治疗肺癌的方法

专利名称：：治疗肺癌的方法
技术领域：
：本发明涉及肺癌的治疗。
背景技术：
：表皮生长因子受体(EGFR)在来源于各种组织的实体癌的生长中具有重要的作用，并且在被调查的40%到80。/。的非小细胞肺癌中过表达(SalomonDS,etal"Crit.Rev.Oncol.Hematol.1995;19:183-232;和MendelsohnJ,etal.，Oncogene2000;19:6550-65)。EGFR的过表达也与肺癌患者的预后不良相关(SelvaggiG，etal,,Ann.Oncol.2004;15:28-32)。吉非替尼(Gefitinib)(易瑞莎(Iressa)，ZD1839)是一种口服的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，该酶是参与癌细胞的扩散、浸润和存活的EGFR信号通路中的关键酶(WakelingAE,etal.，CancerRes2002;62:5749-54)。在针对使用铂制剂化疗未见效的进行性非小细胞肺癌患者的临床试验中，吉非替尼已经展示出了有效的抗肿瘤效果(FukuokaM,etal.,J.Clin.Oncol.2003;21:2237-46.;KimYH,etal.,Clin.CancerRes.2004;10:7311-7)。基于这些发现，在包括日本、澳大利亚和美国在内的几个国家已经使用吉非替尼来治疗晚期非小细胞肺癌。在曰本，自从该药得到批准之后，已经用其治疗了大约37,000例患有晚期非小细胞肺癌的患者(EvansTL.Oncologist2004;9:232-8)。虽然吉非替尼对于那些日本人患者中的很多人能有效地改善预后和QOL,但是这些患者中的60%没有显示出症状上的改善。不仅如此，5.4%的患者已经患有严重的吉非替尼诱导的急性间质性肺病(TakanoT，etal.,LungCancer2004;45:93-104)。因此，需要提供一种指标，使医师能够选择吉非替尼能够起作用的患者。然而，到目前为止，在包括体内EGFR突变在内的已净皮4企-险的因素中，无一能够确定患者对吉非替尼施用的应答性(从疾病控制或者改善存活率方面看)。具体地，目前没有已知的指标能够准确地区分对吉非替尼应答性低的患者和对吉非替尼有应答的患者。有报道称，可以基于存在EGFR突变来预计有可能对吉非替尼有部分应答(PR)的患者。然而，无法明确地显示维持状况稳定的患者能够获得延长生存的效果(LynchTJ,etal.，N.Engl.J.Med.2004;350:2129-39.;PaezJGetal.，Science2004;304:1497-500.;PaoW，etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004;101:13306-ll.;TokumoM，etal.,Clin.CancerRes.2005;11:1167-73.;MitsudomiT,etal.，J.Clin,Oncol.2005;23:2513-20)。近来，通过对在晚期非小细胞肺癌中表达的基因的表达信息的统计分析，鉴定出了与对吉非替尼的应答相关的十二个基因。而且，已经提出了基于基因的表达水平的吉非替尼应答评分系统，其中在对吉非替尼施用有部分应答(PR)的患者群和进展性疾病(PD)的患者群之间，该基因的表达有极大的不同(KakiuchiS，etal.,Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43.;WO2005/49829)。专利文献1:WO2005/49829非专利文献1:KakiuchiS,etal.，Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43.
发明内容本发明所要解决的问题本发明的一个目的是提供用于肺癌治疗的新技术。具体地，提供用于区别对于以吉非替尼为代表的erbB受体抑制剂有反应的肺癌患者和对该抑制剂显示出较低反应的肺癌患者的技术，使人们能够对预期有反应的患者施用erbB受体抑制剂。可选地，本发明优选的实施方案提供能够高灵敏地检测对于erbB受体抑制剂应答性较低的患者的技术。解决问题的方法基于吉非替尼反应的计分系统得到的预测结果(KakiuchiS,"a/.，Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43.;WO2005/49829)在所有追加检查的病例(PR和PD)中与吉非替尼的临床应答性是一致的。此外，该系统可以将病况稳定(SD)的患者群区分成两组一组患者的肿瘤能够长时间地维持在稳定状态下，另一组则不能。然而，对表达谱或者突变的分析需要通过活检或者手术获得临床样本。事实上，对于晚期非小细胞肺癌的病例通常不实施活检或者手术。因此，从患者获得用于评分必须的样品是困难的。因此，吉非替尼反应评分系统是难于应用到临床上的方法。因此，急需开发能够通过使用血清学标志预测肺癌对于吉非替尼治疗是敏感性还是抗性的方法。作为向该目标迈出的一步，通过上文提及的cDNA微阵列分析，发现两种EGFR配体的编码基因在来源于对吉非替尼无应答的患者的肿瘤组织中是过表达的，这两种配体为双调蛋白(下文中称为AREG)和转化生长因子a(TGF-a,下文中称为TGFA)(KakiuchiS,Wa/.，HumMolGenet2004;13:3029-43)。也已经指出了利用血清中TGFA水平作为针对吉非替尼应答性的预测指示剂的可能性(WO2005/49829)。虽然如此，当仅使用血中TGFA水平作为指标时，有超过一半的无应答患者不能从有应答患者中区分出来。具体地，基于血中TGFA水平被判方面，基于血中TGFA水平被判定为阴性的患者中，也包括很多对于吉非替尼低应答的患者。就是说，血中TGFA水平是显示高特异度的指标，但是从灵敏度上来看，当检测对于吉非替尼应答性较低的患者时仍有提升的空间。'因此，需要能够准确区分吉非替尼有应答的患者和无应答的患者的方法。更具体地说，本发明的目的是提高对于吉非替尼应答性低的患者的检测的灵敏度。使用血中的物质作为指标来对吉非替尼应答性进行预测具有如下的优点易于收集待测样品(血液)例如，对于患者而言，与活检样品或者手术切除癌组织相比，收集血液样品显然具有更少的负担(更少侵害)；以及易于进行定量检测血液中的标志物的优点包括能够使用诸如免疫检测方法这样的简单的方法来对该标志物进行快速、定量的分析。然而，血液中的TGFA---"种已知的用于预测对于吉非替尼应答性的标志物，以检测对吉非替尼应答性较低的患者的灵敏度的角度来说，仍有提升的空间。检测灵敏度，意思是具有待检表型(即"低应答性"表型)的患者的检测灵敏度。换句话说，特定血液标志物的"检测灵敏度"，可以看成通过使用血液标志物作为指标的预测方法所发现的患者数占具有待测表型的患者之总数的比例。或者，可以将其考虑为基于该血液标志物的测定值能够发现目标患者的概率。因此，当检测灵敏度较低时，遗漏掉具有待测表型的患者的可能性就较高。应该被检测到但是却被遗漏的患者，在统计学上称为假阴性。血液中标志物的检测灵敏度是统计学计算出的数值。通常，从统计学上来说，在检测灵敏度和假阳性率之间有一种权衡取舍的关系(tradeoff)。例如，可以通过设定较低的截断(cutoff)值来增加检测灵敏度。然而，当截断值设定得较低时，不仅检测灵敏度会增加，噪音(假阳性)也会增加。此处，噪音与"有应答性的患者"相对应。换句话说，这意味着实际上有应答性而却被判定为应答性低患者的患者数会增加。