记物质标记。标记可以直接通过使标记化合物结合在各个抗体上进行(直接法)，以上述抗体作为非标记的一次抗体，也可通过与该一次抗体分别特异的标记二次抗体结合间接地进行标记(间接法)。
当上述各个抗体来自同种动物时，为了避免由于交叉反应引起的误判，优选通过直接法进行标记。在使用来自不易引起交叉反应的异种类动物的抗体时，也可以用使用二次抗体的间接法进行标记。
在本发明中可以使用的标记化合物没有特别限定，可以使用Cy3(Amersham Life Science公司的注册商标)等花青系色素、异硫氰酸荧光素(FITC)、别藻蓝素、若丹明、量子点等荧光物质；金粒子等光散射物质；铁氧体等吸光物质；125I等放射性物质；过氧化物酶、碱性磷酸酶等的酶等以往众所周知的标记化合物。其中，从可以对本发明中使用的3种抗体(第1抗体、第2抗体、第3抗体)的标记进行简易区别考虑，优选能发光的荧光波长不同的荧光色素标记抗体。例如，优选使用通过用发红光(例如，PE-Cy5)的染料标记第1抗体、用发绿光(例如Alexa488、FITC)的染料标记第2抗体、用发橙色光(例如PI、APC)的染料标记第3抗体的3种颜色进行识别。
提供给本发明筛选方法的测定用样品制备如下。
首先向要筛选的子宫颈部细胞添加含有第1标记抗体、第2标记抗体、第3标记抗体的本发明的子宫颈癌诊断试剂，反应规定时间制备测定用样品。
作为子宫颈部细胞可以是分散成单细胞的细胞的集合体，也可以是涂片标本上的细胞。为了适用处理速度高的流式细胞计，优选使用分散成单细胞的细胞的集合体。
供于测定用样品制备的子宫颈部细胞可以直接用用棉签或刮板等擦过子宫颈部表面时采取的子宫颈部细胞群，也可以是预先进行除粘液处理后与本发明的子宫颈癌诊断试剂反应的细胞。在用棉签或刮板等擦过子宫颈部表面时采取的子宫颈部细胞群中由于含有分泌粘液的腺细胞，有时由于粘液而与试剂中含有的抗体反应进行得不充分，预先除去粘液可以防止这种情况发生。特别是使用流式细胞计时，由于因粘液导致的凝集状态的细胞块不适用流式细胞计，所以优选除去粘液。
作为除去粘液的方法没有特别限定，例如优选用本发明人提出的半胱氨酸系化合物进行处理。作为半胱氨酸化合物，可以使用甲基半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸、L-半胱氨酸等。
使用流式细胞计时，优选除去粘液后，使其分散为单个细胞，再进行分散处理。因为仅靠上述除去粘液处理有时难于完全分散为一个一个的细胞。在本发明的筛选方法中，当进行下面讲到的细胞图像的摄像时，必须在不破坏细胞形态下进行分散处理。作为不破坏细胞形态而进行分散处理的方法，例如象本发明人在特愿2003-359336号提出的那样，优选用醛化合物进行细胞稳定化处理后，再用蛋白水解酶进行处理。因为如果不进行稳定化处理而直接用蛋白水解酶处理，细胞本身会被破坏。作为醛化合物可以使用多聚甲醛、甲醛、戊二醛或它们的混合物。
作为用于细胞分散的蛋白水解酶，如胰蛋白酶、链霉蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶等，其中优选使用胶原酶。如果使用消化力弱的酶，由于可以在比较宽的范围内决定分散所需要的时间，所以由于各个检体个体差异不同引起的适合的消化时间的差异就不成问题。
子宫颈癌细胞与诊断试剂的反应条件没有特别限定，优选在室温下进行1～30分钟左右，为了提高反应效率，优选进行振荡等。
另外，在与诊断试剂进行反应之前，优选预先对检体的非特异蛋白质进行封闭。作为封闭的试剂，优选使用将牛血清蛋白、对照血清或酪蛋白等用生理盐水等稀释后的溶液。
关于测定用样品的制备，进行封闭反应后与诊断试剂反应，再与二次抗体反应时，优选在二次抗体反应后进行适当洗涤。
本发明筛选方法是使用上述制备的测定用样品，判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的方法。该方法的原理根据对第1抗体、第2抗体、第3抗体各个抗体有无反应。即，将测定用样品与作为对象的抗体反应的情形作为阳性(+)，没有反应的情形作为阴性(-)，对第1抗体、第2抗体、第3抗体的阳性和/或阴性进行判定，就象表1所表示的那样，由他们的组合进行分类。对第1抗体、第2抗体、第3抗体都表示出阳性的细胞被分为组I(腺癌细胞)，对第1抗体和第3抗体表示出阳性，而对第2抗体显阴性的细胞被分在组II(扁平上皮化生细胞、腺细胞)，对第1抗体和第2抗体中的任一个都显阴性，而对第3抗体表现出阳性的细胞被分在组III(异型细胞、扁平上皮癌细胞、基底细胞层的扁平上皮细胞)，对第1抗体、第2抗体、第3抗体都显阴性的细胞被分在组IV(表层、中层的扁平上皮细胞)。
表1


本发明筛选方法对于第1标记抗体、第2标记抗体、第3标记抗体与子宫颈部细胞反应制备的测定用样品，根据各个抗体的标记研究对各个抗体有无反应，也可以判定属于上述表1所示分类中的哪一种，也可以根据图1所示的流程图进行判定。
即，首先判别对第1抗体有无反应(步骤#1)，如果是阳性，判别对第2抗体有无反应(步骤#2)，如果对第1抗体是阴性，判别对第3抗体有无反应(步骤#3)。按照这样的顺序，可以判定是否含有分类在I～IV任一个组的细胞。
有无反应根据与各个抗体结合的标记进行判定。例如，当使用荧光标记时，对测定用样品照射激发光，由测定用样品发出的荧光可以检测出来源于哪一个荧光标记的荧光。例如，可以通过用显微镜对发出的荧光颜色进行观察对各个抗体的阳性或阴性进行判定，也可以通过发出的荧光的频率光谱研究来自哪一个标记发出的荧光。另外也可以通过特定的带通滤波器后，通过测定通过滤波器的荧光强度研究由哪一个标记抗体发出的荧光。
作为供测定用的子宫颈部细胞，使用分散为单细胞的细胞的集合体时，可以利用流式细胞计进行筛选。使用流式细胞计进行筛选时，作为各个抗体的标记，优选使用荧光物质。
例如，通过使用具有图2所示构成的流式细胞计，可以知道通过流动池的细胞与哪一个荧光标记抗体反应。
