专利名称：：动物摄食习性的测定方法动物摄食习性的测定方法发明领域避难所区域可包4舌未处理目标作物部分(即结构性避难所(structuredrefUge))或害虫的其它合适作物部分和杂草宿主部分(即替代性宿主避难所(alternativehostreflige)或天然避难所(naturalrefuge))。在评价可为能够在多种宿主植物上发育的害虫所利用的避难所时，需要若干评价方法，来"i平价存在于不同潜在宿主上的部分昆虫种群。本发明还提供一种测定采食期的昆虫是否摄食过烟草植物的方法。该方法包括测定成虫体内脂肪酸特征中C16:0和C18:3的相对含量。0014]本发明还提供一种测定采食期的昆虫是否摄食过大豆植物的方法。该方法包括测定成虫体内脂肪酸特征中C16:0、C18:l、C18:2和C18:3的相对含量。图3柱状图表示才艮据实施例1测定，烟草植物饲养的蛾的脂肪酸特征。在一些实施方案中，一种脂肪酸的存在可确定动物是否摄食过目标植物。在另一些实施方案中，两种或更多种脂肪酸的组合可确定动物是否摄食过月标植物。在又一些实施方案中，脂肪酸特征可确定动物是否摄食过目标植物。脂肪酸特征可以是一种或多种脂肪酸相对于所测总脂肪酸的任何比率。在一个具体实施方案中，所设计的本发明方法为测定动物的摄食特性提供了一种高通量方法。该方法一般包括从大量动物中采集组织样品，将样品加到多孔板的各孔中。然后筛选多孔板中各样品存在的目标植物的至少一种指示物，或者测定上述组织样品的脂肪酸特征。0051本文所述用于跟踪动物摄食习性或摄食史的方法和构思具有多种用途。在具体实施方案中，本文所述筛选方法可以用来确定相对于转基因作物的天然避难所区域的害虫。这种方法包括从转基因作物附近诱捕害虫；筛选诱;t甫害虫存在的至少一种目标植物的一种或多种指示物；测定摄食转基因作物以外植物的害虫种群百分比。或者另外，该方法可以包括从诱捕害虫采集至少一种组织；测定组织的脂肪酸特征；将组织的脂肪酸特征与已知在其生命周期内摄食过目标植物的害虫的脂肪酸特征进行比较后，测定摄食转基因作物以外植物的害虫种群百分比。—因此，参与确定害虫避难所区域的产品开发商、科学家和管理当局可以利用与害虫摄食习性和摄食史有关的资料，确定这些害虫的天然避难所区域是否足以部分或全部代替农民在自己农田中种植用于目标转基因作物的结构性避难所的需要，从而在明显延迟或防止抗性害虫种群发生的同时使作物产量最大化。实施例0052下面的实施例本质上仅是示例性的，不应解释为具有限制性意义。通过测定m/z176面积与m/z180面积的比率，对样品的可替宁进行定量测定，其中m/z180为氘化可替宁标准。使用每个样品中的可替宁标准来测定保留时间。可替宁数据用十亿分之几表示，检出限大约十亿分之一。棉酚分析将衍生剂(lml)加到装有研磨蛾的各孔中。板用石蜡膜覆盖，把盖压在石蜡膜上将各孔密封。使板涡旋l分钟，然后打开盖去掉密封膜后，板用箔紙覆盖。将板在烤箱或加热孔板夹中于80-90°C加热1小时。从加热系统中取出后冷却，再次将板用石蜡膜覆盖，加盖密封各孔。将板在2500-3000rpm下离心5分钟。[00701采用DVBSPE从衍生剂中提取棉酚。柱子依次用丙酮(0.5ml)和甲醇(0.5ml)洗涤，制备DVBSPE96孔板。然后，柱子用含有等量水和DMF混合物的溶液(0.5ml)保持湿润。[0071为了避免交叉污染，从装有蛾和衍生剂的96孔板小心地打开盖子并掀起石蜡膜。然后，将水(0.5ml)加到各孔中。将各个样品转移到DVBSPE96孔板的相应孔中，使之过柱。再将另外的DMF(0.5ml)加到装有蛾残余物的最初的96孔板中，将板用石蜡膜覆盖，然后加盖，涡旋1分钟，按3000rpm离心5分钟。离心后，把水(0.5ml)加到各孔中，将样品转移到DVBSPE96孔板的相应孔中。0072样品过柱后，柱子依次用20:80水:曱醇(0.5ml)和5:95丙酮曱醇(0.5ml)洗涤。