这样，如果截断值降低，通常不可避免地会降低预测精度。因此，用于检测特定表型的标志物的检测灵敏度，是该标志物的固有的统计学数值。本发明人以提高基于血液中TGFA水平来预测应答性的方法的检测灵敏度为目的进行了深入研究。结果，本发明人发现，使用TGFA和双调蛋白(AREG)这两种标志物的血液水平作为指标，与单独使用血液中TGFA来预测相比，可以极大地提高检测灵敏度，并因此完成了本发明。具体地，本发明涉及下面所述的检测针对肺癌治疗剂应答性的方法、基于该检测的方法的治疗肺癌的方法以及用于该纟企测方法的试剂或者试剂盒。治疗肺癌的方法，该方法包括对血液AREG浓度与标准值相比较4氐的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。治疗肺癌的方法，该方法包括对血液中AREG浓度或者血液中TGFA浓度与标准值相比较低，或者两者的浓度都与标准值相比较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。[2]所述的治疗肺癌的方法，该方法包括对血液AREG浓度或者血液TGFA浓度与标准值相比较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。[l]所述的治疗肺癌的方法，其中该erbB受体抑制剂是选自由吉非替尼、埃罗替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib组成的组中的任意化合物。治疗肺癌的方法，该方法包括对血液AREG浓度与标准值相比较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。治疗肺癌的方法，该方法包括对血液中AREG浓度或者血液中TGFA浓度或者两者的浓度都与标准值相比较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。[2]所述的治疗肺癌的方法，该方法包括对血液AREG浓度或者血液TGFA浓度与标准值相比较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。[l]所述的治疗肺癌的方法，其中该erbB受体抑制剂是选自由吉非替尼、埃罗替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib组成的组中的任意化合物。—种肺癌治疗剂，该治疗剂含有作为活性成分的erbB受体抑制剂，供施用于血液AREG浓度与标准值相比较低的患者。—种肺癌治疗剂，该治疗剂含有作为活性成分的erbB受体抑制剂，供施用于血液AREG浓度和血液TGFA浓度与标准值相比均较低的患者。[5]或[6]所述的肺癌治疗剂,其中该erbB受体抑制剂是选自由吉非替尼、埃罗替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib组成的组中的任意化合物。erbB受体抑制剂在制备肺癌治疗剂中的用途，所述治疗剂供施用于血液AREG浓度和血液TGFA浓度与标准值相比均较低的患者。[9]治疗肺癌用试剂盒，该试剂盒包括以下组件(1)含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂；以及(2)记载下列内容的说明书血液AREG浓度与标准值相比较高的患者对于含有针对erbB受体抑制剂的抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性较低。[9]所述的治疗肺癌用试剂盒，该试剂盒还包括以下成分(3)记载下列内容的说明书血液TGFA浓度与标准值相比较高的患者对于含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性较低。检查对于肺癌治疗剂的应答性的方法，其中该肺癌治疗剂含有erbB受体抑制剂作为活性成分，其中该方法包括以下步骤(1)测量肺癌患者的血液样品中的AREG浓度；以及(2)当AREG浓度与标准值相比较高时，确定该患者对于含有erbB受体抑制剂肺癌作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性较低。[ll]所述的检查方法，该方法还包括以下步骤(1)测量肺癌患者的血液样品中的TGFA浓度；以及(2)当AREG浓度或者TGFA浓度高于标准值或者此二者的浓度均高于标准值时，确定该患者对于含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性较低。[ll]所述的方法，其中当AREG浓度或者TGFA浓度相比于标准值较高时，确定该患者对于含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性较低。[ll]所述的检查方法，该方法包括使用免疫测定来测量血液样品中AREG浓度。—种检查试剂盒，用于检查针对含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性，其中该试剂盒包括以下组件i.用于测量AREG血液浓皮的免疫测定试剂；以及ii.AREG的阳性对照。[15]所述的检查试剂盒，该试剂盒还包括以下组件iii.用于测量TGFA的血液浓度的免疫测定试剂；以及iv.TGFA的阳性对照。[16]所述的检查试剂盒，其中阳性对照样品含有AREG和TGFA。[18][17]所述的检查试剂盒，其中作为阳性对照的样品是液体。发明的效果本发明提供了基于血液标志物来预测针对erbB受体抑制剂的应答性的方法。使用血液作为样品，可以方便经济地测定血液标志物。也可以通过诸如免疫测定这样的技术来对这些标志物进行定量评价。此外，在本发明中，除了已知的标志物TGFA以外，通过使用AREG作为第二标志物极大地提高了针对应答性低的患者的检测灵敏度。而且，本发明提供了治疗肺癌的方法，其中该方法包括对利用本发明预测了对于erbB受体抑制剂有应答的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。erbB受体抑制剂包括吉非替尼等物质。人们认为，吉非替尼这种药物，最好是选择期待对其尽可能有应答性的患者加以施用。本发明能够高灵敏度地检出低应答性的患者，并且能够对预期有应答的患者进行特异的选择。这样，可能极大地促进使用吉非替尼等erbB受体抑制剂的肺癌治疗方法的疗效。本发明也可以预防对不能期待有应答的患者施用药物所伴随的非必要副作用的不利。由不能期待有疗效的药物所引起的副作用会严重损害患者的生活质量(QOL)。通常，以施用药物为首，疾病治疗措施都伴随着不同程度的副作用的风险。因此，医疗处理的基本规则，是斟酌副作用的风险和预期的疗效，选择可以相信能够获得最大疗效的治疗方法。不能预期具有疗效的医疗行为不应选择。因此，预测低应答性的患者的能力将会促使肺癌患者生活质量的提高。TGFA和AREG都是EGFR配体，已经发现在肺癌组织中其表达水平与针对吉非替尼的应答性相关。而且，已经发现TGFA的血液水平与针对吉非替尼的应答性相关。然而，还没有报道称AREG的血液水平可以作为针对erbB受体抑制剂的应答性的预测标志物。此外，发现将TGFA和AREG相结合的预测结果，与单独使用TGFA来进行预测相比，极大地促进了对于低应答性患者的检测灵敏度，该发现超出了预期。具体地，结合使用AREG可以检测到50%或者更多的使用血液TGFA预测所不能检测到的患者。