专利名称：：改性心磷脂及其应用的制作方法
技术领域：
：0003]本公开内容涉及改性心磷脂组合物及其用途；尤其涉及将改性心磷脂固定至固体支持物上的方法，以及相关的免疫分析(如ELISA)和免疫分析装置(如测试条，流通装置或侧流装置)，所述分析和装置可以用于，例如，抗类脂抗体的检测和/或疾病(如梅毒)的诊断。
背景技术：
：根据一些专家，为了筛查和诊断的目的，非密螺旋体试验和密螺旋体试验的组合将进一步帮助梅毒检测。这是世界卫生组织(WorldHealthOrganization)提倡的方法，密螺旋体感染(TreponemalInfections)，技术报告丛书(TechnicalReportSeries)674，日内瓦WHO,1982。使用方便、快速、护理现场的检验，其能同时检测非密螺旋体和密螺旋体抗体，将有助于解决这一长期存在的需求。发明概述图3显示了含有4条十八碳双不饱和脂肪酸链的例示性心磷脂分子的示意性氧化反应。图示的心磷脂反应产物具有1条或4条氧化的脂肪酸侧链。实际上，氧化反应产物还包括氧化的心磷脂种类，其中任何两条或三条脂肪酸链被氧化成羧基。00221图4显示了用于将氧化的心磷脂与含胺连接分子，如蛋白质共价结合的示意性反应。在图示的例子中，连接分子是BSA。0023图5显示了用来测定氧化的心磷脂-BSA偶联物(表2中的"制品5")抗原性的斑点印迹分析的数字图像。{00241图6显示了可以使用本公开方法的侧流装置的5种不同形式实施方案的数字图像。(A)、(B)和(E)中所示的装置实施方案装配得使其各自可以浸入或部分浸没在样品或含有样品的溶液中。(C)和(D)中所示的装置实施方案装配成接纳一定体积的滴入进样口的样品(或含有样品的溶液)。0025图7是侧流装置的一种形式实施方案的透视图，其中去掉了部分外壳，以显示该装置的基本组件及其相互关系。00261图8显示了氧化的心磷脂-卵磷脂混合物的薄层色谱的数字图像。(A)未改性心磷脂和未改性卵磷脂在正丁醇中的混合物；(B)氧化的心磷脂/卵磷脂混合物；(C)心磷脂/卵磷脂混合物氧化过后的上层正丁醇相；和(D)心磷脂/卵磷脂混合物氧化过后的下层水相。各样品的迁移方向用箭头表示。在一种应用中，与多肽载体偶联的氧化心磷脂可以用来通过将心磷脂-多肽偶联物连接至侧流基体如硝化纤维素条来制造侧流色谱装置。提供多肽偶联的心磷脂的能力使得心磷脂可靠地连接在固体基体上。该基体还可以包括与梅毒密螺旋体抗体反应的密螺旋体抗原。同一固体支持物上(或中)心磷脂-多肽偶联物和密螺旋体抗原的存在方便地可以在临床上快速测试同一生物样本中的抗脂质和抗密螺旋体抗体。00331本文还公开了用于测定流体样品中抗类脂抗体的存在和/或量的免疫分析装置(如侧流或流通装置)。这些装置通常包括加样区和其中提供了固定的心磷脂-多肽偶联物的独立的心磷脂俘获区，所述偶联物对流动相抗类脂抗体具有特异性结合亲和力。加在加样区中的任何液体(如流体生物样品)沿着流径从加样区流向心磷脂俘获区。流径可以延伸至下游的与免疫分析装置连接的吸收垫，其至少部分起到贝i液器的作用。可以检测抗类脂抗体和固定的氧化心磷脂之间复合物的形成，以测定流体样品中抗类脂抗体的存在和/或量。用于本文所公开的方法和装置的一些实施方案的抗类脂抗体可以是任何起源，但最经常发现于对象的血清。抗体可以是单克隆或多克隆的。只作为举例，单克隆抗体可以根据Kohler和Milstein的经典方法(Nature256:495-497，1975)或其衍生方法从鼠杂交瘤制备。简而言之，小鼠在几周时间内重复接种几微克的所选分析化合物(或其片段)。在一些情况下，使用佐剂或载体分子对增加分析物在动物系统中的免疫原性和/或稳定性有益。然后处死小鼠，分离产生抗体的脾细胞。用聚乙二醇使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，过量未融合的细胞通过使系统在包含氨基蝶呤的选择性培养基(HAT培养基)上生长来破坏。将成功融合的细胞稀释，取等份稀释液置于微量滴定板的孔中，继续培养物的生长。