专利名称：甘蓝杂交种“夏光”、“早夏16”指纹图谱的建立的制作方法
技术领域：
本发明涉及甘蓝种子鉴定技术，具体地说是甘蓝的DNA指纹图谱及建 立方法和应用。
背景技术：
目前，我国生产中推广应用的主栽甘蓝(5n^w'ca o/eracea var. ca; "ato) 品种基本上为杂种一代。杂种一代能综合亲本的许多优良性状，经济效益 较好。
但是在制种过程中会由于管理措施不当和自交不亲和性本身的缺陷而 常常产生自交种子，即假杂种，导致种子纯度下降。因此，提高杂交种纯 度是杂种优势利用研究领域的重要课题。目前，品种鉴定和种子纯度分析 方法大致有三种，即大田形态、生化标记和DNA指纹图谱鉴定法。传统的 大田鉴定法以种子、幼苗、叶、花、果实、花粉等组织器官的颜色、形态 等农艺性状作为鉴定的观测指标，在生产实践中虽然是一种较为可行的方 法，但大田鉴定需要额外占用土地，周期长、花费大，不仅受季节限制， 而且很多性状的表现受栽培措施及环境因子的影响，鉴定者的观察经验也 制约着鉴定的准确性。大田鉴定最大的缺陷是不能及时提供种子纯度信息， 不能在种子大量交易前提供有关种子的质量信息，对种子质量不能起到预 先监督的作用。生化鉴定方法包括蛋白质电泳和同工酶电泳，已得到曰益 广泛的应用，但不能完全显示品种间的多态性，难以对亲缘关系较近的品 种进行有效的区分。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蓝杂交种"夏光"、"早夏16"指纹图谱的建 立方法和应用，以克服现有技术存在的不足。
本发明的技术构思是这样的
DNA指纹图谱鉴定法是以DNA的多态性为基础的分子标记方法，可 以弥补和克服在种子纯度的形态学鉴定及同工酶、种子蛋白电泳鉴定中的 许多缺陷和难题。本发明利用SRAP、 RAPD技术构建了长江中下游地区甘 蓝主栽品种"夏光"、"早夏16"与其各自亲本的DNA指纹图谱，可以为这些 品种的鉴定和纯度检测提供科学依据，进而保护生产者和使用者的合法权
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本发明的甘蓝杂交种"夏光"、"早夏16"及其亲本的DNA指纹图 谱，是由"1"和"0"组成的数据，"夏光"母本的数据为
10111100110111;"夏光"的数据为11111111110111;"夏光"父本的数据 为11111111011111;"早夏16"母本的数据为10111111111101111;"早夏
16"的数据为11111011010010001;"早夏16"父本的数据为 11110101111100000。其中所述数字"1"表示图谱中某个位置上有扩增带存 在，数字"0"表示在某个位置上没有扩增条带存在。
所说的"夏光"、"早夏16"甘蓝杂交种和亲本可以采用上海市农业
科学院园艺研究所公开销售的产品；
甘蓝DNA指纹图谱的建立方法，包括如下步骤
1) 提取及纯化甘蓝基因组的DNA;
2) 用获得的甘蓝.DNA为模板进行RAPD分析；3)选择有代表性的多态性RAPD扩增条带，根据所选择条带的有、无 构建供试材料DNA指纹图谱。
其中所述"夏光"、"早夏16"甘蓝杂交种及其各自亲本都有其特异的 DNA指纹，可以相互区分开来。所述RAPD扩增中采用的引物为S42，是 由上海生工生物工程有限公司合成的寡核苷酸随机引物，其碱基序列为 GGACCCAACC。
本发明的DNA指纹图谱可以应用于"夏光"和"早夏16"甘蓝杂交种种子 纯度的鉴定。
本发明具有如下优点
1. 本发明创建了"夏光"、"早夏16"甘蓝杂交种及其亲本的DNA指纹 图谱，公开了用DNA指纹分析技术对甘蓝种子鉴定的研究结果，其建立方 法能从遗传本质上对甘蓝种子进行鉴定，因此准确、可靠，具有法律效应。
2. 采用本发明，在对"夏光"和"早夏16"甘蓝种子样品进行真实检测时， 用目前广泛应用的快速、微量DNA提取法提取待测样品的DNA，用提取 的DNA作为模板，进行RAPD分析，在几个小时内就可以知道该DNA指 纹，因此，就能迅速判断出它的真实性。