在图2所示的装置30中，首先带有488nm振荡波长的蓝色激光(Ar离子激光)和带有635nm振荡波长的红色激光(半导体激光)在光合束器1混合，生成激发光。生成的激发光经过集光透镜2，调整为具有短径10μm、长轴为100μm左右的扁平的激光束轮廓，照射到流动池。由集光透镜2射出的激发光经流动池，于光阑3成像，一次光在这里被遮挡。通过细胞散射的光经滤光片4(中心波长488nm，通过波长10nm的干涉滤光片)除去细胞发出的荧光，由前方散射光的检测器11(FSC二极管)看，收集到数度的立体角的散射光，在前方的散射光检测器11被检出。
另外，由细胞发出的荧光被带有配置在流动池侧方的高数值孔径(NA)的集光透镜5收集。经集光透镜5出射的光首先通过具有通过比560nm更短的波长光的性质的分色镜(DM560SP)。通过该分色镜的光被具有90∶10分割比的分光镜分割，具有10％分割比的光经中心波长530nm、通过波长30nm的干涉滤光片6，入射到FL1的检测器12(光电倍增管PMT)，在那里可以检测绿色荧光。而带有90％分割比的光经中心波长488nm、通过波长10nm的干涉滤光片7，入射到SSC的检测器13(光电倍增管PMT)，在那里可以检测侧方散射光。然后，通过分色镜(DM560SP)反射的光通到具有通过比640nm更长波长的光性质的分色镜(DM640LP)。具有560nm以上，小于640nm波长的荧光被该分色镜反射，经过中心波长585nm、通过波长42nm的干涉滤光片8，入射到FL2的检测器14(光电倍增管PMT)，在那里检测出橙色荧光。具有640nm以上波长的荧光被半反射镜分割为50∶50，一方经过中心波长661nm、通过波长16nm的干涉滤光片9，入射到FL4的检测器15(光电倍增管PMT)，在那里检测出红色荧光。另一方经过具有670nm以上的通过波长的干涉滤光片10，入射到FL3的检测器16(光电倍增管PMT)，在那里检测出长红色荧光。在本发明中，只要使用上述4种荧光中的至少3种就可以。
上述被检测到的前方散射光、侧方散射光、绿荧光、橙荧光、红荧光以及长红色荧光各个信号被送到解析部20，就输入的各个信号进行如下所述的各种要进行的解析，结果表示在表示部21。
使使用各个抗体被荧光标记的诊断试剂制备的测定用样品流过上述的可进行多色解析的流式细胞计流动池，对通过流动池的一个一个的细胞照射具有数百μm×数μm左右的扁平的强度轮廓的激发光(例如，在图2装置中来自激光光源的蓝色和/或红色激光)，对于由通过其感知区域的细胞发出的荧光分别计测来自第1荧光标记的荧光参数、来自第2荧光标记的荧光参数、来自第3荧光标记的荧光参数。通过图2的装置可以根据荧光种类不同，利用FL1～FL4中任一个可以检出来自各个标记抗体的荧光，算出所期望的荧光参数值。
其中，作为荧光参数，优选使用选自荧光强度、荧光脉冲宽度以及荧光脉冲面积中的一种参数或他们的组合。所谓荧光强度是细胞荧光分布的最大值。所谓荧光脉冲面积是对荧光分布进行积分的值。所谓荧光脉冲宽度指的是荧光脉冲超过指定阈值的时间。
利用流式细胞计对流过流动池的一个一个的细胞的荧光进行检测，通过以时间作为横轴、荧光强度等荧光参数作为纵轴的荧光分布图，对于各个细胞可以判定对第1抗体、第2抗体、第3抗体有无反应性。根据判定结果，按照表1或图1所示的流程图，可以判定各个细胞属于组I～IV中的哪一个组。另外，对于测定用样品中含有的细胞集团，通过对对应于各个标记抗体的各个荧光参数值做成对细胞数计数的直方图，可以判定作为测定用样品中含有的细胞集团，即在1检体中包含于腺癌细胞(组I)、扁平上皮癌细胞(组III)中的细胞存在的程度。
另外不仅对于第1标记抗体、第2标记抗体、第3标记抗体的各个荧光标记可以依次进行判断，例如在将源于第1荧光标记抗体的荧光参数作为X轴、源于第2荧光标记抗体的荧光参数作为Y轴、源于第3荧光标记抗体的荧光参数作为Z轴的三维座标系中，在相当于计测的第1、第2、第3荧光标记抗体的荧光参数值的位置画图，可以根据被画在图3(a)～(d)所示的3维空间的哪一部分，一次性判别属于组I～组IV中的哪一组。此时，就测定用样品中含有的细胞集团整体、即1个检测样本画点，通过判别图3(a)～(d)所示的3维空间的哪一部分的点密度高，也可以获得在作为细胞集团的检体中的腺癌细胞(组I)和/或扁平上皮癌细胞(组III)含有的细胞存在程度的解析结果。
如上所述，通过使用流式细胞计，对于各个细胞通过对第1抗体、第2抗体、第3抗体各个抗体的阳性或阴性进行判别，判断测定样品中是否含有腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞。另外，通过研究相当于各个检体的一个测定用样品中含有的所有细胞的荧光参数值的分布状态，可以知道属于组I～IV的细胞的存在程度。
另外，关于相当于供用于流式细胞计的一个检体的一个测定样品的测定结果的解析，除了表示荧光参数和细胞数关系的频率直方图和图3的三维座标曲线图之外，也可以使用用等高线将事件频率的相同要素连接起来的二维等高曲线，使用Z轴的等积曲线、以及使用多个参数的菱形表示等，利用众所周知程序的种种表示方法，解析方法。另外对于曲线也可以利用适当的检出闸(gating)、检测窗(window)进行处理。
在将本发明筛选方法用于流式细胞计时，除源于标记的荧光外，也优选将由通过流动池中感知区域的细胞产生的散射光一并计测。利用图2所示的装置可以通过FSC二极管检出前方散射光，利用SSC检测器检出侧方散射光。
对于通过流动池的细胞，通过计测荧光参数和散射光参数，可以获得该细胞的更详细信息，可以排除由于细胞残渣引起的假阳性反应。细胞残渣因为有时对第3抗体为阳性，所以如果只靠荧光参数的判别，就被分在组III了。在对测定样品、即细胞的集合体做成分布图时，由于细胞残渣缘故，组III的曲线数增加，可能引起与扁平上皮癌细胞的误诊判断，所以源于细胞残渣的假阳性反应的排除在本发明筛选方法以及下面叙述的本发明的子宫颈癌自动诊断方法中都有意义。
作为散射光参数，可以使用选自作为反映细胞大小的参数的前方散射光强度(FSCP)、前方散射光脉冲宽度(FSCW)、以及侧方散射光脉冲宽度(SSCW)中的至少一种。另外，作为反映细胞内结构的复杂性的参数，也可以使用侧方散射光脉冲高度(SSCP)。