换句话说，超过一半的被TGFA检测所遗漏但实际上具有低应答性的患者，能够通过测量AREG而被重新检出。更具体的说，例如，以下实施例的数据显示出对于TGFA和AREG检测灵敏度分别为43.3%和40%。该结果表明通过4企测这些标志物可以发现40%的低应答性的患者。本发明人更加详细的分析了每位TGFA阳性的患者和AREG阳性的患者。他们发现二者并不完全重叠。就是说，通过使用两种标志物TGFA和AREG作为指标，二者互相补偿来发现分别使用单一标志物时被遗漏的患者。其结果是，分别单独使用一种标志物时被遗漏的患者中，有50%或者更多最终可以被重新检出。此外，在本发明优选的实施方案中，可以将PD病例与PR或者SD患者区分开来。相反，公知的分析EGFR突变的方法能够挑选出PR患者，但是使用该方法几乎不可能识别出SD患者。这是本发明重要的优点。图1显示的是对50位接受吉非替尼治疗的NSCLC患者血清中双调蛋白(AREG;A)和TGFA(TGFA;B)的浓度ELISA检测的结果。八例是PR，十二例是SD，30例是PD。水平线表示截断水平；浓度高于该线标记为阳性，而浓度低于该线则标记为阴性。图2显示的是表示灵敏度和假阳性比例的ROC曲线，其中该曲线是通过对50位接受吉非替尼治疗的患者的血清双调蛋白浓度(A)或者血清TGFA浓度(B)使用不同截断值来预测性诊断肿瘤减小的效果获得的。图3显示的是对50位接受吉非替尼治疗的患者的肿瘤特异存活率进行Kaplan-Meier分析的结果，该分析是按照血清双调蛋白浓度(A)或者血清TGFA浓度(B)的阳性或者阴性浓度进行的。利用时序检验(log-ranktest)计算了这些组之间的差异。实施发明的最佳方式已经发现属于erbB家族的酪氨酸激酶受体与细胞生长和癌细胞的存活有着密切的联系。该类受体的已知例子包括erbB2、erbB3、erbB4或者EGFR(KlapperLN.efa/.,Adv.CancerRes.2000,77:25-79)。在高水平表达这些受体的癌症中，观察到趋于高活性和预后不良的趋势。相反，发现了通过抑制erbB的表达和或者活性可以抑制细胞的生长(Mendelsohn"a/.，Oncogene2000，19,6550-65)。基于这些发现，进行了属于erbB家族的酪氨酸激酶受体抑制剂的作为抗癌剂的开发。吉非替尼就是通过如此过程发现的化合物。在本发明中，erbB受体抑制剂指具有抑制属于erbB家族的酪氨酸激酶受体活性的作用的化合物。因此，例如，本发明的erbB受体抑制剂包括针对erbB2、erbB3、erbB4或者EGFR的活性的抑制剂。erbB受体抑制剂可以是特异针对具体受体起作用的化合物或者针对很多受体起作用的化合物。在本发明中，对受体活性的抑制指对于通过结合配体将信号转导到细胞的受体的功能的任意阶段的抑制。因此，抑制受体和配体之间结合的拮抗剂是典型的erbB受体抑制剂。或者，erbB受体抑制剂也包括对信号转导中必需的酪氨酸激酶活性具有抑制活性的化合物。例如，吉非替尼经口服施用，在体内通过阻遏经由EGFR受体的信号转导来抑制癌细胞的生长。更具体地说，例如，如以下所述的化合物可指明是本发明的erbB受体抑制剂。也可以将这些化合物以药学上可接受的盐的形式施用。在本发明中优选的erbB受体抑制剂是吉非替尼。吉非替尼^(3-氯-4-氟苯基)-7-曱氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺；N—(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholinopropoxy)quinazolin-4-amine)(吉非替尼；ZD1839,美国化学文摘登入号码184475-25-2，产品名"易瑞莎，，，Woodburn,J.R.,da/.:Proc.Am.Assoc.CancerRes.,38,633Abs4251,1997;Pharmacol.Ther.,1999,82，241-250)埃罗替尼(Erlotinib):N-(3-乙炔苯基)-6，7-双(2-曱氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺；N-(3画ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amine(i矣罗替尼，OSI-774,美国化学文摘登入号码183319-69-9,产品名"特罗凯"(Tarceva)WO99/55683)研发代码PKI-166:4-[(lR)-l-苯乙氨基]-6-(4-羟苯基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶；(PKI-166,WO97/02266)4響[(1R)-1-phenylethylamino]-6-(4-hydroxyphenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine培利替尼(Pelitinib):2-丁烯酰胺，N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基)-4-(二甲氨基)-,(2E)-;2-Butenamide，N-(4-((3-chloro-4-fluorophenyl)amino)-3-cyano-7-ethoxy-6画quinolinyl)-4陽(dimethylamino)-,(2E)-(培利替尼；EKB-569,美国化学文摘登入号码257933-82-7,TorranceCJ，da/"NatureMed.2000，6，1024-1028,US6002008)拉巾白替尼(Lapatinib):N-(3-氯-4-(((3-氟代苄基)曱基)氧)苯基)-6-(5-(((2-(曱磺酰)乙基)氨基)曱基)-2-呋喃基)-4-喹唑啉胺；N-(3-chloro-4画(((3画fluorobenzyl)oxy)phenyl)隱6-(5-(((2-methylsulfonyl)ethyl)amino)methyl)-2-furyl)-4画quinazolinamine(拉巾白替尼，GW572016，美国化学文摘登入号码231277-92-2，WO99/35146,WO01/04111)Carlotinib:2-丙烯酰胺，N-(l((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(3-(4-吗啉基)丙氧基)-6-p奎唑淋基)；2-Propenamide,N隱(4-((3-chloro-4-fluorophenyl)amino)-7-(3-(4画morpholinyl)propoxy)-6-quinazolinyl)(Canertinib;CI-1033，美国化学文摘登入号码289499-45-2,SmaillJB，"a/.，J.Med.Chem.1999,42,1803-15,WO00/31048)患者的肿瘤通常，若通过施用含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂，能够确认构成需要治疗的癌病灶的肿瘤退缩，则认为该患者对于该治疗剂有应答。相反，当施用该治疗剂之后不能确认其肿瘤退缩，则认为该患者无应答。已经确立了用来比较应答性程度的一些标准。本发明中的应答性可以基于，例如，针对这些已知抗癌剂的应答性的比较标准来力口以确定。