随后，用丙酮(50(^1)把棉酚从柱子中洗脱到2ml或1.5ml96孔板中。从样品中除去丙酮，样品用温和的氮气流干燥。将样品保存于-2(TC直到用电喷雾离子化/质谱/质i普(ESI/MS/MS)进行分析。棉酚的HPLC/ESI/MS/MS测定[0073向各样品中加入丙酮(200|111),并将样品混匀。然后，将包含5吗/ml氘化衍生化双苯胺-棉酚(20^il)的溶液加到各个样品中作为内标。样品加盖后涡旋，然后转移到0.5ml96孔板中用于分析。[0074HPLC使用短柱(ZorbaxEclipseXBD-C18，购自AgilentTechnologies,Inc.)双溶剂流动相。溶剂A为10%水的曱醇溶液，溶剂B为2:1乙腈:丙酮。流速为0.25ml/分钟，梯度见表1。表l:HPLC溶剂梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>[0075质i普4义为Waters公司的MicromassQuattroUltimaLC/MS/MS检测器，包括电喷雾负离子化三重四极杆质谱仪(triplequadrupolemassspectrometerwithnegativeelectrosprayionization)。因为HPLC无法提供正确的双苯胺-棉酚电喷雾负离子化的电离基质，所以过HPLC柱后按0.05ml/分钟的流速，引入0.6%NH4OH的曱醇溶液。用混合T形接口(mixingT-connection)，完成NH4OH的MeOH溶液与HPLC洗脱液过柱后的混合。在MS/MS方式中，用第一个四极杆来篩选667.3表示双苯胺-棉酚负离子的质荷比。在第二个四极杆中，667.3质荷比在碰撞室内破碎。用第三个四极杆来筛选碎片离子一苯胺基-棉酚，其质荷比为574.2，这是因为失去了一个苯胺。检出第二碎片离子提供了改进的特异性，并增加了信噪比。[0076通过574.2m/z的峰面积与内标氘化双苯胺-棉酚峰面积的比率确定棉酚的半量子化。然后将这些比率与标准、空白和实验室饲养的对照蛾的结果相比较以确定棉酚是否存在。结果[0077如上所述，对伺养在烟草、棉花、大豆和花生植物的烟夜蛾幼虫的脂肪酸特征、可替宁的存在和棉酚的存在进行了分析。[0078为了确立各植物宿主的脂肪酸特征，对总离子流色谱图积分，获得各种脂肪酸(C16:0、C16:l、C18:0、C18:2和C18:3)的面积，合计得到总量。一种脂肪酸占总脂肪酸的百分比见下表2至表5。所有4种宿主植物的比较显示，每一种都有可用来与其它宿主区别的独特的脂肪酸特征。表2:花生植物饲养蛾的脂肪酸比率<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>[0079采用软独立建模分类法(SoftIndependentModelingforClassAnalogy,SIMCA),开发出基于4种作物每一种的饲养蛾脂肪酸特征的监督分类(supervisedclassification)。SIMCA模型开发为4种作物的每一种产生单独的主成分分析(PrincipalComponentAnalysis,PCA)模型或者分类模型。新的未知样品用各PCA模型进行分类，通过未知样品距PCA组模型的最小距离确定其组成员关系。参见图1-4。以S/S。对Ho作图显示，横坐标上样品至模型距离相对于平均模型距离(S/S。)，及各样品在纵坐标上的水平(leverage)。按5%显著水平的水平线和垂直线表示组限(classlimit)。可将两条横线内接近原点的未知样品划分为组模型成员。两条冲黄线以外的样品不属于组模型。图1-4显示可根据幼虫变态前饲喂的宿主植物，应用脂肪酸特征数据，对蛾样品进行分类。表6显示模型之间的距离。模型间距离越大，组间差异越大。一般而言，模型差异>3表示有显著差异的组模型。