其中所谓脉冲宽度相当于对于单一细胞流过流动池中感知区域期间的计测值，以通过时间作为横轴，散射光(前方散射、侧方散射)强度作为纵轴做成散射光的分布图时显示脉冲部分的时间，即相当于一个细胞通过时间。
图4表示对反映细胞大小的散射光参数以及荧光参数进行计测，除去测定样品中含有的细胞残渣的本发明筛选方法的一种实施方式。
在图4表示的方式中，对于流过流动池的细胞，计测反映荧光参数以及细胞大小的散射光参数，在步骤#1判定对第1标记抗体有无反应，对于判定对第1标记抗体为阳性的细胞判定对第2标记抗体有无反应(步骤#2)。另外对于判定对第1标记抗体为阴性的细胞，判定对第3标记抗体有无反应(步骤#3)，对于对第3标记抗体判定为阳性的细胞，在步骤#4中做成以荧光参数和散射光参数作为两个轴的二维分布图，由此时的曲线位置判定是否是细胞残渣。对于第3抗体的荧光强度高，判断散射光参数值偏离细胞大小时(图4中用“-”表示)，判定为细胞残渣，在其他情况(图4中用“+”表示)，判定为分类在组III的细胞。
另外，通过计测作为散射光参数、反映细胞内结构的复杂性的参数的侧方散射光脉冲高度(SSCP)，做成侧方散射光脉冲高度(SSCP)与荧光参数的二维分布图，可以了解异型细胞的出现频率。即由于癌化一发展，细胞就变小，细胞内的结构变得复杂，所以当细胞内的复杂度的参数(SSCP)相对于涉及到细胞大小的参数(SSCW)高时，可以认为是异型细胞。因此，在通过上述二维分布图认为是异型细胞的部分的曲线密度高时，通过对由第3抗体引起的荧光参数进行正校正，用下面叙述的子宫颈癌自动诊断方法判别疑似癌时进行加权，可以提高诊断精度。
将摄像装置使用于流式细胞计时，也可以根据需要做成细胞图像，由细胞形态进行具体判断。
图5表示使用备有摄像装置的流式细胞计时的筛选方法的一个实施方式。通过该流程图，对于第3抗体显阳性的细胞当实际上是细胞残渣时，通过步骤#4排除，当不是细胞残渣时对于该细胞做成细胞图像(步骤#5)。
判定为第3抗体阳性的细胞是扁平上皮癌细胞、处于其前癌状态的扁平上皮系的异型细胞。当基底细胞层含有某正常扁平上皮细胞时，该基底细胞层的扁平上皮细胞对第3标记抗体也表现出阳性。然而，正常的扁平上皮细胞与扁平上皮癌细胞、扁平上皮系异型细胞相比，由于形态、核细胞质比等不同，所以观察细胞形态就可以区分。由于只是对在步骤#1判断为阴性，在步骤#3判断为阳性的细胞做成细胞图像，所以对处理速度的影响很小。
另外，通过图像可以了解细胞有无凝集。例如，象白细胞那样，即使是与扁平上皮癌没有关系的细胞，也与第3抗体反应的细胞与正常扁平上皮细胞凝集时，应当分类为正常扁平上皮细胞(组IV)的细胞变成对第3抗体的阳性细胞，被分类在组III，成为误诊为扁平上皮癌的原因。即使是这样的情况，通过在步骤#5做成图像，就可以知道是否是凝集细胞，进一步可以判定凝集的细胞是否是白细胞。由此，判明通过流动池的细胞是凝集细胞时，可以将该凝集细胞排除在解析对象之外。这样一来，所以可以防止尽管是正常扁平上皮细胞，却由于被判定为第3抗体阳性而被分在组III类就减少用直方图等表示作为细胞集团的一个检体的解析结果时的误差。
另外，作为备有摄像装置的流式细胞计，例如可以使用具有象图6所示那样构成的装置。在该装置140，在通过FL1～FL3检测来自通过流动池的细胞的荧光的同时，用FSC检出前方散射光、用SSC检出侧方散射光，并用照相机拍摄细胞图像。
如果进一步详细叙述的话，首先具有488nm振荡波长的蓝色激光(Ar离子激光)经由透镜101，调整为带有短径10μm、长轴100μm左右的扁平光束轮廓后照射到流动池。
由透镜101出射的激发光经流动池于光阑102处成像，一次光在这里被阻断。来自细胞的荧光/散射光通过物镜103被集聚，经过具有通过530nm以上波长的光性质的分色镜104，10度左右立体角的荧光入射到检测器105(光电倍增管PMT)，在那里检测前方荧光(FFL)。带有530nm以下波长的光同样以10度左右立体角的荧光入射到检测器106(光电二极管PD)，在那里检测前方散射光(FSC)。
另外，由细胞发出的荧光/散射光被带有配置在流动池侧方的高数值孔径(NA)的物镜107集聚。由物镜107出射的光首先通过具有反射比740nm更短波长的光性质的分色镜108。经该分色镜108反射的侧方荧光/散射光首先经过具有反射500nm以下波长的光性质的分色镜109，再经过中心波长474nm、通过波长49nm的干涉滤光片110入射到SSC的检测器111(光电倍增管PMT)，在那里检测侧方散射光。通过这个分色镜109的光经过具有反射550nm以下波长的光性质的分色镜112，再经中心波长534nm、通过波长26nm的干涉滤光片113入射到FL1的检测器114(光电倍增管PMT)，在那里检测出绿色荧光。
通过分色镜112的光被分色镜115分为630nm以下和630nm以上的光。被分开的一方的光经过中心波长597nm、通过波长49nm的干涉滤光片116入射到FL2的检测器117(光电倍增管PMT)，在那里检测出橙色荧光，另一方光经过中心波长689nm、通过波长46nm的干涉滤光片118入射到FL3的检测器119(光电倍增管PMT)，在那里检测出红色荧光。在本发明中，不一定要检测前方荧光(FFL)。
捕捉的前方散射光(FSC)、前方荧光(FFL)、侧方散射光(SSC)、绿色荧光(FL1)、橙色荧光(FL2)、红色荧光(FL3)经A/D转换后输入到解析部。在那里进行实时信号处理，这些信号如果具有某种特征，由解析部送出触发信号，使具有780nm的振荡波长的近红外脉冲激光器120发光。该脉冲激光120起着透过照明光作用，由流动池出射的光通过第一个分色镜108，在照相机121处成像，摄像数据被送到解析部130。这样一来可以捕捉到具有任意的散射光、荧光特征的细胞的静止图像。
在解析部130，可以进行上述的各种所期望的解析，结果表示在表示部131。
图7表示使用预先进行了核染色的测定用样品，应用流式细胞计的筛选方法的一个实施方式。