在二十世纪七十年代，国际抗癌联盟(UICC)提出了用于评估抗癌剂的有效性的标准(Eur.J.Cancer13:89_94,19")。世界卫生组织(WHO)也建议使用该评级系统(WHOoffsetPublicationNo.48,1979)。WHO的该评级系统是代表性的应答性判定标准(MillerAB"a/.,Cancer1981;47:207-14)。此后，有人指出了WHO指导方针的一些问题，即将患者错误地判定为PD的病例。因此，西南肿瘤学研究组(SouthwestOcologyGroup,SWOG)等研究组制定出了新的指导方针(GreenSandWeissGR.,Invest.NewDrugs1992;10:239-53)。在由Green和Weiss制定的指导方针中，主要的修订是关于PD的标准。基于这些标准，新近完成了RECIST(实体瘤组灵敏度评价标准)指导方针，该方针是另一个代表性的灵敏度评价标准(TherasseP，da/.,J.Natl,Cancer.Ins.2000,Vol.92,No.3,205-16)。WHO指导方针和RECIST指导方针之间主要的区别在于测定肿瘤尺寸的方法。在WHO指导方针中，基于肿瘤体积的和(二维信息)的变化来确定抗癌剂的有效性。另一方面，在RECIST指导方针中，基于肿瘤最大直径的和(一维信息)的变化来确定有效性。将这些指导方针总结在1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>I(条件是PD在病变增大之前没有被判断为CR、PR或者SD)CR:完全应答PR:部分应答SD:病况稳、定；也记载为无变化NCPD:进展性疾病实际上，除了基于肿瘤尺寸的变化的有效性标准以外，这些指导方针还指出了对于确定疗效必需的多个注意事项，诸如以下这些。无论如何，所属领域的技术人员可以基于这样已知的指导方针客观地确定患者对于特定抗癌剂的应答性。统计学标准肿瘤组织的测定方法的标准肿瘤标志物的测定组织学检查记录检查结果的方法非目标组织的评价通过使用例如以肺癌组织中几个标志物的表达水平作为指标的评分系统，可以极其准确地预测肺癌患者对于含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性(KakiuchiS，aa/.，Hum.Mol.Genet2004;13:3029-43.;WO2005/49829)。然而，肺癌组织并不是很容易采集的样本。此外，需要费时、复杂的分析技术来定量确定肺癌组织中多个基因的表达水平。因此，在这些报道中，考察了应答性与血液TGFA浓度之间的关联性。通过血液TGFA浓度的检测显示，可以对低应答性的患者进行一定程度的筛查。然而，其检测灵敏度低于50%。本发明人展示了通过使用血液AREG浓度作为指标，可以以高检测灵敏度发现低应答性的患者，并因此完成了本发明。本发明涉及治疗肺癌的方法，该方法包含对血液AREG浓度与标准值相比较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。在本发明中，血液(血中)浓度是指在校正了全血中所含血细胞的体积之后存在于血液中的物质的浓度。全血中所含血细胞的体积的百分比在不同个体间差别很大。例如，红细胞在全血中的百分比在男性和女性之间的差异很大。此外，也不能忽略个体之间的差异。因此，根据血细胞体积的百分比不同，包含血细胞成分在内的全血中物质的表观浓度变化很大。例如，即使血清中的浓度相同，含有大量的血细胞成分的样品的测定值会低于含有少量的血细胞成分的样品的测定值。因此，为了比较血成分的测定值，通常使用针对血细胞体积进行了校正的值。例如，可以通过使用通过从全血中分离血细胞的方法获得的血清或者血浆作为测定血成分的样品，来获得排除血细胞体积干扰的测定值。因此，本发明中的血液浓度通常可以作为血清或者血浆中的浓度来确定。或者，可以在测定全血中浓度之后校正血细胞体积的影响。测定全血样品中血细胞所占体积的方法是已知的。在本发明中，通过与标准值的比较，将血液AREG浓度与针对erbB受体抑制剂的应答性相关联。标准值是作为确定受试者是否有应答的判定标准的数值。标准值也称为截断值。在本发明中，将血液AREG浓度高的患者确定为针对erbB受体抑制剂应答性低。通常，可以将能够区分具有或者不具有待评定性状的值用作标准(截断)值。在本发明中，需要评定的性状是针对erbB受体抑制剂的应答性。因此，将标准值与针对erbB受体抑制剂的应答性相关联。具体地，本发明涉及治疗肺癌的方法，该方法包括以下步骤(1)测定肺癌患者的血液AREG浓度；(2)将步骤(1)中测得的值与针对erbB受体抑制剂有应答性的患者的血液AREG浓度的测定值进行比较；并且(3)对如下所述的患者施用erbB受体抑制剂作为步骤(2)的结果，该患者在步骤(1)中的测定值与已经确认对erbB受体抑制剂有应答的患者的测定值处于相同水平。在本发明优选的实施方案中，在前述的步骤(3)中，例如，可以挑选预期被确定为CR或者PR的患者作为待施用erbB受体抑制剂的患者。具体地，才艮据本发明，可以避免对可能被确定为PD的患者施用erbB受体抑制剂，而与erbB受体抑制剂的施用无关。此处所提及的CR、PR、SD以及PD可以例如基于以下的标准来确定。此外，按照前述的WHO或者Green等或者RECIST指导方针的标准来确定CR、PR、SD和PD的判定标准。完全应答(CR):在间隔至少28天实施的两次治疗中^皮评价为CR的患者；部分应答(PR):在间隔至少28天实施的两次治疗中被评价为出现PR页或者有更好的效果的患者；病况稳定(SD):在间隔至少28天实施的两次治疗中被判断为出现SD或者有更好的效果，且不是CR或者PR的患者。最初的SD评价是在开始给药治疗之后28天或者在其更晚的时间进行的肿瘤评价时间点进行的；进展性疾病(PD):在开始给药治疗以后28天的第一次肿瘤评价时间点或者在此之前被确定为PD的患者。在本发明中，例如可以通过前述步骤(2)和(3)来挑选血液AREG浓度与标准值相比较低的患者。具体地，首先将需要测定应答性的患者(受试者)的AREG值与对erbB受体抑制剂有应答性的患者(对照)的血液AREG浓度进行比较。如果受试者的测定值与对照水平相同，那么这表明受试者是前述的血液AREG浓度与标准值相比较低的患者。在本发明优选的实施方案中，对erbB受体抑制剂有应答性的患者包括被判定为CR或者PR的患者。应答性低的患者包括被判定为PD的患者。AREG的血液浓度处于相同水平可以利用统计学比较来揭示。例如，可以测定4艮多对erbB受体抑制剂有应答的患者的血液AREG浓度，从统计学上确定标准的血液AREG浓度。当能够聚集统计学上充分的群体时，经常将以平均值为中心两侧二倍于标准差(S.D.)的范围内的值作为标准值使用。因此，可以4吏用对应于平均值+2xS.D.的值作为标准值。用这种方法确定的标准值理论上包括90%的确定为CR或者PR的患者。或者，对于实际上已经施用erbB受体抑制剂的患者，可以按照上述的标准来确定应答性，并且可以基于其血液AREG浓度设定标准值。通常地，以这种方法设定的标准值，是在能够满足使假阳性率最小化，且使检测灵敏度最大化的条件的范围内挑选的。在此处，假阳性比例是指在CR或PR患者中^^判定为血液AREG浓度高于标准值的患者所占的百分比。相反地，在CR或PR患者中被判定为血液AREG浓度与标准值相比较低的患者所占的比例就是特异度。也就是说，假阳性比例和特异度的和永远是1。检测灵敏度是指在被确定为应答性的人群中，在所有的PD患者中被判定为血液AREG浓度高于标准值的患者所占的百分比。