数值范围为200-45,000的，组it型显著不同，并可4艮据其组，对新样品进行分类。表6:棉花、烟草、大豆和花生植物之间的模型距离<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>0080棉酚的有效性试验在不同的两天内分两批单独进行。大多数昆虫饲养在棉花上。第一天进行第一批试验，包括苘麻、大豆和豌豆喂养的昆虫用于比较。预期该批将被证明为棉酚阴性。第二天，包括人工饲料喂养的昆虫作为阴性对照。这两天内，还进行空白和标准试-验作为额外的试验对照。[0081图5中的结果用电喷雾/质谱仪记录的信噪比表示，是电喷雾/质谱仪给出最一致的结果。也可使用质谱仪的其它响应参数，例如峰面积。提供以下每个处理组的最小、平均和最大信噪比人工饲料、苘麻、大豆、豌豆或棉花饲养昆虫(单独表示两天中棉花饲喂的昆虫)。选择信噪比的截止值12作为确定棉酚存在与否的数值(若大于该值，则样品为阳性；若小于或等于该值，则为阴性)。采用这些标准，试验中棉花伺养昆虫总被鉴定为棉酚阳性。对于棉花饲养蛾，信噪比通常〉100,几乎总>30，并从未<14。两天的最小值分别14和18,每天所测得的棉花铜喂昆虫的总数〉50。信噪比标准(signaltonoisecriteria)取决于总的方法，因此在实验室之间有所不同。因此，进行有效性研究以设定使假阴性最小的标准十分重要。[00821使用信噪比标准，棉酚HPLC-MS测定法有效性研究的结果见表7。发现所有棉花喂养蛾都是棉酚阳性的。其它不含棉酚植物的饲养蛾具有一定的假阳性比率。表7还表示非棉酚植物饲养的蛾存在一定的假阳性比率。也就是说，有些蛾可能被鉴定为在棉花上饲养，但是它们却不是在棉花上饲养的。例如，所测28只苘麻饲养蛾中有4只被鉴定为在棉花上饲养。[0083检测棉酚所设置的信噪比为12:1,试验成功鉴定出所有得自棉花的昆虫(棉酚阳性)，但是假阳性比率约为15°/。。也就是说，一定数量未在棉花上饲养的昆虫被保守地鉴定来自棉花。表7:有效性研究结果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>权利要求1.一种测定采食期的动物是否摄食过目标植物的方法，该方法包括筛选动物存在的目标植物的至少一种指示物。2.权利要求1的方法，其中所述指示物选自脂肪酸、生育酚、糖、黄酮类、生物碱、植物蛋白、遗传标记、矿物质、次生代谢物、其衍生物和它们的组合。3.权利要求1的方法，其中所述指示物选自烟碱、降烟碱、可替宁、降可替宁和棉酚。4.权利要求l的方法，其中所述动物是害虫。5.权利要求l的方法，其中所述动物是昆虫。6.权利要求l的方法，其中所述目标植物是作物。7.权利要求1的方法，其中所述目标植物是选自以下的作物棉花、玉米、油菜、玉蜀黍、烟草、大豆、花生、向日葵、水稻、苜蓿和小麦。8.权利要求l的方法，其中所述动物是谷实夜蛾或烟夜蛾。9.权利要求1的方法，其中所述指示物是黄酮类，选自花色素苷、黄烷醇、二氢黄酮、黄酮醇、黄酮和异黄酮。10.权利要求1的方法，其中所述指示物是生育酚，选自RRR-生育酚、(3-生育酚、Y-生育酚、5-生育酚、生育三烯酚、oc-生育三烯酚、，生育三烯酚和5-三烯甘油酯。11.权利要求l的方法，其中该方法还包括从动物中采集组织样品；从组织样品中提取脂肪酸；分析提取的脂肪酸以确定动物的脂肪酸特征；和将该动物的脂肪酸特征与已知在其生命周期中摄食过目标植物的动物的脂肪酸特征相比较。12.权利要求11的方法，其中该方法还包括使提取的脂肪酸进行酯交换以产生脂肪酸甲酯的混合物；和分离并检测脂肪酸甲酯的混合物以确定动物的脂肪酸特征。13.权利要求11的方法，其中所述方法按高通量形式实施，包括从大量动物中采集组织样品；将组织样品放入多孔板的各孔中；和筛选各组织样品存在的目标植物的一种或多种指示物。一14.