核染色是使用荧光染料对测定用样品中含有的所有细胞的核进行染色。核染色中使用的荧光染料使用可与在第1抗体、第2抗体、第3抗体的标记中使用的荧光相区别的荧光染料，做成4色解析。例如，就象图2所示，通过使用备有FL1～FL4这4种荧光检测器的流式细胞计可以测定。
在图7所示流程图中，对于除了细胞残渣的第3抗体阳性细胞，通过在步骤#6对来自核染色的参数、以及散射光参数一并解析，即使不用做成花费时间的细胞图像，也可以判定有无细胞凝集体或通过流动池的细胞是否是癌细胞。
例如，做成以细胞通过感知区域的时间和来自该细胞的核染色的荧光强度作为两个轴的荧光分布图和散射光分布图，然后对两者分布图进行比较。对于两个细胞凝集时，来自核染色的荧光分布可以得到例如象图8(a)所示的发光分布。另外，相对于通过同样感知区域的时间的侧方散射光分布如图(b)所示，前方散射光分布如图8(c)所示。在散射光分布图8(b)或(c)中，由于脉冲没有明确分离，所以判断为单细胞的可能性高，但在核染色荧光分布图8(a)中显示出脉冲被明确地分离成2束，由此可以判定每单位时间通过2个细胞核，即通过2个细胞的凝集体。因此，即使不用拍摄细胞，通过对散射光分布、以及核染色分布进行判定，也可以检测细胞凝集体，并将其从解析对象中排除。
另外，在步骤#6中，对通过流动池的细胞的散射光分布和荧光分布解析比较之后，也可以判定是单一细胞还是凝集细胞，预先将单一细胞通过流动池的时间和来自该细胞的核染色的荧光强度的基本荧光分布作为数据库分布保存，对通过计测得到的的核荧光分布和基本分布的数据进行比较，当模式不同时也可以判断为细胞凝集。
另外，由来自核染色的荧光分布可以求出细胞核的大小(N)，由该细胞的侧方散射光脉冲宽度(SSCW)可以求出细胞质的大小(C)，求出细胞核对细胞质的比率(N/C)。具体来说，在如图9(a)所示的SSC分布中，表示的脉冲宽度C为细胞质大小C，图9(b)所示细胞核荧光分布中的荧光分布的半值宽度等为核大小N。癌细胞由于N/C大，算出的N/C在规定值以上时，可以判断为疑似癌细胞程度高。
象上述那样，通过对来自核染色的荧光分布、以及散射光分布进行解析，即使不做成细胞图像，对细胞凝集体进行区分之后由于可以防止判定为假阳性的正常扁平上皮细胞被分类在组III，或可以由对第3抗体为阳性的细胞(组III)区分为正常的扁平上皮细胞的基底细胞层扁平上皮细胞和扁平上皮癌细胞，所以使进一步提高扁平上皮系异型细胞的筛选精度变成可能。
本发明的子宫颈癌细胞自动诊断方法是根据上述本发明的子宫颈癌的筛选方法在自动判定有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的同时，当判定为腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的细胞相对于测定用样品中含有的细胞集合体的含有比例在规定值以上时，判断为腺癌或扁平上皮癌的方法。
作为筛选方法采用流式细胞计时，在作为一个检体的解析结果的细胞数对于荧光参数的直方图，或象图3所示的荧光参数对各个抗体的的三维座标中做成对于测定样品中含有的所有细胞的曲线分布图，或在各个抗体的荧光参数和散射光参数的二维座标中做成对于测定样品中含有的所有细胞的曲线分布图，可以由曲线的分散状态进行诊断。
例如，当相当于组I、组III部分的曲线密度超过规定比例时，可以判断为是子宫颈癌。
在自动诊断的判定中，例如作为散射光参数，计测侧方散射光脉冲高度(SSCP)，通过做成与荧光参数的二维分布图，对某一区域进行分割，研究每个区域的异型细胞的出现频率，对于异型细胞出现多的情况，也可以对作为判定基准的比例进行校正。
本发明不仅适用于判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞，也适用于判别有无腺癌上皮系异型细胞的筛选方法。
即，是通过使可彼此分辨的标记物质标记的与腺系细胞反应的抗腺系细胞标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的抗扁平上皮系异型细胞标记抗体与子宫颈部细胞反应制备测定用样品，对来自与上述子宫颈部细胞结合的各个标记抗体的标记分别进行检测，根据被检测的标记判别有无扁平上皮系异型细胞的方法。
与腺系细胞反应的标记抗体的抗体优选选自MUC1抗体、细胞角蛋白7抗体、以及细胞角蛋白18抗体中的至少一种，与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的抗标记抗体的抗体优选选自NMP179抗体、p16INK4A抗体、Ki-67抗体、p53抗体、p21抗体、EMA抗体、CEA抗体以及MIB-1抗体中的至少一种。即，在判断有无扁平上皮系异型细胞的筛选方法中使用的诊断试剂是在上述子宫颈癌的筛选方法中使用的第1标记抗体和/或第2标记抗体与第3标记抗体的混合物，也可以使用与上述子宫颈癌的筛选方法中使用的诊断试剂相同的试剂，也可以使用将第1标记抗体或第2标记抗体从子宫颈癌诊断试剂中除去后的试剂。
判别，如果对与腺系细胞反应的抗腺系细胞标记抗体为阴性，而且对与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的抗扁平上皮系异型细胞标记抗体为阳性，应当判断为存在扁平上皮系异型细胞，但为了区别细胞残渣、虽然少但混入到检体的正常的细胞基底层的扁平上皮系异型细胞与扁平上皮系异型细胞，做成反映图4步骤#4中所进行细胞大小的散射光参数和荧光标记参数的二维分布图，或做成在图5方式的步骤#5中进行的细胞图像，可以进行图7方式那样的信号解析。
实施例[诊断试剂的制备](1)含有第1标记抗体的试剂作为第1标记抗体，使用细胞角蛋白7抗体，象以下那样进行标记，制备含有第1标记抗体的试剂。
向用含有1％山羊血清的PBS将细胞角蛋白7抗体稀释至浓度为1μg/ml的一次抗体液中添加成为标记的二次抗体(结合了Alexa488(绿色荧光色素)的小鼠IgG F(ab)2)2μg/ml，并混合，反应5分钟。然后添加小鼠IgG，使其终浓度为10μg/ml，搅拌5分钟，吸收过量的二次抗体。另外作为二次抗体的稀释液，使用含有1％山羊血清的PBS。