产生抗体的克隆通过用免疫分析程序，如最初由Engvall描述的ELISA(Meth.Enzymol.70:419-439,1980)及其衍生方法检测孔的上清液中的抗体来鉴别。所选的阳性克隆可以扩增，收集其单克隆抗体产物待用。Harlow和Lane(抗体，实验室手册(Antibodies,ALaboratoryManual),CSHL,NewYork,1988)中描述了单克隆抗体产生的详细程序。抗原可以刺激动物中抗体产生或T细胞反应的化学或生物化学化合物、组合物、结构、决定簇、抗原或其部分，包括注射或吸收进入动物的组合物。抗原与特异性体液或细胞免疫的产物，包括由异种免疫原诱导的那些反应。术语"抗原"包括所有相关的抗原表位。心磷脂是响应疾病状态如梅毒密螺旋体感染而形成的抗类脂抗体的一种通常已知的特异性结合配偶体。天然存在的心磷脂已经常规用于联合胆固醇和卵磷脂使用，用于絮凝试验,以检测例如，梅毒密螺旋体感染患者血清中的抗类脂抗体。俘获试剂对以下物质具有特异性的未标记的特异性结合配偶体(i)分析物，如在三明治分析中，或(ii)检测试剂或分析物，如在竞争性分析中，或(iii)辅助特异性结合配偶体，其本身对分析物具有特异性，如在间接分析中。本文所用的"辅助特异性结合配偶体"是与分析物的特异性结合配偶体结合的特异性结合配偶体。例如，辅助特异性结合配偶体可以包括对另一个抗体特异的抗体，例如，山羊抗人抗体。"俘获区"是侧流装置中俘获试剂被固定的区域。侧流装置可以具有一个以上的俘获区，例如，"第一俘获区"，"第二俘获区"等。通常，第一、第二或其它俘获区中将固定不同的俘获试剂。侧流基体上的多个俘获区可以彼此具有任何取向；例如，第一俘获区可以在第二(或其它)俘获区的远端或近端，反之亦然。或者，第一俘获区和第二(或其它)俘获区可以彼此垂直取向，这样，这两个(或更多个)俘获区便形成了交叉或加号或其它符号。0066偶联(物)当用于动词形式时，术语"偶联"的意思是一个分子(例如，氧化的心磷脂)与另一个分子(例如，蛋白质)的共价偶联。这种偶联可以通过化学方法、用或不用连接基团完成。当用于名词形式时，术语"偶联物"的意思是通过偶联形成的偶联分子络合物。还原剂任何将来自心磷脂氧化的^-酮基还原成相应的/3-羟基而不引起其它氧化心磷脂官能团如脂肪酸酯基和/或磷酸酯的大量降解的还原剂。本领域技术人员可以从，例如，Larock，ComprehensiveOrganicTransformations(综合有机转化)，第二版，NewYork:JohnWiley&Sons,1999的教示中选择合适的还原剂。还原剂的具体例子包括亚硫酸氢钠，硫酸二甲酯，氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，硼氢化钠(NaBH4)，三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3),吗啉硼烷，三异丙氧基硼氢化钾，叔丁胺硼垸，二甲胺硼垸，吡啶硼烷，三乙胺硼垸，三甲胺硼烷。心磷脂是双磷脂酰甘油(具体为1，3-双磷脂酰甘油)，如下图所示，其具有由两个磷酸二酯桥连接的三个甘油分子组成的主链<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>心磷脂的外部甘油部分的四个羟基各自与饱和或不饱和脂肪酸链(长度通常为14-18个碳)酯化。本文所用术语"心磷脂"包括具有任何脂肪酸侧链分布的1，3-双磷脂酰甘油；条件是至少一条脂肪酸侧链含有至少一个OC双键。因此，心磷脂的四条脂肪酸侧链的长度(例如，约14至约25个碳，约14至约22个碳，约14至约20个碳，约14至约18个碳或约14至约16个碳)和/或饱和度(例如，完全饱和至含有约6个双键，完全饱和至含有约4个双键，或完全饱和至含有约2个双键)可以独立地变化。心磷脂的例示性脂肪酸侧链独立地包括肉豆蔻酰(14:0);棕榈酰(16:0);硬脂酰(18:0);油酰(18:1);肉豆蔻油酰(14:1);棕榈油酰(16:1);岩芹酰(18:1);亚油酰(18:2);亚麻酰(18:3);二十碳烯酰(20:1);花生四烯酰(20:4);芥酰(22:1);DHA(22:6);或神经酰(24:1)。