权利要求13的方法，其中所述指示物选自脂肪酸、生育酚、糖、黄酮类、生物碱、植物蛋白、遗传标记、矿物质、其衍生物和它们的组合。15.权利要求13的方法，其中所述指示物选自烟碱、降烟碱、可替宁、降可替宁和棉酚。16.—种测定动物是否纟聂食过至少一种目标4直物的方法，该方法包括从动物中采集至少一种組织；测定组织的脂肪酸特征；和将该组织的脂肪酸特征与已知在其生命周期内摄食过目标植物的动物的脂肪酸特征相比较。17.权利要求16的方法，其中该方法还包括将组织与溶剂接触以便从组织中提取脂肪酸；使脂肪酸进行酯交换以制备脂肪酸曱酯的混合物；和分析脂肪酸曱酯的混合物以测定组织的脂肪酸特征。18.权利要求16的方法，其中所述目标植物是选自以下的作物棉花、玉米、油菜、玉蜀黍、烟草、大豆、花生、向日葵、水稻、苜蓿和小麦。19.权利要求16的方法，其中该方法还包括分析组织中存在的目标植物的至少一种指示物。20.权利要求19的方法，其中该方法包括测定组织的脂肪酸特征后，分析组织中存在的目标植物的至少一种指示物。21.权利要求19的方法，其中所述指示物选自脂肪酸、生育酚、糖、黄酮类、生物碱、植物蛋白、遗传标记、矿物质、次生代谢物、其衍生物和它们的组合。22.权利要求19的方法，其中所述指示物选自烟碱、降烟碱、可替宁、降可替宁和棉酚。23.权利要求16的方法，其中该方法包括测定成虫体内脂肪酸特征中C16:l和C18:l的相对含量，以确定采食期的昆虫是否摄食过棉花植物。24.权利要求23的方法，其中该方法还包括分析成虫的试验组织中存在的棉酚。25.权利要求16的方法，其中该方法包括测定成虫体内脂肪酸特征中C16:0、C18:l和C18:2的相对含量，以确定采食期的昆虫是否摄食过花生植物。26.权利要求25的方法，其中该方法还包括分析成虫的试验组织中存在的蛋白特异性变应原。27.权利要求26的方法，其中所述蛋白特异性变应原是白藜芦醇。28.权利要求16的方法，其中该方法包括测定成虫体内脂肪酸特征中C16:0和C18:3的相对含量，以确定采食期的昆虫是否摄食过烟草植物。29.权利要求28的方法，其中该方法还包括分析成虫的试验组织中存在的烟碱和/或烟碱衍生物。30.权利要求29的方法，其中所述烟碱衍生物选自可替宁、降可替宁、降烟》咸和其它烟-威代谢物。31.权利要求16的方法，其中该方法包括测定成虫体内脂肪酸特征中C16:0、C18:l、C18:2和C18:3的相对含量，以确定采食期的昆虫是否摄食过大豆植物。32.权利要求31的方法，其中该方法还包括分析成虫的试验组织中存在的至少一种异黄酮。33.权利要求32的方法，其中所述至少一种异黄酮选自染料木素、黄豆香元和黄豆黄素o34.—种测定与转基因作物相比的天然避难所区域的害虫的方法，该方法包^舌从转基因作物附近诱捕害虫；筛选诱捕害虫存在的至少一种目标植物的一种或多种指示物；和测定摄食转基因作物以外植物的害虫种群百分比。35.权利要求34的方法，其中所述指示物选自脂肪酸、生育酚、糖、黄酮类、生物碱、植物蛋白、遗传标记、矿物质、其衍生物和它们的组合。36.权利要求35的方法，其中所述指示物选自烟碱、降烟碱、可替宁、降可替宁和棉酚。37.权利要求34的方法，其中该方法还包括从采集到的害虫中采集至少一种组织；测定组织的脂肪酸特征；和将该组织的脂肪酸特征与已知在其生命周期内摄食过目标植物的害虫的脂肪酸特征进行比较。38.权利要求34的方法，其中所述害虫是昆虫。全文摘要本发明提供一种测定动物是否摄食过目标植物的方法。该方法包括筛选动物存在的目标植物的至少一种指示物。文档编号G01N33/50GK101351705SQ200680049961公开日2009年1月21日申请日期2006年11月1日优先权日2005年11月2日发明者G·P·赫德,J·T·格林普拉特,M·米尔科夫斯基,R·G·奥尔思,S·H·莫迪亚诺申请人:孟山都技术有限公司