(2)含有第2标记抗体的试剂作为第2标记抗体使用细胞角蛋白8抗体，象以下那样进行标记，制备含有第2标记抗体的试剂。
向用含有1％山羊血清的PBS将细胞角蛋白抗体8稀释至浓度为1μg/ml的一次抗体液中添加成为标记的二次抗体(结合了R-PE(橙色荧光色素)的小鼠IgG F(ab)2)2μg/ml，并混合，反应5分钟。然后添加小鼠IgG，使其终浓度为100μg/ml，搅拌5分钟，吸收过量的二次抗体。另外作为二次抗体的稀释液，使用含有1％山羊血清的PBS。
(3)含有第3标记抗体的试剂作为第3标记抗体使用NMP179抗体，象以下那样进行标记，制备含有第3标记抗体的试剂。
向用含有1％山羊血清的PBS将NMP179抗体稀释至浓度为7.4μg/ml的一次抗体液中添加成为标记的二次抗体(结合了Alexa488(绿色荧光色素)的小鼠IgG F(ab)2)10μg/ml，并混合，反应5分钟。然后添加小鼠IgG，使其终浓度为250μg/ml，搅拌5分钟，吸收过量的二次抗体。另外作为二次抗体的稀释液，使用含有1％山羊血清的PBS。
作为腺癌细胞样品，使用作为子宫颈部腺癌培养细胞的HeLa细胞。作为扁平上皮癌细胞样品使用作为子宫颈部扁平上皮癌培养细胞的C33A细胞。作为正常腺细胞和正常扁平上皮细胞，分别使用腺细胞多的正常的临床检体1(以下简单称为“正常腺细胞”)以及扁平上皮细胞多的正常临床检体2(以下简单称为“正常扁平上皮细胞”)。
实施例1准备4支试管，分别向各个试管添加约1×106个的HeLa细胞、C33A细胞、临床检体1、2。用Cytyc公司的PreservCyt液将细胞固定后，于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液。然后添加5％N-乙酰基-L-半胱氨酸，搅拌后，于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液。用PBS清洗细胞后，于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液。添加含有1％山羊血清的PBS或PBS-T(含有0.05％Tween20的PBS)1ml，搅拌后进行10分钟的封闭反应。
封闭后，于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液。添加上述制备的含有第1标记抗体的试剂，于室温下搅拌反应30分钟。
抗体反应后，于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液，用PBS或PBS-T通过移液管对细胞团进行清洗后，于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液，再次用PBS或PBS-T进行清洗。然后于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液。用PBS混悬后，在用荧光显微镜观察的同时，用流式细胞计FACSCalibur(FSC；E00 1.00，SSC304v FL1；340vFL2；282v)测定，对相对于各荧光标记的细胞数进行计数，做成直方图。
图10给出了表示与HeLa细胞、C33A细胞、正常腺细胞、正常扁平上皮细胞的反应结果的各显微镜照片。另外，图11～14给出了对于各个细胞的表示来自荧光标记Alexa488的绿色荧光强度与细胞数之间关系的直方图。
使用含有第2标记抗体的试剂、含有第3标记抗体的试剂取代含有第1标记抗体的试剂，进行同样的操作。但对于含有第3标记抗体的试剂只使用C33A细胞和正常扁平上皮细胞。
图15给出了表示与含有第2标记抗体的试剂反应结果的各细胞显微镜照片，图16～19分别给出了表示来自R-PE的橙色荧光强度与细胞数关系的直方图。另外，图20分别给出了表示与含有第3标记抗体的试剂反应结果的C33A细胞以及正常扁平上皮细胞的显微镜照片，图21给出了表示来自荧光标记Alexa488的绿色荧光强度与细胞数之间关系的直方图。图21中，(a)是正常扁平上皮细胞，(b)是扁平上皮癌细胞的直方图。
图10～21的任一个图对于通过显微镜照片观察荧光的结果，看到直方图中102左右强度的峰，可以确认存在相关关系。而由图10～14可以确认在使用含有第1标记抗体的试剂时，表现出与HeLa细胞以及正常腺细胞反应，与C33A以及正常扁平上皮细胞没有反应。
由图15～19可以确认在使用含有第2标记抗体的试剂时，与HeLa细胞的反应为阳性，而与正常腺细胞、以及正常扁平上皮细胞、C33A细胞的反应为阴性。
由图20、21可以确认在使用含有第3标记抗体的试剂时，与C33A细胞的反应为阳性，与正常扁平上皮细胞的反应为阴性。
因此，通过对与第1标记抗体、第2标记抗体、第3标记抗体的各个反应性进行判定，可以筛选腺癌细胞和/或扁平上皮癌细胞。
实施例2向试管中加入口腔粘膜上皮细胞约1×106个，为了防止由RNA引起的非特异染色，添加100μl的300μg/ml的用PBS稀释的核糖核酸酶A(Sigma公司#R-4612)。于室温下搅拌5分钟后，于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液。然后添加500μl作为核染色用溶液的10μM的PI(碘丙锭，Propidium iodide)，于室温下搅拌30分钟。于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液后，添加500μl的0.05％PBST，于10000rpm离心分离1分钟。用适量的PBS进行溶液置换后，加到具有图6所示构成的流式细胞计。
用488nm的氩离子激光激发，在对来自核染色的橙色的荧光分布、以及侧方散射光分布进行纪录的同时，做成通过流动池的细胞图像。图22给出了核染色分布以及侧方散射光分布。