—种可用于氧化心磷脂的方法采用了高碘酸根(KV)禾口/或高锰酸根(Mn04—)作为氧化剂。这些氧化剂的盐包含任何提供电中性化合物的反离子。高碘酸根通常为高碘酸盐，如NaI04或HI04(高碘酸)的形式，高锰酸根通常为盐的形式(如钠或钾盐)，例如KMn04。在一个具体实施方案中，Nal04和KMn04被用作氧化剂。为实施该氧化方法，将获自任何来源的心磷脂加入到将基本溶解心磷脂的任何溶剂中。鉴于心磷脂的疏水性，优选使用极性有机溶剂，如正丁醇，乙醇，甲醇，丙醇，丙酮，二甲基甲酰胺或乙醚。其它非极性有机溶剂可以用于使心磷脂混悬，如氯仿；然而，这些非极性有机溶剂较少使用，因为氧化反应的其它组分(如下文所述)在这些溶剂中不如例如极性有机溶剂或含水溶剂可溶。氧化反应混合物可以在任何不阻止反应发生的温度下发生。类似地，反应可以进行足以导致心磷脂的至少一条脂肪酸侧链氧化降解的任何时间量。如本领域技术人员将了解的那样，反应时间将取决于数种变量，包括反应温度，溶剂类型和反应物及产物浓度，这些变量每个都可以通过常规实验容易地进行优化。在一个实施例中，氧化反应发生在室温，并进行了至少24-48小时。本文中氧化心磷脂的供应提供了至少一个以其它方式在天然存在或合成心磷脂中不能得到的反应性羧基。因此，氧化心磷脂可以通过本领域已知和/或本文所述的任何方法，经氧化产生的反应性基团与连接分子相连。这种连接可以用或不用其它连接基团。有许多不同方法可以用于产生氧化心磷脂与连接分子间的连接。00117图4示意性显示了用于连接氧化心磷脂和含胺连接分子(例如，蛋白质，如BSA，合成蛋白质MAPS，IgY，链霉亲和素，亲和素或KLH)的一个例示性方法。图4中的反应说明，如本文所述通过心磷脂的脂肪酸侧链的氧化裂解产生的羧基可以用EDC联合NHS(或Sulfo-NHS，如图4所示)修饰成胺反应性NHS酯。氧化心磷脂NHS酯然后与连接分子如图4中所示BSA中存在的胺基反应，在氧化心磷脂与连接分子间形成酰胺键。将氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物固定在固相上的适宜方法包括离子、疏水、共价相互作用等。固相(参见，例如，章节II)可以就其固有的吸引和固定氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物的能力进行选择。或者，固相可以具备某种因素，该因素具有吸引和固定氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物的能力。该因素可以包括，例如，相对于氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物带有相反电荷的荷电物质，或者，例如，相对于和氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物偶联的荷电物质带有相反电荷的荷电物质。再或者，该因素可以是任何特异性结合配偶体，例如，亲和素或链霉亲和素，其固定在固相上，并且通过特异性结合反应具有固定氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物例如生物素化氧化心磷脂的能力。00120j在本文中方法和装置的一些实施方案中，氧化心磷脂或氧化心磷脂-连接分子复合物可以作检测试剂用，因此将与标记偶联。可以通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何分子或组合物都可以作为标记使用。标记的例子，包括酶、胶体金颗粒、有色乳胶颗粒现已公开(美国专利No.4,275,149;4,313,734;4,373,932;和4,954,452，其各自引入本文作为参考)。可用标记的其它例子包括但不限于辅因子，配体，化学发光或荧光剂，吸附蛋白质的银颗粒，吸附蛋白质的铁颗粒，吸附蛋白质的铜颗粒，吸附蛋白质的硒颗粒，吸附蛋白质的硫颗粒，吸附蛋白质的碲颗粒，吸附蛋白质的碳颗粒和蛋白偶联染料囊。