3. 由于本发明DNA指纹图谱是用图的形式表式，看起来比较直观、 易懂；并由于转换成了数码形式，便于计算机识读和分析。
图1为本发明建立的引物S42的RAPD指纹图谱，其中M为DGL2000 DNA标识；1为"夏光"母本；2为"夏光"；3:为"夏光"父本；4为"早夏16" 母本；5为"早夏16"; 6为"早夏16"父本；箭头标出的为互补型特征片段。
图2RAPD指纹图谱线段示意，其中l为"夏光"母本；2为"夏光"
3:为"夏光"父本；4为"早夏16"母本；5为"早夏16"; 6为"早夏16"父本。
具体实施例方式
实施例1
本实施例采用SDS法提取甘蓝品种"夏光"、"早夏16"及其各自亲本的 基因组DNA，通过SRAP、 RAPD两种分子标记方法构建其DNA指纹图谱 用于种子纯度鉴定。具体操作如下
1、 选用的试验材料
材料为甘蓝杂交种"夏光"与"早夏16"及其各自亲本
2、 甘蓝DNA的提取及纯化 按如下程序提取各个甘蓝材料的基因组DNA:
取新鲜组织2g,在液氮中研磨成粉，置于50 ml离心管，加入8ml提 取液(100mMTrispH8.0， 50mMEDTA， 500mMNaCl， 1.5%SDS)， 65°C 情况下30分钟，不时颠倒混匀，加2.5ml5M乙酸钾冰浴10分钟，力卩.5 ml 氯仿，颠倒混匀，10000rmp离心8分钟，取上清移入新管，加2 / 3体积预 冷异丙醇，颠倒混匀，-20°(:置1-2小时，挑出絮状白色DNA， 70%乙醇洗 1-2次，吹干，溶于100ul(或适量)TE中，并在r^琼脂糖凝胶上电泳，用 标准U)NA作对照，估算甘蓝DNA样品的浓度，获得高纯度甘蓝DNA。
3、 用获得高纯度甘蓝DNA为模板进行RAPD分析
RAPD反应在Mastercycler 5333型PCR仪上完成，引物是S42 (上海生 工公司产品)。RAPD~-PCR反应体系为为20^1，其中25 mmol/L MgCl22.0^1; 10xPCR Buffer 2.0pl; 10 mmol/L dNTP 0.5|il; 5 U/pi Taq E 0.5|il; 20ng/pl Primer 1.5ph 1 Ong/^l模板DNA 3^;灭菌双蒸水10.5(^1。适宜的RAPD扩 增程序为94。C5min; 94°C1 min， 37°C1 min， 72°C 1.5 min (40 cycles); 72°C10 min。 RAPD扩增产物电泳分析采用浓度为15 gL—1的琼脂糖凝胶(含 0.15ng L" EB)，电泳缓冲液为1 xTAE，保持90 V恒压(4 5 Vcm—')电泳1.5 2 h，凝胶成像仪成像分析。 4、 RAPD引物筛选
先以"早夏16"品种为模板DNA对200个RAPD随机引物进行筛选，选 出适用于甘蓝且扩增产物条带丰富的引物50个，再对杂交品种与其亲本 DNA按母本、杂交种、父本的顺序组成的两组材料分别进行PCR扩增。50 个引物中，对两组材料扩增表现有弱带、特异型、偏父型、偏母型、互补 型等谱带类型。能对"夏光"、"早夏16"两组材料扩增出互补型谱带的引物 分别为S42、 S103、 S193和S42、 S89、 S151。其中引物S42对2个品种纯 度鉴定均有效，其对"夏光"模板组扩增产生的互补特征片段大小约为550 与1050 bp，对"早夏16"模板组扩增产生的互补特征片段大小约为300、 600 与875 bp(图1)。
5、数字指纹的建立根据上述RAPD指纹图谱，以1和0分别代表某 个等位基因位点t增出的DNA条带的有无，按照从上到下即由小片段向大 片段的读带方向，将RAPD指纹图谱转换为由1和0组成的字符串，即构 成数字指纹。为方便建立相应的数字指纹，可先依照RAPD指纹图谱绘制 直观的线段示意图(图2)，再根据示意图建立数字指纹，是由"1"和"0"组成
的数据，即"夏光"母本的数据为10111111111101111;"夏光，，的数据为 11111111110111;"夏光"父本的数据为11111111011111;"早夏16"母本的数