此夕卜，在本发明中，P日性预测率(positivepredictivevalue)是指血液AREG浓度高于标准值的患者中SD或者PD患者所占的百分比。相反地，阴性预测值是指血液AREG浓度与标准值相比较低的患者中CR或者PR患者所占的百分比。在表2中对这些值之间的关系进行了总结。如下面的关系所示，评价对于应答性的预测准确性的指标一一灵敏度、特异度、阳性预测率和阴性预测率中的每一个，都依赖于判断血液AREG浓度水平的标准值的不同而变化。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如已经提到过的一样，标准值通常设定为使得假阳性率低而灵敏度高。然而，从以上的关系可以很明确的看出，在假阳性率和灵敏度之间有权衡取舍的关系。就是说，如果降低标准值，检测灵敏度会上升。然而，这样也会提高假阳性率，所以很难满足"低假阳性率"的条件。考虑到这样的情况，例如可以挑选能给出如下的预期结果的数值作为本发明中优选的标准值使得假阳性率为50%或更低的标准值(就是说，使得特异度为50%或者更高的标准值)使得灵敏度不低于20%的标准值在本发明中，可以使用ROC曲线来设定标准值。受者操作特征(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲线是在纵轴上显示检测灵敏度并且在横轴上显示假阳性率(即"l-特异度")的图。在本发明中，可以通过连续地改变用于确定血液AREG浓度是高还是低的标准值，将此时灵敏度对假阳性率的比例的变化进行作图得到ROC曲线。用于获得ROC曲线的"标准值"是统计分析临时使用的数值。通常使用于获得ROC曲线的"标准值"在能够覆盖所有可选标准值的范围内连续变化。例如，可以使标准值在所分析的人群中的测定的AREG的最小值和最大4直之间变化。基于获得的ROC曲线，可以在能够满足上述条件的范围内挑选出适合本发明中使用的标准值。或者，可以通过使标准值在含有绝大多数测定的AREG值的范围内变化，作出ROC曲线，基于该曲线挑选出标准值。更具体地说，例如，在由本发明人所分析的患者群中截断值、假阳性率以及灵敏度之间的关系可总结如下。可以通过在图中对以下的值进行作图得到图2的ROC曲线。AREG截断值(pg/mL)假阳性率；灵敏度5050%;73.3%7030%;53.5%8025%;43.3%8510%;40%9010%;36.7%93.8戰36.7%9510%;36,7%10010%;33.3%110戰26.7%1305%;23.3%1505%;23.3%155.2195%;20%TGFA截断值(pg/mL)假阳性率；灵敏度1050%;70%1145%;70%1245%;66,7%1335%;63.3%13,535%;600/01430%;53.3%14.525%;50%1515%;46.7%15.510%;43.3%1610%;43.3%175%;36.7%185%;33.3%195%;30%20100/"43.3%215%;20%因此，基于ROC曲线，产生50%或者更低的假阳性率以及20%或者更高的灵敏度的标准值的范围是从56.306pg/mL到155.219pg/mL。或者，可将阳性预测率和阴性预测率作为指标，采用满足如下条件的标准值。产生60%或者更高的阳性预测率的标准值产生40%或者更高的阴性预测率的标准值在本发明中，可以从以治疗肺癌为目的已经施用erbB受体抑制剂的患者中挑选出需要测量其血液AREG浓度以便确定标准值的患者。erbB受体抑制剂已知有许多市售的，或者也有已经开始用于临床试验的药剂。因此，可以在获得正在施用这样的药剂的患者的同意之后收集其血液样品。此外，通过将血液AREG浓度与所收集的血液样品来源的患者的疗效关联起来，按照诸如以上描述的方法来设定标准值。检测其血液AREG浓度用于设定标准值的患者优选是这样的患者群，其被认为是代表了应该接受本发明的治疗的患者群。更具体地说，例如，在本发明的治疗方法中，在选择应该施用erbB受体抑制剂的患者时，除了血液AREG浓度之外，还可以参照血液TGFA浓度。更具体地，本发明涉及治疗肺癌的方法，其中所述方法包括对血液AREG浓度或者血液TGFA浓度与标准值相比较低，或者二者浓度均与标准值相比较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。或者，本发明涉及治疗肺癌的方法，其中所述方法包括对血液AREG浓度或者血液TGFA浓度与标准值相比较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。或者，本发明涉及肺癌的治疗剂，该治疗剂含有作为活性成分的erbB受体抑制剂，供施用于血液AREG浓度与标准值相比较低的肺癌患者。如已经提到过的一样，通过结合测得的血液AREG浓度以及血液TGFA浓度的值，可以更高的灵敏度检出针对erbB受体抑制剂的应答性低的患者。更具体地说，在本发明中，作为含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的施用对象的患者，优选的是血液AREG和TGFA二者的测定值均低于截断值的患者。因此，本发明提供含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂，该治疗剂供施用于血液AREG浓度和血液TGFA浓度均与标准值相比较低的肺癌患者。此外，本发明涉及erbB受体抑制剂在制备肺癌治疗剂中的用途，所述治疗剂供施用于血液AREG浓度与标准值相比较低的肺癌患者。更进一步地，本发明也涉及利用erbB受体抑制剂在制备肺癌治疗剂中的用途，所述治疗剂供施用于血液AREG浓度和血液TGFA浓度与标准值相比均较低的肺癌患者。本发明中的肺癌治疗剂中的活性成分是erbB受体抑制剂。优选的erbB受体抑制剂是吉非替尼、埃罗替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib。已知可以利用血液TGFA浓度来预测对于erbB受体抑制剂的应答性。本发明进一步显示，通过以新的方式组合AREG测定值评价，可以得到比基于单独测量TGFA或者AREG进行的应答性预测更高的预测精度。更具体地，本发明提供治疗肺癌的方法，该方法是通过使用TGFA和AREG这两种因子作为指标来预测针对erbB受体抑制剂的应答性。或者，本发明提供肺癌治疗剂，所述治疗剂供施用于已经基于其TGFA和AREG的血液浓度进行过筛选的特定的肺癌患者。具体地，例如，；险测受试者血液中TGFA和AREG两种因子，当其中任一个超过其分别的标准值时，则显示该受试者对于erbB受体抑制剂是无应答性的。换句话说，基于本发明，可以确定TGFA和AREG的血液浓皮与标准值相比都较低的肺癌患者对erbB受体抑制剂是有应答的。与基于单独检测TGFA的结果的评价相比，本发明能够极大地提高对于erbB受体抑制剂无应答的患者的检测灵敏度。在这样的提高的背后，是TGFA阳性的患者群和AREG阳性的患者群并不完全重叠的事实。以下对其进行更加详尽的描述首先，在TGFA值的测定结果与标准值相比较低(对于erbB受体抑制剂有应答性)的患者中，有一定百分比的患者事实上是无应答性的。这些患者被视为TGFA假阴性患者。通过结合基于TGFA的评价和基于AREG的评价，可以从TGFA假阴性的患者中发现AREG水平高于标准值的患者。也就是说，使用本发明，可以从由于低血液TGFA浓度而被错误地评价为"有应答性"的患者中发现实际上无应答性的患者。