现有许多市场上可买到的侧流型检验和专利公开方法，用于大分析物(MW大于1,000道尔顿)的检测。美国专利No.5,229,073描述了用于测量血浆脂蛋白水平的半定量竞争性侧流免疫分析法。该方法采用多个含有固定抗体的俘获区或线，以结合标记和游离脂蛋白，给出半定量结果。在免疫分析装置的应用中要考虑的另一个共同特征是检测分析物(如抗类脂抗体)与俘获试剂(如氧化心磷脂-连接分子复合物)间复合物的形成的方法。检测剂(也称作检测试剂)为该目的服务。检测剂可以整合入免疫分析装置(例如，如下文所述包括在偶联垫中)，或者可以从外源加入到装置中。00143检测剂可以是单一试剂或共同为检测目的服务的系列试剂。在一些情况下，检测试剂是分析物特异性的标记结合配偶体(如，用于抗体分析物的金偶联蛋白A，或用于人抗体分析物的金-标记抗人Ab(Fc)，或用于抗类脂抗体分析物的金-标记氧化心磷脂)。在其它情况下，检测试剂共同包括分析物特异性的未标记第一结合配偶体和所述第一结合配偶体特异性的标记第二结合配偶体等。在各种情况下，检测试剂特异性检测分析物-俘获试剂复合物的结合分析物，因此，检测试剂优选基本上不与俘获试剂或位于分析物俘获区的其它组分结合或反应。这种检测剂的非特异性结合或反应可以提供假阳性结果。任选地，检测试剂可以特异性识别存在于第二俘获区的阳性对照分子(如标记蛋白A检测剂、或标记蛋白G检测剂、或标记抗人Ab(Fc)的非特异性人IgG)。B.流通装置的构造和设计在流通装置的操作中，将流体样品(如体液样品)置于与膜接触。通常，流通装置还包括接收和暂时保留所需体积的流体样品的加样区(或贮器)。样品通过膜基质。在该过程中，样品中的分析物(如抗类脂抗体)可以特异性地结合固定的俘获试剂(如氧化心磷脂-连接分子复合物)。当需要检测分析物-俘获试剂复合物时，可以加入检测试剂(如标记蛋白A，标记蛋白G，标记抗人IgG或标记心磷脂)和样品，或者可以在加样后加入含有检测试剂的溶液。如果分析物被俘获试剂特异性结合，则在膜表面上可以观察到可归因于特定检测试剂的视觉表现。在该过程的任何时间，例如，在加样后和/或在加入检测试剂后，都可以加入任选的洗涤步骤。C.侧流装置的构造和设计侧流装置具有很多种同样为本领域所公知的物理形式。支持和/或容纳功能关系正确的侧流装置的基本组件的任何物理形式均包括在本公开内容中。图7显示了侧流装置的几个实施例。这些实施例表现了一些可用于侧流装置的构造的物理实施方案。样品垫(如图8中的样品垫14)是侧流装置的任选部件，其最初接收样品，并起到从样品中除去微粒的作用。在可用来构建样品垫的各种材料(见表l)中，如果较大的床体积(例如，250/d/cm2)是特定应用的因素，则纤维素样品垫是有益的。样品垫可以用一种或多种释放剂处理，如缓冲剂、盐、蛋白质、洗涤剂和表面活性剂。这些释放剂对例如，促进偶联物垫成分的再溶解，以及阻断侧流装置的其它组件如硝化纤维素膜中的非特异性结合位点有用。代表性释放剂包括，例如，海藻糖或葡萄糖(1%-5%)，PVP或PVA(0.5%-2%)，吐温20或TritonX-100(0.1%-1%)，酪蛋白(1%-2°/0)，SDS(0.02%-5%)和PEG(0,02%-5%)。2.膜和施加溶液00156前面已经讨论过了可用于侧流装置的膜的类型(如硝化纤维素，尼龙和PVDF)以及对将俘获试剂加入这些膜的考虑。3.偶联物垫001571偶联物垫(如图8中的偶联物垫20)尤其起到容纳检测试剂的作用。在一些实施方案中，检测试剂可以从例如，显色剂瓶外加，在这种情况下，侧流装置不需要包含偶联物垫(参见，例如，美国专利No.4,740,468)。完成心磷脂氧化后，在不断搅棒下通过加入80mg亚硫酸氢钠的200yl蒸馏水，停止NaKVKMn04反应混合物反应。然后有色混合物变成无色(比较图1B和图1C)。停止反应的混合物以1000Xg离心5min。离心后，可见两相(图1D)。001781任选地，将上清正丁醇相置于蒸发圆底烧瓶中，并在真空下干燥。