专利名称：：一种检测乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒，适用于乙肝核心抗体的定性或半定量检测。
背景技术：
：乙肝病毒(HBV)是致人乙型肝炎的病原体，是目前世界上传染最广泛的致命病毒之一。据统计，全世界有超过35亿的人群是慢性乙型肝炎病毒的携带者[ZuckermanJN，ZuckermanAJ.CurrenttopicsinhepatitisB.JInfect，2000，41(2)130～136]，其中中国有1.2亿；而且每年在全球范围内约有一百万人因感染HBV而死亡[Parkin，D.M，PisaniP，MunozNandFerlayJ.Theglobalhealthburdenofinfectionassociatedcancers.CancerSurv，1999，335～33.]。由于目前还没有治疗乙型肝炎的有效手段，因此疫苗接种、早期检测诊断是预防乙型肝炎的重点。乙型肝炎的病原学诊断，最常用的是乙肝病毒血清标志物(HBVM)的检测。HBVM主要包括七种血清标志物乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体(anti-HBs)、乙肝核心抗体(anti-HBc)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗体(anti-HBe)、HBV-DNA及DNA多聚酶(DNA-p)。通过检测HBVM可以间接的多角度了解患者HBV感染、复制以及病情恢复情况。在HBVM中，anti-HBc较为独特首先，anti-HBc是除HBV感染的最初阶段外，其它所有阶段均能检测到的一种血清标志物；这个标志物在HBsAg消失后的急性HBV感染期和慢性HBV携带期均存在，甚至可以终身保存。因此它是现在及过去曾感染HBV的指标，对anti-HBc的检测可以为特定人群的乙肝流行性动态提供最好的信息。其次，anti-HBc是窗口期(HBsAg不能检测到而anti-HBs还未出现的时期)仅有的、可检测到的血清标志物[LeeWM.HepatitisBvirusinfection.NEnglJMed.，1997，337(24)1733～1745.]。因为许多具有感染HBV风险的血制品主要源自处于感染窗口期的HBV携带者[SchreiberGB，BuschMP，KleinmanSH，KorelitzJJ.Theriskoftransfusion-transmittedviralinfections.NEnglJMed，1996，334(26)1685～1690.]，所以anti-HBc的筛选对预防输血后HBV感染有着重要的意义。另外，人们还发现一些HBV变异株在HBsAg检测中表现为阴性，但是其anti-HBc却能被检测到[CarmanWF，KorulaJ，WallaceL.FulminantreactivationofhepatitisBduetoenvelopeproteinmutantthatescapeddetectionbymonoclonalHBsAgElisa.Lancet，1995，3451406～1407.；JongeriusJM，WesterM，CuypersHTM，vanOostendorpWR，LeliePN，vanderPoelCL，etal.NewhepatitisBvirusmutantforminablooddonorthatisundetectableinseveralhepatitisBsurfaceantigenscreeningassays.Transfusion，1998，38(1)56～59.]。所以，对anti-HBc的检测可以降低HBV感染者被漏检的风险。综上所述anti-HBc的检测对乙肝的诊断治疗、流行病学调查以及对乙肝疫苗安全性鉴定具重要意义。目前，乙肝核心抗体(anti-HBc)的检测方法主要分为三大类免疫吸附血凝试验(IAHA)、酶联免疫吸附检测(ELISA)技术和放射免疫检测(RAI)技术。其中ELISA技术灵敏度高，价格相对较低，国内外应用较为广泛。[姚桢等，分子乙型肝炎病毒相关病学。中国医药科技出版社，2003，p27～28。]最常采用的ELISA检测方法是竞争性抑制法。这种检测方法的优点是对包被抗原的纯度要求不高，当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。但缺点也是很明显灵敏度不高，对低水平表达的anti-HBc样品难以检出；同时，因为包被抗原的纯度不高，所以可能会导致非特异性反应，从而出现假阳性检测结果。虽然近年来国内外有文献报道加入某种还原剂可以增加竞争抑制法检测anti-HBc的特异性[JohnAWeareetal.ImprovementinthespecificityofassaysfordetectionofantibodytoHepatitisBcoreantigen.JClinMicrobiol，1991，29(3)600～604.]