在图22中，实线表示来自核染色的荧光分布，而虚线表示散射光分布。由侧方散射光分布求得的细胞大小(C)与由细胞图像计测的细胞大小大致一致。另外由细胞图像求得的核的位置可以确认与图22所示分布的核脉冲的位置存在相关关系，另外确认细胞核的大小(N)与核荧光脉冲(半值宽度)对应。
制备混有扁平上皮癌细胞以及扁平上皮系正常细胞的样品，加到流式细胞计。对于通过流动池的各个细胞，做成与图22相应的分布，由该分布求得的细胞大小(C)以及细胞核大小(N)算出N/C。将对测定样品(细胞集团)算出的N、C以及N/C分别画在X轴、Y轴、Z轴三维座标上，如图23所示。图23中，扁平上皮细胞癌细胞用黑圈「●」画出，而正常扁平上皮细胞用白圈「○」画出。由于扁平上皮细胞癌细胞一般表示出高的N/C，所以在图23所示的三维座标中可知扁平上皮细胞癌细胞与正常扁平上皮细胞的曲线位置是可辨别的。因此，即使不用细胞图像进行判断，也可以根据图7所示的流程图，由核染色分布以及侧方散射光分布算出细胞大小与细胞核大小的比(N/C)，当该值在一定值以上时判定为癌细胞，由此可以进一步提高扁平上皮癌细胞的筛选精度。
(模型检体的测定)实施例3作为子宫颈部正常扁平上皮细胞的代用细胞使用口腔粘膜上皮细胞、作为子宫颈部腺癌细胞使用HeLa细胞以及作为子宫颈部扁平上皮癌细胞使用C33A细胞，制备两种(子宫颈部腺癌细胞和子宫颈部扁平上皮癌细胞)模型检体作为正常检体的模型检体、异常检体的模型检体，验证是否可进行子宫颈癌筛选。
(模型检体的制备)子宫颈部正常扁平上皮细胞的模型检体(正常检体的模型检体)使用在保存液PreservCyt(Cytyc；Cat#0234004)中保存的约2×105细胞/管的口腔粘膜上皮细胞的检体。
子宫颈部腺癌细胞的模型检体使用混合了在保存液PreservCyt中保存的约2×105细胞/管的C33A细胞的检体和上述正常扁平上皮细胞的模型检体各约1×105个细胞，制备成总细胞数约为2×105细胞/管的检体。
子宫颈部扁平上皮癌细胞的模型检体使用混合了在Preservlyt中保存的约2×105细胞/管的C33A细胞的检体和上述正常扁平上皮细胞的模型检体约1×105细胞，制备成总细胞数约2×105细胞/管的检体。
(粘液除去处理)将上述各个模型检体加入到1.5ml的离心管中，于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液。然后用PBST(加有0.05％Tween20的PBS)洗涤一次，于10000rpm离心分离1分钟，弃去上清液，制成细胞团。
向加有上述制备的细胞团的试管中添加PBS 400μl后，添加10％的N-乙酰基-L-半胱氨酸(SIGMA；Cat#A7250)的PBS溶液400μl，用Voltex混合器轻轻搅拌后，添加PBST 400μl。然后于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液。用PBST600μl洗涤，于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清。再次用PBST 600μl洗涤，于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液。制成除去了粘液的细胞团。
(细胞分散处理)向加有上述除去粘液的细胞团的试管中添加Zamboni固定液
400μl。用Voltex混合器轻轻搅拌后，在旋转器上反应10分钟后，添加PBST 400μl，于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液。然后用PBST 600μl清洗，于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液。再次用PBST 600μl清洗，于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液，添加PBS 300μl。于37℃下预温育5分钟后，添加酶反应液300μl(25％I型胶原酶(Warthington；Cat#4196)2.4μl(终浓度0.2％)、25％II型胶原酶(Warthington；Cat#4176)2.4μl(终浓度0.2％)、12.5％蛋白酶(SIGMA；Cat#P-5027)2.4μl(终浓度0.1％)、PBS292.8μl)，于37℃下反应2分30秒钟。反应后，添加于冰上冷却的1％PI反应终止缓冲液(10μl蛋白酶抑制剂/1ml PBS)(蛋白酶抑制剂SIGMA；Cat#P8340)600μl，于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液。用PBST600μl清洗，于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液。
再添加PBST 300μl混悬，通过直径100μl的滤膜，除去细胞凝集物。用PBST 300μl洗涤滤膜，回收洗涤液。然后于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液。
(抗体反应液的制备)第1标记抗体溶液是通过将用PBST稀释的单克隆小鼠抗人细胞角蛋白7(DakoCytomation；Cat#M7018)(终浓度2.6ug/ml)与Alexa647-RPE山羊抗小鼠IgG(Molecular Probe；Cat#A20990)(终浓度7.8ug/ml)的混合物在避光条件下在旋转器上一边旋转一边反应5分钟后，添加小鼠IgG至浓度为128.8ug/ml，一边旋转一边反应5分钟而制备的。
第2标记抗体溶液是通过将用PBST稀释的抗细胞角蛋白(CAM5.2)(BECTON DICKINSON；Cat#349205)(细胞角蛋白8抗体)(终浓度2.5ug/ml)与RPE F(ab’)2山羊抗小鼠IgG(DakoCytomation；Cat#R0480)(终浓度6.25ug/ml)的混合物在避光条件下在旋转器上一边旋转一边反应5分钟后，添加小鼠IgG至终浓度为151.2ug/ml，在旋转器上一边旋转一边反应5分钟而制备的。