以这样的方式，本发明提高了对于erbB受体抑制剂无应答的患者的检测灵敏度。通常，虽然简单地结合多种标志物的评价结果能够增加检测灵敏度，但是这样经常同时导致特异度的降低。然而，通过确定灵敏度和特异度之间的最佳平衡，本发明已经阐明了能够增加检测灵敏度而不损失特异度的特有组合。在本发明中，可以对TGFA和AREG值都不超过标准值的患者施用erbB受体抑制剂。通过挑选两个值均不超过标准值的患者，能够增加有应答性的患者的比例。在本发明中，为了综合地考虑TGFA的测定结果，例如，可以测定TGFA的浓度然后与标准值进行比较，就像上述将测定的AREG值与标准的AREG值之间进行比较一样。例如，已经有关于测量血液TGFA浓度并且将其与标准值进行比较的报道(KakiuchiS，etal.，Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43.;WO2005/49829)。也已经有市售的针对TGFA的ELISA试剂盒。这些公开发表的已知报道中描述的方法可以应用在本发明的使用erbB受体抑制剂治疗肺癌的方法中。本发明中所测定的血液中的AREG(双调蛋白)是一种蛋白质，又称为许旺氏细胞瘤来源的生长因子。编码AREG的基因是国立卫生研究院哺乳动物基因采集(MGC)计划所分离的超过15000个基因中的一个(StrausbergRL，etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002Dec24;99(26):16899-903)。认为AREG是一种自分泌生长因子，是表皮生长因子家族中的一员。具体地，该因子结合EGF/TGF-a受体并且造成细胞生长。另一方面，也已知该因子具有针对特定高恶性上皮癌细胞系的生长抑制作用。"可以通过任何能够对蛋白定量的方法来测定血液中的AREG。例如，可以使用免疫测定、液相色谱、表面等离子体共振(SPR)或者质谱作为蛋白定'量的方法。在质谱中，可以使用合适的内标物来对蛋白进行定量。可以使用同位素标记的AREG等物质作为内标物。可以通过血液AREG和内标物的峰强度来确定血液AREG浓度。通常，对于蛋白质谱来说，可以使用基质辅助激光解吸/离子化方法(MALDI)。使用质谱或者液相色谱的分析方法可以同时分析AREG和TGFA。免疫测定是在本发明中优选的测定AREG的方法。AREG的氨基酸序列是众所周知的(GenbankAccessionNumberBC009799)。AREG的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，其编码cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。因此，所属领域的技术人员可以通过基于AREG的氨基酸序列合成的必要的免疫原来制备抗体。可以使用多肽合成仪简便地合成作为免疫原的肽。可以通过将该合成的肽与载体蛋白连接制备免疫原。可以4吏用钥孔血蓝蛋白(Keyholelimpethemocyanin)、月几红蛋白、白蛋白等的物质作为载体蛋白。优选的载体蛋白包括KLH和牛血清白蛋白等。通常使用马来酰亚胺苯曱酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯法(此后简称为MBS法)等方法来连接合成的肽和载体蛋白。具体地，将半胱氨酸导入到合成的肽中，然后按照MBS法使用半胱氨酸的SH基团将该肽交联到KLH上。可以将该半胱氨酸残基导入到该合成的肽的N末端或者C末端。或者，也可以通过基于AREG的核芬酸序歹寸(GenbankAccessionNumberBC009799)来获得作为遗传重组体的AREG。利用从AREG表达组织中制备的mRNA能够克隆到含有必要核苷酸序列的DNA。也可以使用市售的cDNA文库作为克隆的原始材料。可以使用所获得的AREG的遗传重组体，或其片段作为免疫原。在本发明中使用的用来获得抗体的免疫原优选的是用这种方法表达的AREG重组体。或者，也可以使用市售AREG重组体(R&DSystems,ProductNo:262-AR-100)作为免疫原。将以此方法获得的免疫原与合适的佐剂混合并用该混合物免疫动物。已知的佐剂包括弗氏完全佐剂(FCA)和不完全佐剂。以合适的间隔重复免疫直到确认抗体的滴度上升。对在本发明中所使用的免疫的动物没有特殊的限制。具体地，可以使用小鼠，大鼠，兔子或诸如此类经常用于免疫的动物。当以单克隆抗体的形式获得抗体时，可以使用有益于产生这些抗体的动物。例如，在小鼠中已知有多种用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，并且已经发明出能够以很高的概率产生杂交瘤的技术。因此，小鼠是用于获得单克隆抗体进行免疫的优选的动物之一。治疗并不局限于体外处理。也可以使用在体外免疫敏化经培养的免疫活性细胞的方法。对由这些方法获得的抗体生成细胞进行转化和克隆。用于转化抗体生成细胞来获得单克隆抗体的方法不局限于细胞融合。例如，通过病毒感染来获得可克隆的转化抹的方法是已知的。产生在本发明中所使用的单克隆抗体的杂交瘤可以基于其对AREG的应答性来筛选。具体地，首先通过使用针对作为抗原的AREG或其结构域肽的结合活性作为指标，来挑选抗体生成细胞。如果需要可以对通过这样的筛选挑出的阳性克隆进行亚克隆。建立的杂交瘤在合适的条件下培养之后，收集产生的抗体来制备在本发明中所用的单克隆抗体。当该杂交瘤是同源杂交瘤时，可以通过将其接种到同基因动物的腹膜内来进行体内培养。在这样的例子中，收集作为腹膜液的单克隆抗体。当使用异源杂交瘤时，可以利用棵鼠作为宿主进行体内培养。不但是体内培养，通常也通过给予适当的培养环境对杂交瘤进行体外培养。例如，通常使用诸如RPMI1640和DMEM这样的基础培养基作为杂交瘤的培养基。可以向这些培养基中加入动物血清等添加物以便维持高水平的抗体生产能力。当在体外培养杂交瘤时，可以收集作为培养上清的单克隆抗体。培养上清可以在培养终了时通过从细胞中分离来收集，或者，在使用应用空心纤维的培养装置的情况下，可以在培养的同时连续地收获培养上清。对于作为腹膜液或者培养上清收集的单克隆抗体，通过饱和硫酸铵沉淀分取其免疫球蛋白级分，然后利用包括凝胶过滤和离子交换色语法等分离步骤，制成用于本发明的单克隆抗体。而且，如果该单克隆抗体是IgG，基于蛋白A或者蛋白G的层析柱进行的亲和色谱法的纯化方法是非常有效的。另一方面，为了获得作为多克隆抗体的用于本发明的抗体，可以从免疫后抗体滴度上升的个体中抽血并分离血清以获得抗血清。通过已知的方法从抗血清中纯化免疫球蛋白，可以制备用于本发明的抗体。如果在免疫球蛋白的纯化中结合使用以AREG作为配体的免疫亲和层析，则能够获得AREG特异的抗体。也可以组合以下的市售抗体并用于本发明的测定中。例如，就单克隆抗体而言，有诸如下列市售产品抗人源双调蛋白抗体(R&DSystems,批号MAB262):该产品是使用大肠杆菌来源的AREG重组体作为免疫原获得的、小鼠-小鼠杂交瘤来源的单克隆抗体。或者，就多克隆抗体而言，也有下列市售产品抗人源双调蛋白抗体(R&DSystems,批号AB-262-NA):该产品是使用大肠杆菌来源的AREG重组体免疫山羊而获得的多克隆抗体。生物素化的抗人源双调蛋白抗体(R&DSystems,CatalogNo:BAF262):该产品是通过对使用大肠杆菌来源的AREG重组物免疫山羊所获得的多克隆抗体进行生物素化获得的。当使针对AREG的抗体与AREG接触时，该抗体会通过抗原-抗体反应结合由抗体识别的抗原决定簇(表位)。