或者，正丁醇相用10mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)或其它缓冲液透析，将醇溶剂置换成适于其中含有氧化心磷脂的下一个计划应用的溶液，例如，在免疫色谱分析中使用，或者，例如，与连接分子偶联。如图2所示，正如泳道A中距离原点最远的黑斑所表明的那样，未改性心磷脂主要迁移至TLC测试条的顶端。如章节IV中所述，心磷脂天然包括分子的异质群体。由于亚油酸占心磷脂的脂肪酸侧链的约卯％，因此图2泳道A中的黑斑可能代表主要含亚油酸的心磷脂分子(以及密切相关的心磷脂形式)。较少表现的心磷脂形式很可能具有不同迁移率，并可以解释在迁移的方向上泳道A中观察到的轻微污迹。100180如前所示，心磷脂的氧化氧化了烯烃，裂解了脂肪酸侧链，并向一条或多条脂肪酸侧链中引入了羧基。氧化心磷脂中存在的羧基与TLC测试条的氧化硅基质的相互作用更强，这阻碍了氧化心磷脂形式沿测试条的迁移。因此，在氧化心磷脂制品(见图2，泳道B和D1)中，迁移方向上的污迹变得更显著(比较泳道A与泳道B和D1)。此外，脂肪酸侧链的氧化裂解产生了烷基羧化物，其在这些条件下在TLC测试条上具有的迁移率很小。如图2的泳道B和D2所示，认为与原点同延的白斑(由于染料排斥)代表羧化物。如本实施例中所述进行心磷脂氧化后，心磷脂的氧化形式主要存在于正丁醇相(在图2，泳道Dl中显示)中，而烷基羧化物则主要存在于水相(见图2，泳道D2)。00181如通过与梅毒血清的反应性(参见，例如，实施例4)判断的那样，上层正丁醇相("醇相")(见图2，泳道Dl)含有氧化心磷脂种类，而下层水相(见图2，泳道D2)根据TLC结果，被认为主要含有丙二酸和己酸副产物的混合物。实施例2氧化心磷脂的活化和与连接分子的偶联100182]本实施例说明了用EDC和NHS使氧化心磷脂与BSA或KLH偶联的几种方法。A.方法一如前所述，在实施例1的条件下进行的氧化氧化了烯烃，裂解了脂肪酸侧链，并向心磷脂和卵磷脂的一条或多条脂肪酸侧链中引入了羧基。氧化的分子中存在的羧基与TLC条的氧化硅基体的相互作用更强，这阻碍了氧化形式沿条的迁移。因此，在心磷脂和卵磷脂的氧化混合物中，观察到了迁移方向上的显著污迹(见图8，泳道B和C)。此外，脂肪酸侧链的氧化裂解产生了垸基羧化物，其在这些条件下在TLC条上的迁移率很小。如图8的泳道D明显看出，羧化物被认为由与原点同延的白斑(由于染料排斥)所代表。如本实施例中所述心磷脂/卵磷脂混合物氧化后，心磷脂的氧化形式主要存在于正丁醇相(在图8，泳道C中显示)中，而垸基羧化物则主要存在于水相(见图8，泳道D)。A.氧化心磷脂/卵磷脂混合物的BSA和KLH偶联物00219如实施例2的方法3所述，将心磷脂和卵磷脂的氧化混合物与BSA或KLH偶联。表5中描述了BSA-或KLH-偶联的心磷脂/卵磷脂制品。表5.心磷脂/卵磷脂混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>表5.心磷脂/卵磷脂混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>B.氧化的心磷脂/卵磷脂混合物的RPR抑制试验从被认为处于产生血清水平的抗类脂抗体的病症风险下的人类对象收集全血。这些病症包括，例如，梅毒密螺旋体感染(即，梅毒)或狼疮。通过本领域公知方法，从全血分离血清。用例如，生理盐水或其它不使其变性或以其它方式影响血清中存在的抗类脂抗体的特异性结合或以其它方式干扰所述方法的溶液稀释血清。[00226将血清样品加到含有移动或可移动的标记的氧化心磷脂-蛋白质偶联物检测试剂的硝化纤维素条上。该偶联物可以是，例如，金标记的氧化心磷脂-BSA，或金标记的氧化心磷脂-KLH偶联物，或氧化心磷脂和氧化卵磷脂的金标记的BSA偶联混合物，或氧化心磷脂和氧化卵磷脂的金标记的KLH偶联混合物。[00227血清样品中存在的抗类脂抗体将与检测试剂的心磷脂结合，并流向(如通过毛细作用，或通过侧流力)硝化纤维素条中固定了蛋白A或抗人抗体俘获试剂的部分。与心磷脂检测试剂复合的抗类脂抗体将被蛋白A或抗人抗体俘获试剂俘获。以这种方式累积检测试剂复合物将导致硝化纤维素上在固定了俘获试剂的区域中出现可检测的信号(例如，可见信号)。