。但事实表明这种特异性的提高是以牺牲灵敏度为代价的，不能从根本上解决问题。其次，在检测过程中因先加入标本，再加酶标anti-HBc，所以会导致标本的anti-HBc优先结合HBcAg，使样品anti-HBc与酶标anti-HBc产生“不公平竞争”，在成批样品测定时，这种时间差异的加大会使得“不公平竞争”加剧，可能会产生前后检测结果不一的问题[杜青等，加酶时间对竞争ELISA法检测HBcAb的影响。JangsuMedJ，2005，31(6)466～468.]。此外，传统的竞争抑制法检测不易于通过目视来区别弱阳性样品与阴性样品。
发明内容本发明的目的在于提供一种检测乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒，该双抗原夹心法酶联免疫诊断试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型酶标比色仪，更重要的是能快速地对乙肝核心抗体进行更为准确的检测。为了实现上述目的，本发明要用以下技术措施一种检测乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括微孔反应板和酶结合物，微孔反应板是由90％以上纯度、效价为5×104～5×105u/mg的乙肝核心抗原重组蛋白(rHBcAg)包被而成；酶结合物是由辣根过氧化物酶(HRP)标记乙肝核心抗原重组蛋白获得。本发明上述90％以上纯度、效价为5×104～5×105u/mg的乙肝核心抗原重组蛋白可通过表达含乙肝核心抗原蛋白基因的重组基因工程菌后，经硫酸铵盐析和免疫亲和层析分离纯化而获得的，其中免疫亲和层析的洗脱液为0.1mol/mlpH11.5三乙胺。上述包被的乙肝核心抗原重组蛋白的工作浓度为1∶200～2000(体积比)；酶结合物的工作浓度为1∶500～2000(体积比)。上述酶结合物的工作浓度由含10克/升的牛血清白蛋白、体积比为0.05％的Tween-20，0.1克/升的硫柳汞、5克/升的氨基吡呤的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液稀释得到。本发明所述的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒在检测乙肝核心抗体中应用。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果1、检测的特异性高；2、检测的灵敏度高；3、可消除因操作时间差所产生的误差；4、检测结果易于目视判断；5、可同时对样品进行半定量检测。图1为本发明试剂盒用于检测anti-HBc的确证实验；图2为本发明试剂盒用于检测anti-HBc的动力学曲线图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。实施例1检测乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒组成与配制辣根过氧化物酶购自Faizyme；重组基因工程菌E.coliJM105(pKK223-3)[MarcTordjemanetal.Specificdetectionofanti-HBCantibodieswithanenzymeimmunoassayusingrecombinantHBcAgandmonoclonalantibodies.J.Virol.Meth，1993，4321～30]；E.coliJM105(pFS14NSD)[FlorianSchodeletal.StructureofhepatitisBVirusCoreande-Antigenasingleprecoreaminoacidpreventsnucleocapsidassembly.JBiolChem，1993，268(2)1332～1337]；E.coliM15(pQE30)[周福元等，应用pQE30系统表达和纯化乙型肝炎病毒核心抗原。ChinJBiologicals，2000，13(1)13～15]；乙肝核心抗原重组蛋白将表达乙肝核心抗原的重组基因工程菌8000rpm离心10分钟获得菌体沉淀；将收集的菌体用0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液重悬，冰浴，超声波破菌3min左右，至悬液澄清；其后10000rpm，离心20min，收集上清；将此上清用40wt％硫酸铵盐析后上免疫亲和层析柱，用0.1MpH11.5三乙胺溶液洗脱，获得90％以上纯度、效价为5×104～5×105u/mg纯化的乙肝核心抗原重组蛋白；聚苯乙烯微量反应板购自Greinerbio-one；包被液50mmol/LpH9.5Na2CO3-