第3标记抗体溶液是通过将用PBST稀释的NMP179抗体(终浓度4.89ug/ml)与Alexa488 F(ab’)2山羊抗小鼠IgG(Molecular Probe；Cat#A11017)(终浓度10ug/ml)的混合物在避光条件下在旋转器上一边旋转一边反应5分钟后，添加小鼠IgG至浓度为246.4ug/ml，在旋转器上一边旋转一边反应5分钟而制备的。
将上述制备的第1标记抗体溶液、第2抗体溶液以及第3抗体溶液等量混合后制备抗体反应液。
(抗体反应)向加有上述除去细胞凝集物的细胞团的试管中添加1％山羊血清PBST溶液(山羊血清Cedarlanelabs Cat#CL1200)600μl，在旋转器上一边旋转一边反应10分钟后，于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液。添加上述制备的抗体反应液200μl，于避光条件下，在旋转器上一边旋转一边反应30分钟。然后于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液，用PBST 600μl清洗，于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液。再用PBST 600μl清洗，于10000rpm离心分离1分钟后，弃去上清液。
(测定)向加有上述使抗体反应的细胞团的试管中添加RET-SHEATH(Sysmex；Cat#RSE-900A)200μl，混悬细胞，用备有图6所示的光学系统的带有摄像功能的流式细胞计测定前方散射光和荧光。
(结果)图24～图26给出了测定子宫颈部腺癌细胞的模型检体的结果。在各图中，纵轴表示前方散射光脉冲宽度，横轴，图24表示来自第1荧光标记抗体的荧光强度，图25表示来自第2荧光标记抗体的荧光强度，图26表示来自第3荧光标记抗体的荧光强度。另外，用虚线围成的各区域内表示癌或异型细胞的候选区域(以下称为异型细胞候选区)。如果在各个异型细胞候选区内确认有细胞集团，可以判断为对各个标记抗体的反应性为阳性。各个异型细胞候选区例如可以以测定多个检体的结果为基础预先确定。图24～图26的异型细胞候选区内证实存在细胞集团，可以确认该模型检体含有属于表1的组I的细胞。
图27～图29给出了测定子宫颈部扁平上皮癌细胞的模型检体的结果。在各个图中纵轴与上述同样。横轴，图27表示来自第1荧光标记抗体的荧光强度，图28表示来自第2荧光标记抗体的荧光强度，图29表示来自第3荧光标记抗体的荧光强度。用虚线围成的各个区域与上述同样。图27和图28的异型细胞候选区内没有发现细胞集团，而在图29的异型细胞候选区内发现细胞集团，可以确认该模型检体含有属于表1的组III的细胞。
图30～图32给出了测定子宫颈部正常扁平上皮细胞的模型检体的结果。在各个图中纵轴与上述同样。横轴，图30表示来自第1荧光标记抗体的荧光强度，图31表示来自第2荧光标记抗体的荧光强度，图32表示来自第3荧光标记抗体的荧光强度。用虚线围成的各个区域与上述同样。图30～图32的异型细胞候选区内没有发现细胞集团，只在异型细胞候选区外看到细胞集团，可以确认该模型检体含有属于表1的组IV的细胞。
权利要求
1.子宫颈癌筛选方法，通过使以可彼此分辨的标记物质标记的与腺系细胞反应的第1标记抗体、与腺癌细胞反应的第2标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3标记抗体与子宫颈部细胞反应制备测定用样品，对来自与上述子宫颈部细胞结合的上述各个标记抗体的标记分别进行检测，根据被检测的标记判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞。
2.权利要求1所述的子宫颈癌筛选方法，其中，上述标记中至少一个是荧光标记。
3.权利要求1所述的子宫颈癌筛选方法，其中，上述判别是对上述测定用样品中的细胞，通过检测第1标记抗体的第1标记的装置对该细胞对第1标记抗体的反应的阳性或阴性进行判定，对于判定对上述第1荧光标记抗体为阳性的细胞，通过检测第2标记抗体的第2标记的装置对上述测定样品中的细胞对第2标记抗体的反应的阳性或阴性进行判定，对于判定对上述第1标记抗体为阴性的细胞，通过检测第3标记抗体的第3标记的装置对上述测定样品中的细胞对第3标记抗体的反应的阳性或阴性进行判定。
4.子宫颈癌筛选方法，是通过向使以可彼此分辨的荧光标记的与腺系细胞反应的第1荧光标记抗体、与腺癌细胞反应的第2荧光标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3荧光标记抗体与子宫颈部细胞反应制备的测定用样品照射激发光，对来自上述测定用样品发出的荧光进行检测，根据被检测的荧光判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞。
5.权利要求1所述的子宫颈癌筛选方法，其中，上述第1标记抗体的抗体是选自MUC1抗体、细胞角蛋白7抗体和细胞角蛋白18抗体的至少一种。
6.权利要求1所述的子宫颈癌筛选方法，其中，上述第2标记抗体的抗体是选自细胞角蛋白8抗体和HIK1083抗体的至少一种。
7.权利要求1所述的子宫颈癌的筛选方法，其中，上述第3标记抗体的抗体是选自NMP179抗体、p16INK4A抗体、Ki-67抗体、p53抗体、p21抗体、EMA抗体、CEA抗体和MIB-1抗体的至少一种。
8.权利要求4所述的子宫颈癌筛选方法，其中，上述判别是对于由上述测定用样品中的细胞发出的荧光，通过测定来自第1荧光标记的荧光强度，判定该细胞对第1荧光标记抗体反应的阳性或阴性，对于由判定对上述第1荧光标记抗体为阳性的细胞发出的荧光，通过测定来自第2荧光标记的荧光强度，判定该细胞对第2荧光标记抗体反应的阳性或阴性，对于来自判定对上述第1荧光标记抗体为阴性的该细胞发出的荧光，通过测定来自第3荧光标记的荧光强度，判定该细胞对第3荧光标记抗体反应的阳性或阴性。