据为10111111111101111;"早夏16"的数据为11111011010010001:"早夏16"
父本的数据为11110101111100000。其中所述数字"r表示图谱中某个位置t 有扩增带存在，数字"o"表示在某个位置上没有扩增条带存在。
实施例2
本发明的DNA指纹图谱用于"夏光"和"早夏16"种子纯度的鉴定 从制种基地生产的"夏光"和"早夏16"杂交种中各随机抽取50—80个单 株，用微量DNA提取法提取各单株样品的DNA，用提取的DNA作为模板， 用S42引物对其进行RAPD扩增，扩增产物在1.5%的琼脂糖上进行电泳分 析。如果利用S42标记分析査出的单株DNA指纹是"11111111110111"即为
"夏光"真杂种株，DNA指纹是"ioiiiiooiioiir或"iiiiiiiioiiiir即为"夏
光"亲本自交株，也就是假杂种株。如果利用S42标记分析查出的单株DNA 指纹是"IIIIIOIIOIOOIOOOI"即为"早夏16"真杂种株，DNA指纹是
"ioiiiiiiiiiioiiir，或"iiiioioiiiiiooooo"即为"早夏16"亲本自交株，也
就是假杂种株。然后用假杂种株数除以总分析的株数，即可获得制种基地 生产的甘蓝杂交种的纯度，较大田种植调查纯度既省时又便捷，可以为这
些甘蓝杂交种子的销售及时地提供纯度信息。如果鉴定的纯度低于85%，
就不能够作为种子进行销售，就可能避免假种子伤农事件的发生。如果鉴
定的种子纯度高于95%以上，就可以作为精品种子销售，优质优价，使农 民和种子经销商均获得好的经济效益。
权利要求
1.甘蓝DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤1)提取及纯化甘蓝基因组的DNA；2)用获得的甘蓝DNA为模板进行RAPD分析；3)选择有代表性的多态性RAPD扩增条带，根据所选择条带的有、无构建供试材料DNA指纹图谱。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，甘蓝杂交种"夏光"、"早 夏16"及其亲本的DNA指纹图谱，是由"1"和"0"组成的数据，"夏光"母本 的数据为10111100110111;"夏光"的数据为11111111110111;"夏光"父本的数据为11111111011111;"早夏16"母本的数据为10111111111101111:"早夏16"的数据为 11111011010010001 ;"早夏 16"父本的数据为iiiioioiiiiiooooo，其中所述数字"r表示图谱中某个位置上有扩增带存 在，数字"o"表示在某个位置上没有扩增条带存在。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RAPD扩增中采用 的引物为S42，其碱基序列为GGACCCAACC。
4. 权利要求2所述的方法建立的DNA指纹图谱的应用，其特征在于， 用于甘蓝杂交种"夏光"和"早夏16"种子纯度的鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种甘蓝杂交种及其亲本DNA指纹图谱及其建立方法和应用。建立方法包括1)甘蓝DNA的提取及纯化；2)用获得的高纯度甘蓝DNA为模板进行RAPD分析；3)选择有代表性的多态性RAPD扩增条带构建供试材料DNA指纹图谱；在该DNA指纹图谱中“夏光”、“早夏16”甘蓝杂交种及其亲本都有特异的DNA指纹，可以相互区分开来。由于本发明DNA指纹图谱是用图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并将其转换成数码表示形式，便于计算机识读和分析。本发明能从遗传本质上对“夏光”、“早夏16”甘蓝杂交种的种子进行纯度鉴定，结果准确、可靠，检测迅速。
文档编号G01N30/00GK101178388SQ20061011825
公开日2008年5月14日 申请日期2006年11月10日 优先权日2006年11月10日
发明者任云英, 冲 刘, 薄天岳, 陈锦秀 申请人:上海市农业科学院