NaHCO3缓冲液；封闭液含50克/升蔗糖，10克/升牛血清白蛋白，0.1克/升硫柳汞的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液；样品稀释液含10克/升牛血清白蛋白，体积比为0.05％Tween-20，0.1克/升硫柳汞的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液；酶稀释液含10克/升牛血清白蛋白，体积比为0.05％Tween-20，0.1克/升硫柳汞，5克/升氨基吡呤的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液；洗涤液含体积比为0.5％Tween-20的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液；底物缓冲液含0.51g/L柠檬酸，1.46g/LNa2HPO4的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液；底物溶液含0.1g/L四甲基联苯胺(TMB)，体积比为50％的二甲基甲酰胺(DMF)，体积比为0.3％H2O2的底物缓冲液；终止液2mol/LH2SO4；酶结合物采用过碘酸盐改良法[WilsonMB，NakanePK.Recentdevelopmentsintheperiodatemethodofconjugatinghorseradishperoxidasetoantibodies.Immunofluorescenceandrelatedstaomomgtechniques.North-HollandBiomedicalPress，Amsterdam，1978，pp215-224.；NanciDonacki，PeroxidaseConjugationbyPeriodateMethod.Protocolonline.2004.]用辣根过氧化物酶(HRP)标记乙肝核心抗原重组蛋白(rHBcAg)；微孔反应板用包被液将乙肝核心抗原按体积比1∶200～2000稀释后，以100μl/孔包被96孔板，置4℃过夜；其后洗板5次，每次5分钟；再加150μl/孔封闭液于96孔板中，置37℃温育2小时，最后洗板3次后烘干，用封口胶封存，于4℃保存备用。实施例2用双夹心法酶联免疫诊断试剂盒检测乙肝核心抗体1.在微孔反应板加入待测标本100μl/孔(待测标本用样品稀释液作1∶30稀释)，设置阴性对照、阳性对照各两孔，并设空白对照一孔；封板，置37℃温育1h；2.洗板3次，每次5min3.加入1∶1200稀释后的酶标抗原100μl/孔，空白对照孔只加酶稀释液；封板，置37℃温育30min；4.洗板3次，每次5min5.加底物溶液，封板，置37℃温育15min；6.加50μl/孔终止液终止反应；7.检测用酶标光度计检测各孔在450nm、630nm处的光吸收值；其检测结果为样品OD450＝0.985，OD630＝0.041；空白对照OD450＝0.065，OD630＝0.047；阴性对照1OD450＝0.084，OD630＝0.045；阴性对照2OD450＝0.088，OD630＝0.045；阳性对照1OD450＝0.794，OD630＝0.045；阳性对照2OD450＝0.820，OD630＝0.052。经计算得样品OD＝0.926；阴性对照OD1＝0.021，OD2＝0.025；阳性对照OD1＝0.741，OD2＝0.754。8.结果判定样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1判断为阳性，否则为阴性；其中阴性对照OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。因此，可以判定该样品为乙肝核心抗体阳性。实施例3双夹心法酶联免疫诊断试剂盒与传统竞争抑制法酶联免疫诊断试剂盒检测乙肝核心抗体的比较1.我们采集了不同HBV状态的血清共943例(表1)。每份血清样品均用双抗原夹心ELISA法和竞争抑制ELISA法诊断试剂盒(购自上海科华生物工程股份有限公司)同时检测。若样品的检测结果处于边缘状态以及两种检测结果存在差异，则用两种检测程序再检测一遍。表1被检测血清样品分类检测结果表明有16份血清样品的检测结果不一致。以竞争抑制性ELISA法检测试剂盒的检测结果为参考值，则双抗原夹心ELISA法的灵敏度可以达到99.8％，特异性达95.7％，符合率为98.3％(表2)。表2两种诊断试剂盒检测乙肝核心抗体结果比较一览表灵敏度597/598＝99.8％，特异性330/345＝95.7％，符合率927/943＝98.3％；a1份血清HBsAg阳性，b3份血清HBsAg阳性，7份血清HBsAb阳性，5份血清无乙肝标志物2.特异性比较我们对这16份检测结果不一致的血清样品进行双夹心法确证实验(即中和试验)的检测，以确证检测的特异性。