9.权利要求4所述的子宫颈癌筛选方法，其中，上述判别是使上述测定用样品流过流式细胞计的流动池，向流过流动池的上述测定用样品中的细胞照射激发光，对于由上述细胞发出的荧光分别对来自第1荧光标记的荧光参数、来自第2荧光标记的荧光参数以及来自第3荧光标记的荧光参数进行计测，通过各个荧光参数值的组合进行判别。
10.权利要求9所述的子宫颈癌筛选方法，其中，上述荧光参数选自荧光强度、荧光脉冲宽度以及荧光脉冲面积。
11.权利要求9所述的子宫颈癌筛选方法，还对有关上述测定用样品中的细胞的散射光参数进行计测后，判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞。
12.权利要求11所述的子宫颈癌筛选方法，其中，上述散射光参数选自前方散射光强度、前方散射光脉冲宽度和侧方散射光脉冲宽度。
13.权利要求11所述的子宫颈癌筛选方法，是通过做成以从来自第1荧光标记的荧光参数、来自第2荧光标记的荧光参数和来自第3荧光标记的荧光参数选出的一种荧光参数和上述散射光参数作为两个轴的二维分布图后判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞。
14.权利要求9所述的子宫颈癌筛选方法，其中，上述测定用样品中的子宫颈部细胞是还预先用可进行核染色的荧光色素染色过，通过来自子宫颈部细胞的核染色的荧光分布、由该子宫颈部细胞发光的核染色以外的发光分布以及前方散射光分布和侧方散射光分布的比较，判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞。
15.权利要求9所述的子宫颈癌筛选方法，其中上述流式细胞计配备有摄像装置，对于判定第3荧光标记抗体的反应为阳性的细胞，对细胞图像进行摄像。
16.权利要求1所述的子宫颈癌筛选方法，其中上述子宫颈部细胞是分散为单细胞的细胞的集合体。
17.权利要求1所述的子宫颈癌筛选方法，其中上述子宫颈部细胞是涂片标本上的细胞。
18.子宫颈癌诊断试剂，包含以可彼此分辨的荧光标记的与腺系细胞反应的第1荧光标记抗体、与腺癌细胞反应的第2荧光标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3荧光标记抗体。
19.权利要求18所述的诊断试剂，其中，上述第1标记抗体的抗体是选自MUC1抗体、细胞角蛋白7抗体、和细胞角蛋白18抗体的至少一种，上述第2标记抗体的抗体是选自细胞角蛋白8抗体和HIK1083抗体的至少一种，上述第3标记抗体的抗体是选自NMP179抗体、p16INK4A抗体、Ki-67抗体、p53抗体、p21抗体、EMA抗体、CEA抗体和MIB-1抗体的至少一种。
20.子宫颈癌的自动诊断方法，其中是在权利要求1所述筛选方法中自动判定有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的同时，当判定为腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的细胞对测定用样品中含有的细胞集合体的含有比例在规定值以上时，判断为腺癌或扁平上皮癌。
21.子宫颈癌筛选方法，通过使以可彼此分辨的标记标记的与腺系细胞反应的抗腺系细胞标记抗体以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的抗扁平上皮系异型细胞抗体与子宫颈部细胞反应制备测定用样品，对来自与上述子宫颈部细胞结合的上述各个标记抗体的标记分别进行检测，根据被检测的标记判别有无扁平上皮系异型细胞。
22.权利要求21所述的子宫颈癌筛选方法，其中，与腺系细胞反应的标记抗体的抗体是选自MUC1抗体、细胞角蛋白7抗体和细胞角蛋白18抗体的至少一种。
23.权利要求21所述的子宫颈癌的筛选方法，其中与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的标记抗体的抗体是选自NMP179抗体、p16INK4A抗体、Ki-67抗体、p53抗体、p21抗体、EMA抗体、CEA抗体和MIB-1抗体的至少一种。
24.子宫颈癌的筛选装置，备有用于导入使以可彼此分辨的荧光物质标记的与腺系细胞反应的第1荧光标记抗体、与腺癌细胞反应的第2荧光标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3荧光标记抗体与子宫颈部细胞反应制备的测定用样品的流动池；用于向流过流动池的测定样品中的细胞照射激发光的光源；用于检测由被照射了激发光的上述细胞发出的第1荧光标记抗体的荧光的第1荧光检测器，用于检测由被照射了激发光的上述细胞发出的第2荧光标记抗体的荧光的第2荧光检测器，用于检测由被照射了激发光的上述细胞发出的第3荧光标记抗体的荧光的第3荧光检测器，以及对被检测的荧光进行解析，判别有无腺癌细胞和/或扁平上皮系异型细胞的解析部。
25.权利要求24的子宫颈癌的筛选装置，另外备有用于检测散射光的散射光检测部，解析部再对被检测的散射光进行解析。
26.权利要求25的子宫颈癌的筛选装置，另外还备有摄像装置，解析部再对被摄像的图像进行解析。
全文摘要
本发明提供一种使用不仅能够判断子宫颈癌有无，而且也能区别扁平上皮癌、腺癌的子宫颈癌诊断试剂以及使用该试剂的子宫颈癌筛选方法，特别是可利用流式细胞计高速处理的筛选方法。包含可彼此分辨的荧光标记的与腺系细胞反应的第1荧光标记抗体、与腺癌细胞反应的第2荧光标记抗体、以及与子宫颈部扁平上皮系异型细胞反应的第3荧光标记抗体。优选作为第1标记抗体选自MUC1抗体、细胞角蛋白7抗体和细胞角蛋白18抗体的至少一种，作为第2标记抗体选自细胞角蛋白8抗体和HIK1083抗体的至少一种，作为第3标记抗体选自NMP179抗体、p1文档编号G01N33/58GK1677109SQ20051006290
公开日2005年10月5日 申请日期2005年3月30日 优先权日2004年3月30日
发明者中野浩一, 石坂正树, 岸和希, 渡边美晴, 井邨泰之 申请人:希森美康株式会社