可以使用多种免疫测定原理检测抗体与抗原之间的结合。免疫测定可以大体分为异源分析方法和同源分析方法。为了维持免疫测定的高水平的灵敏度和特异度，优选使用单克隆抗体。以下将详细描述本发明使用多种免疫测定形式来测定AREG的方法。首先，将描述使用异源免疫测定来测定AREG的方法。在异源免疫测定中，需要分别地测定AREG結合的抗体和AREG-未结合的抗体。为了促进分离，通常使用固定化的试剂。例如，首先制备固定了能够识别AREG的抗体的固定相(固定化抗体)。使AREG结合于其上，然后进一步与标记过的第二抗体应答。从液相中分离固定相，然后，如果需要，对其进行洗涤，与AREG浓度成比例的一定量的第二抗体保留在固定相上。通过标记第二抗体，可以通过测定来自于该标记的信号来对AREG进行定量。可以使用任何使抗体与固定相结合的方法。例如，聚苯乙烯这样的疏水材料能够物理性地吸附抗体。或者，可以化学地将抗体结合到多种表面上具有功能基团的材料上。此外，通过配体的结合配偶体诱捕配体，可以'将标记了该配体的抗体结合到固定相上。结合配体及其结合配偶体的组合包括亲合素-生物素组合等等。可以在与第二抗体反应的同时或者在该反应之后将固定相与抗体结合起来。同样地，对第二抗体的标记不一定是直接的连接。更具体地说，也可能使用诸如抗体对抗体或者亲和素对生物素这样的结合反应进行间接标记。基于测定的已知其AREG浓度的标准样品的信号强度来确定样品的AREG浓度。用于上述的异源免疫测定的固定化抗体和第二抗体可以是任何抗体，只要该抗体能够识别AREG，或者是含有其抗原结合位点的片段即可。因此，可以使用单克隆抗体、多克隆抗体或者两者的混合物或者两者的组合。当两种抗体都是单克隆抗体时，优选的是能够识别不同表位的单克隆抗体组合。由于抗体将待测定的抗原包夹，所以将这样的异源免疫测定称为夹心法。由于夹心法在测定的灵敏度和重现性方面比较突出，所以该方法是本发明中优选的测量原理之一。也可以将竟争性抑制应答的原理应用于异源免疫测定。更具体地说，这些是基于样品中的AREG会竟争性抑制抗体与已知浓度的AREG的结合的现象的免疫测定。可以通过标记已知浓度的AREG并且测量与抗体反应(或者不反应)的AREG来确定样品中AREG浓度。竟争性应答系统是通过使已知浓度的抗原和样品中的抗原同时与抗体反应而建立的。此外，如果使抗体与样品中抗原反应之后与已知浓度的抗原进行反应，用抑制性反应系统进行分析是可能的。在两类反应系统中，都可以通过将抗体或者用作试剂成分的已知浓度的抗原中的一者制备成标记成分，而将另一者制备成固定化试剂，来构建在操作性上更优良的反应系统。用于这样的异源免疫测定的标记成分包括放射性同位素、荧光物质、发光物质、具有酶活性的物质、肉眼可见的物质以及可进行磁力观察的物质。这些标志物的具体例子如下所示。具有酶活性的物质过氧化物酶，碱性磷酸酶，尿素酶、过氧化氢酶，葡萄糖氧化酶乳酸脱氢酶，或者淀粉酶，等等异硫氰酸荧光素，四曱基罗丹明异硫氰酸盐，取代的罗丹明异硫氰酸盐，二氯三嗪异硫氰酸盐,等等放射性同位素氖，125i18)I，等等其中，以安全，操作性，灵敏度等方面的观点来看，酶等非放射性标志物是更好的标志物。可以通过诸如高碘酸盐方法或者马来酰亚胺方法等已知方法将酶标志物连接到抗体或者AREG上。作为固定相，可以使用珠子、容器内壁、微颗粒、多孔载体、磁性颗粒或诸如此类的物质。可以使用诸如聚苯乙烯、聚碳酸盐、聚乙烯基曱苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚曱基丙烯酸酯、胶乳、明胶、琼脂糖、玻璃、金属、陶瓷等材料制成的固体来制备这些固定相。已经向其表面导入了用于化学性地结合抗体的功能基团的固体材料是已知的。可以将已知的连接方法用于固定相和抗体(或者抗原)，其中该方法包括诸如聚L-赖氨酸或者或者戊二醛处理这样的化学键连，或者物理吸附。虽然本文举例的所有异源免疫测定都需要从液相中分离固定相以及洗涤的步骤，但是可以使用免疫层析法(该方法是夹心法的变种)很方便地完成这些步骤。具体地，将固定化抗体固定在能够通过毛细作用运输样品溶液的多孔载体上。然后通过毛细作用使含有混合了标记过的抗体的AREG的样品通过该载体。在该通过过程中，AREG与标记过的抗体进4亍反应，然后当其接触到固定化抗体时，会被捕获到该位置。没有与AREG反应的标记过的抗体不会被固定抗体捕获，从而从中通过。其结果是，通过使用留在固定抗体的位置上的标记过的抗体的信号作为指标，能够;险测到AREG的存在。如果将该标记过的抗体预先装入到该多孔载体的上游，那么就可以很简单的通过该样品溶液的滴下来开始并完—成所有的反应，因此可以构建极其方便的反应系统。在免疫层析法中，可以结合能够通过肉眼分辨的标记过的成分(诸如有颜色的颗粒)来构建不需要特别的读数器的分析装置。此外，在免疫层析法中可以对AREG检测的灵敏度进行调整。例如，通过将检测灵敏度调整到接近上部截断值的数值，当信号超过截断值时，可以检测到上述的标记过的成分。通过使用该类装置，可以很方便的确定受试者是阳性还是阴性。如果使该标记具有能够被肉眼分辨的构成，只需要将血液样品简单地应用在免疫层析法的装置上，就可以提供必要的检测结果。已知有多种方法可以作为在免疫层析法中调节检测灵敏度的方法。例如，可以将用于调节检测灵敏度的第二固定化抗体配置在样品上样的位置和固定化抗体的位置之间(特开平6-341989)。当样品从其上样的位置移动到用于标记检测的第一固定化抗体的位置的过程中，样品中的AREG被第二固定化抗体所补足。在第二固定化抗体饱和之后，AREG能够到达配置于第二固定化抗体下游的第一固定化抗体的位置。其结果是当样品中所含的AREG的浓度高于一定浓度时，可以在第一固定化抗体的位置检测到结合到标记过的抗体上的AREG。接下来，对同源免疫测定进行描述。同如上所述的需要分离反应溶液的异源免疫测定方法相比，通过同源分析方法也可以检测AREG。同源免疫方法不需要从应答溶液中分离抗原-抗体反应产物就可以检测该产物。代表性的同源分析方法是免疫沉淀反应，在该反应中通过检测与抗原-抗体反应相关的沉淀产物来定量分析抗原性物质。免疫沉淀反应通常使用多克隆抗体。当使用单克隆抗体时，优选使用能够结合AREG不同表位的多种类型的单克隆抗体。与免疫应答相伴随的免疫沉淀反应的产物可以是肉眼可见的，或者可以通过光学测量将该产物转化成数据。免疫颗粒凝集反应是通常的同源分析方法，该方法以抗原所致的抗体致敏微粒的凝集作为指标。如上述的免疫沉淀反应中，也可以像前述的免疫沉淀反应一样，使用多克隆抗体或者多种类型的单克隆抗体的组合。可以通过多种抗体的混合物来对微粒进行抗体致敏，或者可以通过将分别使用每种抗体活化的微粒进行混合来制备该微粒。通过此种方法获得的微粒当接触AREG时可以产生基质样(matrix-Hke)反应产物。可以检测作为凝集的颗粒的应答产物。颗粒的凝集可以通过肉眼观察，或者可以通过光学测量转化成数据。基于能量转移和酶引导(enzymechanneling)的免疫测定方法是已知的同源免疫测定的例子。在使用能量转移的方法中，将具有供体/受体关系的不同的光学标记分别接到能够识别抗原上靠近的表位的多种抗体上。当发生免疫反应时，它们相互接近从而发生能量转移，其结果是产生荧光淬灭或者荧光波长的改变等信号。另一方面，酶引导是使用组合的酶作为能够结合靠近的表位的抗体的标记，该组合之间的关系是一种酶的反应产物是另一种酶的底物。当由于免疫反应而使它们彼此靠近时，酶反应被增强，从而它们的结合可以作为酶反应速率的变化被检测到。