其检测结果(图1)为15份血清样品的中和试验比对照试验和加入正常人血清试验的显色结果均要浅得多，说明在双抗原夹心法检测中，此15份样品的检测结果为真阳性，是特异性检测结果。而另一份编号12.06.61的血清样品，其中和试验与对照试验的显色几乎相同，表明此为非特异性反应。综上所述本发明在检测anti-HBc的特异性方面比现行竞争抑制性ELISA诊断试剂盒高。3.灵敏度的比较选取7份不同的阳性血清样品进行倍比稀释，记录到达终点滴度时血清样品的最大稀释度，从而比较两种检测方法的灵敏度，结果表明双抗原夹心ELISA法灵敏度是竞争法的32到256倍(表3)。表3竞争抑制性ELISA法与双夹心ELISA法灵敏度比较此外，经研究[袁红、熊燕等，四种乙肝标志物ELISA试剂盒的动力学比较研究。MedJWestChina，2003，1(1)18～20.]发现许多国产试剂盒，其anti-HBc的CO值接近于动力学曲线图形的平台区与线性区交界处，因此很容易在该区域造成结果误判。但是，从本发明试剂盒用于检测anti-HBc的S/CO动力学曲线图(图2)看一方面，其anti-HBc的CO值处于动力学曲线图形的线性变化区内，有利于对血清样品检测结果的定性判读；另一方面，其线性范围较宽，不同样品的稀释曲线几乎平行，有利于对血清样品中乙肝核心抗体进行半定量的检测，这种半定量的检测在临床检测与诊断中具有重要的意义。4.双夹心ELISA法重复性分析选取低、中、高3份不同的阳性血清样品，用同一批双夹心法诊断试剂盒进行检测，每份样品分别平行测8孔，进行试剂盒批内重复性检测；同理选取低、中、高3份不同的阳性血清样品，用6份不同批次的双抗原夹心法诊断试剂盒进行检测，每份样品平行测2孔，进行试剂盒批间重复性检测。检测结果为本试剂盒的批内平均变异系数为5.39％(表4-1)；批间平均变异系数为6.99％(表4-2)。由此可以确定双夹心测定法中所用的试剂都比较稳定，该试剂盒的重复性比较满意。表4-1双夹心法检测试剂盒批内重复性检测结果表4-2双夹心法检测试剂盒批间重复性检测结果5.双夹心ELISA法稳定性分析将试剂存放于37℃环境中保存，定期检测，直到其质量指标开始下降为止。通常认为在37℃每稳定一天，可相当于4～10℃保存一个半月。根据测定结果(表5)表明该试剂盒37℃放置5天，其S/CO值变化属非显著性差异；但在第5天，样品于4℃和37℃所测定的两组数据的变异系数(CV％)超过了15％。故推测此双抗原夹心法检测试剂盒至少在4℃可保存6个月，其试剂盒的稳定性较好。总上所述双夹心法酶联免疫诊断试剂盒灵敏度高、特异性好、检测结果准确可靠，其稳定性和重复性符合临床检测要求。表5双夹心法诊断试剂盒的稳定性检测结果t检验结果第三、四、五天4℃和37℃所测得的两组数据间的差异均为非显著性差异权利要求1.一种检测乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括微孔反应板和酶结合物；其特征是微孔反应板是由90％以上纯度、效价为5×104～5×105u/mg的乙肝核心抗原重组蛋白包被而成；酶结合物是由辣根过氧化物酶标记乙肝核心抗原重组蛋白获得。2.根据权利要求1所述的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒，其特征是90％以上纯度、效价为5×104～5×105u/mg的乙肝核心抗原重组蛋白是通过表达含乙肝核心抗原蛋白基因的重组基因工程菌后，经硫酸铵盐析和免疫亲和层析分离纯化而获得的，其中免疫亲和层析的洗脱液为0.1mol/mlpH11.5三乙胺。3.根据权利要求1或2所述双夹心法酶联免疫诊断试剂盒，其特征是包被的乙肝核心抗原重组蛋白的工作浓度体积比为1∶200～2000；酶结合物的工作浓度体积比为1∶500～2000。4.根据权利要求3所述的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒，其特征是酶结合物的工作浓度由含10克/升的牛血清白蛋白、体积比为0.05％的Tween-20，0.1克/升的硫柳汞、5克/升的氨基吡呤的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液稀释得到。5.权利要求1所述的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒在检测乙肝核心抗体中应用。全文摘要本发明公开了一种检测乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括微孔反应板和酶结合物；微孔反应板是由90％以上纯度、效价为5×10文档编号G01N33/544GK1908666SQ20061001998公开日2007年2月7日申请日期2006年8月14日优先权日2006年8月14日发明者黄健,邓丽娟,严兵申请人:武汉大学