00228所述可检测信号的出现表明血清样品中存在抗类脂抗体，并可用于某些病症如梅毒或狼疮的诊断。实施例10用酶联免疫分析检测人血清中的抗类脂抗体00229本实施例证明了人血清中存在的抗类脂抗体可以用固定在用于迸行酶联免疫分析的微量滴定板中的、与BSA或KLH偶联的氧化心磷脂作为俘获试剂进行检测。BSA和KLH的替代物包括合成蛋白MAPS，IgY，链霉亲和素和亲和素。将96孔微量滴定板的孔用100pl(10貼/ml)含有10(xg/ml氧化心磷脂-BSA或氧化心磷脂-KLH复合物的溶液包被。令溶液在37°C干燥过夜。然后各孔用至少200川1%酪蛋白的Tris磷酸盐缓冲盐水(TPBS)溶液(pH7.2)在室温下阻断2h。各孔用200[ilTPBS洗涤一次。然后，将100jil用1%酪蛋白TPBS1:20、1:40、1:80或1:160稀释的人血清(对照或来自梅毒感染个体)加入各孔。微量滴定板在室温孵育60min;然后用200idTBST洗涤3次。在室温下向各孔中加入100(il用1%酪蛋白TPBS以l:3000稀释的、与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人抗体45min。用TPBS洗涤微量滴定板3次，然后每孔加入100^TMB底物。在HRP存在下，TMB底物变色。加入2M硫酸，停止HRP酶-底物反应。分光光度法在450nm处读出各孔中溶液。[00230如表7和8所示，人梅毒血清("反应性")中存在的抗类脂抗体与固定在微量滴定板的孔中的氧化心磷脂-BSA或-KLH复合物结合。然而，对照("非反应性")血清与同样的固定抗原却无明显结合。表7.用氧化心磷脂-BSA抗原进行酶联免疫分析<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>各数据点进行重复试验(结果已显示)。RPR试验测得该数据组所用梅毒血清具有1:64的滴度。Table8.用氧化心磷脂-BSA抗原进行酶联免疫分析<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>_Table8.用氧化心磷脂-BSA抗原进行酶联免疫分析_各数据点进行重复试验(结果已显示)。RPR试验测得该数据组所用梅毒血清具有1:128的滴度。00231尽管本公幵内容已重点对特定实施方案进行了描述，但对本领域普通技术人员而言，显而易见的是可以使用特定实施方案的变体，并打算本公开内容可以以本文具体描述之外的方式实施。与本发明的具体方面、实施方案或实施例结合进行描述的特征、特性、化合物、化学部分或例子应理解为适用于本发明的任何其它方面、实施方案或实施例。因此，本公开内容包括所附权利要求书限定的本公开内容的精神和范围内涵盖的所有修改。权利要求1.与抗类脂抗体具有免疫反应性、并且能结合蛋白质以连接至基体上的氧化心磷脂的制备方法，其中心磷脂包括中心甘油部分和脂肪酸侧链，该方法包括使心磷脂与高碘酸盐和高锰酸盐反应，以氧化心磷脂的脂肪酸侧链，从而在一条或多条侧链上提供末端羧基；在心磷脂与高碘酸盐和高锰酸盐反应后，向心磷脂悬浮液中加入还原剂，以淬灭心磷脂的氧化和将中心甘油部分中形成的β-酮还原成β-羟基，从而保留中心甘油部分的免疫原性；以及活化氧化心磷脂的羧基，使蛋白质载体与至少一个羧基共价连接。2.权利要求l的方法，其中心磷脂的反应发生在醇溶剂中。3.权利要求1或2的方法，其中心磷脂的反应发生在氩气氛中。4.权利要求2的方法，其中醇是正丁醇、乙醇、丙醇或甲醇中的一种或多种。5.权利要求l-4任一项的方法，其中活化羧基包括使氧化心磷脂与碳二亚胺反应。6.权利要求5的方法，其中碳二亚胺包括l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。7.权利要求l-6任一项的方法，其中在心磷脂与高锰酸盐反应之前心磷脂与高碘酸盐反应。8.利要求1-8任一项的方法，其中高碘酸盐是偏高碘酸钠，并且高锰酸盐是高锰酸钾。9.权利要求8的方法，其中偏高碘酸钠与心磷脂的摩尔比为约4:1至约5:1。10.权利要求8的方法，其中高锰酸钾与心磷脂的摩尔比为约0.5:1至约1:1。11.权利要求l-10任一项的方法，其中还原剂是亚硫酸氢钠。12.权利要求1-11任一项的方法，还包括在加入还原剂后分离水相和醇相，以及从醇相中回收氧化的心磷脂。13.权利要求l-12任一项的方法，还包括使蛋白质与至少一个活化的羧基共价连接，以提供心磷脂-蛋白质偶联物。14.权利要求13的方法，其中共价连接蛋白质包括连接牛血清白蛋白(BSA)，匙孔血蓝蛋白(KLH)或亲和素。15.权利要求5的方法，其中活化羧基还包括在羧基与EDC反应后，使羧基与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应。16.权利要求13的方法，其中共价连接蛋白质包括通过使氧化心磷脂与碳二亚胺和然后与NHS反应以提供产物来活化羧基，然后使该产物与蛋白质偶联。17.权利要求16的方法，其中蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)，匙孔血蓝蛋白(KLH)或亲和素。18.与抗类脂抗体具有免疫反应性、并且能结合蛋白质以连接至基体上的氧化心磷脂的制备方法，其中心磷脂包括中心甘油部分和脂肪酸侧链，该方法包括使心磷脂与偏高碘酸钠和高锰酸钾在正丁醇溶剂中于氩气氛下反应，以氧化心磷脂，并在一条或多条脂肪酸侧链上提供末端羧基；在心磷脂与偏高碘酸钠和高锰酸钾反应后，向心磷脂悬浮液中加入亚硫酸氢钠水溶液，以淬灭心磷脂的氧化和将中心甘油部分中形成的/5-酮还原成0-羟基，从而保留中心甘油部分的免疫原性；以及活化氧化心磷脂的末端羧基，使蛋白质载体与至少一个羧基共价连接，其中活化羧基包括使氧化心磷脂与EDC和然后与NHS反应；和使蛋白质与一个或多个活化羧基偶联。19.制造侧流装置的方法，包括向侧流基体连接通过权利要求13的方法制备的偶联蛋白质。20.权利要求19的方法，还包括向侧流基体连接与梅毒密螺旋体抗体反应的密螺旋体抗原。21.权利要求19或20的方法，其中基体是硝化纤维素基体。22.制造侧流装置的方法，包括向侧流基体连接通过权利要求18的方法制备的偶联蛋白质。23.权利要求22的方法，还包括向侧流基体连接与梅毒密螺旋体抗体反应的密螺旋体抗原。24.权利要求22或23的方法，其中基体是硝化纤维素基体。25.通过权利要求19-24任一项的方法制造的侧流装置。26.用于测定流体样品中抗类脂抗体的存在和/或量的侧流装置，包括加样区；和心磷脂俘获区，包括对抗类脂抗体具有结合亲和力的固定的氧化心磷脂；其中加在加样区中施加的液体以从加样区流向心磷脂俘获区的流动方向流动，并且抗类脂抗体和固定的氧化心磷脂间的复合物的形成是能被检测的，以确定流体样品中抗类脂抗体的存在和/或量。27.权利要求26的侧流装置，还包括在从加样区到心磷脂俘获区的流动通道中的偶联物垫，其中偶联物垫包括移动或可移动的检测试剂。28.权利要求27的侧流装置，其中固定的氧化心磷脂的制备方法包括在保留心磷脂的抗原性的同时，使心磷脂与高碘酸盐和高锰酸盐反应，以氧化心磷脂的脂肪酸侧链；在心磷脂与高碘酸盐和高锰酸盐反应后，向心磷脂悬浮液中加入还原剂；和活化氧化心磷脂的羧基，使蛋白质载体与至少一个羧基共价连接；然后共价连接蛋白质载体。29.权利要求28的装置，其中检测试剂包括标记的氧化心磷脂。30.权利要求29的装置，其中标记的氧化心磷脂包括标记，其中标记包括酶、胶体金颗粒、有色乳胶颗粒、吸附蛋白质的银颗粒、吸附蛋白质的铁颗粒、吸附蛋白质的铜颗粒、吸附蛋白质的硒颗粒、吸附蛋白质的硫颗粒、吸附蛋白质的碲颗粒、吸附蛋白质的碳颗粒或蛋白偶联染料囊中的一种或多种。31.权利要求26的装置，其中固定的氧化心磷脂根据权利要求18的方法制备。32.权利要求26的装置，还包括在始自加样区的流动通道中的密螺旋体俘获区，所述密螺旋体俘获区包括对抗梅毒密螺旋体抗体具有结合亲和力的固定的密螺旋体抗原。33.权利要求32的装置，还包括在加样区至密螺旋体俘获区的流动通道中的偶联物垫，其中所述偶联物垫包括密螺旋体抗原的移动或可移动的检测试剂。34.权利要求33的装置，其中偶联物垫还包括心磷脂的移动或可移动的检测试剂。35.通过分析来自对象的生物样品诊断梅毒的方法，包括将生物样品施加到权利要求27的装置中；和在俘获区检测抗类脂抗体、氧化心磷脂和检测试剂间复合物的形成，其中对俘获区中复合物形成的检测检测了样品中的抗类脂抗体。36.权利要求35的方法，其中所述装置还包括在加样区至心磷脂俘获区的流动通道中的偶联物垫，其中偶联物垫包括心磷脂的移动或可移动的检测试剂，并且检测复合物的形成包括检测包含移动或可移动的检测试剂的复合物的形成。37.权利要求35或36的方法，其中固定的氧化心磷脂通过心磷脂与高碘酸盐和高锰酸盐反应，使心磷脂氧化，活化氧化心磷脂的羧基使蛋白质载体与至少一个羧基共价连接，然后共价连接蛋白质载体而制得。38.权利要求36的方法，其中检测试剂包括标记的氧化心磷脂。39.权利要求38的方法，其中标记的氧化心磷脂包括标记，其中标记包括酶、胶体金颗粒、有色乳胶颗粒、吸附蛋白质的银颗粒、吸附蛋白质的铁颗粒、吸附蛋白质的铜颗粒、吸附蛋白质的硒颗粒、吸附蛋白质的硫颗粒、吸附蛋白质的碲颗粒、吸附蛋白质的碳颗粒或蛋白偶联染料囊中的一种或多种。40.权利要求38的方法，其中固定的氧化心磷脂根据权利要求18的方法制备。41.权利要求35的方法，其中所述装置还包括在始自加样区的流动通道中的密螺旋体俘获区，所述密螺旋体俘获区包括对抗梅毒密螺旋体抗体具有结合亲和力的固定的密螺旋体抗原，并且检测复合物的形成还包括检测俘获区中抗梅毒密螺旋体抗体、固定的密螺旋体抗原和检测试剂间复合物的形成。42.用于同时检测流体样品中密螺旋体抗体和抗类脂抗体的存在和/或量的装置，包括加样区；包括至少一种移动或可移动的检测试剂的偶联物垫；包括对抗类脂抗体具有结合亲和力的固定的氧化心磷脂的第一俘获区；禾口包括对密螺旋体抗体具有结合亲和力的第二固定结合配偶体的第二俘获区；其中置于加样区上的液体从加样区经偶联物垫向第一和第二俘获区的流动方向流动，并且，第一俘获区中抗类脂抗体、氧化心磷脂和至少一种检测试剂间的第一复合物的形成确定了流体样品中抗类脂抗体的存在和/或量，而第二俘获区中密螺旋体抗体、第二固定结合配偶体和至少一种检测试剂间的第二复合物的形成确定了流体样品中密螺旋体抗体的存在和/或量。43.诊断患者梅毒的方法，包括将生物样品施加到权利要求42的装置的加样区，使生物样品以流过偶联物垫并流过第一及第二俘获区的流动方向流动；检测第一俘获区中抗类脂抗体、氧化心磷脂和至少一种检测试剂间的第一复合物的形成；和检测第二俘获区中密螺旋体抗体、第二固定结合配偶体和至少一种检测试剂间的第二复合物的形成；其中对第一复合物和第二复合物的形成的检测诊断了患者的梅毒。44.权利要求43的方法，其中加到加样区的生物样品是人的血样。45.权利要求44的方法，其中加到加样区的人的血样是全血或血清。46.用于诊断梅毒的试剂盒，包括根据权利要求27的装置，将生物样品施加到加样区和解释试验结果的说明书。47.通过分析来自对象的生物样品来诊断狼疮的方法，包括将生物样品施加到权利要求27的装置；和检测俘获区中抗类脂抗体、氧化心磷脂和检测试剂间的复合物的形成，其中对俘获区中复合物的形成的检测检测了样品中的抗类脂抗体。全文摘要本发明描述了用于检测抗类脂抗体和诊断疾病例如梅毒的组合物、方法和装置。尤其是描述了氧化心磷脂，其可以与各种各样的连接分子如BSA、KLH、生物素、合成蛋白质MAPS、IgY、链霉亲和素或亲和素偶联。这种氧化心磷脂，单独或与一种或多种连接分子复合，在例如，用于侧流装置时，可用来检测对象的抗类脂抗体。还描述了可以检测抗类脂抗体和可以共同检测生物样品中的非密螺旋体和密螺旋体抗体的侧流装置。文档编号G01N33/571GK101360997SQ200680051254公开日2009年2月4日申请日期2006年11月17日优先权日2005年11月18日发明者王慧英,阿诺德·R·卡斯特罗申请人:美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心