在本发明中，可以从患者体内抽取的血液制备用于检测AREG的血液。优选的血液样品是血清或血浆。可以在进行4企测之前对血清或者血浆样品进行稀释。或者，也可将全血作为检测的样品，并且对测定的值进行校正以便确定血清浓度。例如，可以通过确定在相同血液样品中血细胞体积百分比来将全血中的浓度校正成血清中的浓度。本发明治疗肺癌的方法可以治疗多种类型的对erbB受体抑制剂有应答性的肺癌。优选地，本发明中的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在本发明中，erbB受体抑制剂施用于已经确认了其血液中AREG浓度与标准值相比较低的患者。按照常规的治疗方案来确定施用的erbB受体抑制剂。具体地，对于成人每天的剂量是例如，10到2000mg，通常20到1000mg,具体地50到700mg,更具体地100到700mg。例如，在现有的施用吉非替尼的标准治疗方案中，对于成人(不考虑其性别和体重)每天的剂量是250mg。在本发明中，erbB受体抑制剂可以口服或者注射施用。注射施用的例子包括静脉注射。癌的试剂盒。更具体地，本发明涉及一种用于治疗肺癌的试剂盒，其包括以下组件(l)含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂；以及(2)记载下列内容的说明书血液AREG浓度高于标准值的患者对含有针对erbB受体抑制剂的抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂具有低应答性。本发明的治疗试剂盒可能还包括以下组件(3)记载下列内容的说明书血液TGFA浓度相比于标准值较高的患者对于含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂具有低应答性。例如，本发明的肺癌治疗用试剂盒包括含有以下(1)和(2)成分的肺癌治疗用试剂盒(1)含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂；以及(2)说明文件，该说明文件说明不推荐对血液AREG或者TGFA浓度高于标准值的患者施用erbB受体抑制剂。或者，本发明的用于治疗肺癌的试剂盒包括含有以下(1)和(2)成分的用于肺癌的治疗试剂盒(1)针对肺癌的含有作为活性成分的erbB受体抑制剂治疗剂；以及(2)记载下列内容的说明书可以向其血液AREG和TGFA浓度均不超过标准值的患者施用erbB受体抑制剂。除了涉及应该接受施用的患者的说明书外，本发明的治疗肺癌用试剂盒的说明书可能包括对于使用以上的erbB受体抑制剂进行治疗必需的各种信息。具体地，可能也包含诸如该药物的作用机理，预期的副作用，该药物的储存条件，该药物的生产日期，或者药物的有效期等信息。本发明治疗肺癌的方法包括对erbB受体抑制剂有应答性的患者施用该药物。为了选择对erbB受体抑制剂有应答性的患者，必须检查肺癌患者对于该药物的应答性。具体地，本发明提供用于检测针对包含erbB受体抑制剂作为有效成分的肺癌治疗剂的应答性的方法，其中该方法包括以下步骤(1)测定肺癌患者的血液样品中的AREG浓度；以及(2)当AREG浓度与标准值相比较高时，确定患者对于含有erbB受体抑制剂治疗剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性是低的。可以使用以下的步骤来实施本发明的对于肺癌治疗剂应答性的检测方法。具体地，本发明提供了用于检测针对含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性的方法，该方法包括以下步骤(1)测定肺癌患者的血液样品中的AREG浓度；(2)将步骤(l)中所测定的值与测定的对erbB受体抑制剂有应答性的患者的血液AREG浓度进行比较；并且(3)当步骤(2)中比较的结果显示步骤(l)中所测定的值与确认了对erbB受体抑制剂有应答的患者的测定值处于同一水平时，则显示该肺癌患者对erbB受体抑制剂是有应答性的。本发明用于检测应答性的方法也可以包括以下步骤(1)测定肺癌患者的血液样品中的TGFA浓度；以及(2)当AREG浓度或者TGFA浓度或者两者浓度与标准值相比都较高时，断定该患者对含有erbB受体抑制剂治疗剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性是低的。和评价AREG测定值的方法中一样，TGFA浓度可以通过以下的步骤进行比较(1)测定肺癌患者的血液样品中的TGFA浓度；(2)将步骤(l)中所测定的值与测定的对erbB受体抑制剂有应答的患者的血液TGFA浓度进行比较；并且(3)当步骤(2)中的比较结果显示在步骤(1)中所测定的值与确认了对erbB受体抑制剂有应答性的患者的测定值处于同一水平时，则显示该肺癌患者对erbB受体抑制剂是有应答性的。在本发明的检测应答性的方法中，可以通过上边描述的方法来测定血液AREG浓度或者血液TGFA浓度。待与各个测定值比较的标准值或者对待比较的erbB受体抑制剂有应答性的患者的血液浓度，可以通过以上描述的方法设定。对AREG和/或TGFA的血液浓度的测定值进行评价，当其中一个或者两个超过标准值时，则表明受试者对erbB受体抑制剂的应答性低。在本发明优选的实施方案中，当AREG或者TGFA中任意一个的血液浓度超过标准值时，则表明受试者对erbB受体抑制剂的应答性低。如已经提到过的一样，在本发明的检测方法中，可以使用确认了对erbB受体抑制剂有应答的患者的测定值作为标准值。可以将用于实施本发明的检测针对含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂之应答性的方法的组件预先组合起来，作为用于检查的试剂盒来提供。更具体地，本发明提供检查含有erbB受体抑制剂治疗剂作为活性成分的肺癌治疗剂应答性的试剂盒，该试剂盒包括以下成分i.用于测定AREG血液浓度的免疫测定试剂；以及ii.AREG的阳性对照。本发明的试剂盒可以进一步包含以下的成分iii.用于测定TGFA血液浓度的免疫测定试剂；以及iv.TGFA的阳性对照。本发明的检测试剂盒所包括的免疫测定试剂可以包括对于上述的多种免疫测定必要的试剂。具体地，用于免疫测定的试剂包括能够识别待测物质的抗体。可以根据免疫测定的形式对抗体进行修饰。可以使用ELISA作为本发明优选的形式。例如，ELISA通常^f吏用固定在固定相上的第一抗体以及带有标记的第二抗体。就是说，用于ELISA的免疫测定试剂可以包含固定化在固相载体上的第一抗体。可以使用微粒或者反应容器的内壁作为固定相载体。可以使用磁性颗粒作为微粒。经常使用诸如96孔微孔板这样的多孔板作为反应容器。处理大量样品的容器是已知的，该容器具有比96孔板更小体积更大密度的孔。在本发明中，可以使用这些反应容器的内壁作为固相载体。用于ELISA的免疫测定试剂可以进一步包含带有标记的第二抗体。用于ELISA的第二抗体可能是直接或者间接与酶相连的抗体。将酶化学地连接到抗体上的方法是众所周知的。例如，可以对免疫球蛋白进行酶切来获得带有可变区的片段。可以将双功能接头连接到通过将该片段上的-SS-键还原所形成的-SH基团上。通过将酶预连接到连接子上可以将该酶连接到抗体片段上。或者，可以将亲和素-生物素等连接用于酶的间接连接上。就是说，通过向亲和素连接的酶中加入生物素化的抗体可以将酶间接地连接到抗体上。而且，可以通过使用第三抗体将酶间接连接到第二抗体上，其中第三抗体是酶标记的能识别该第二抗体的抗体。作为标记抗体的酶，例如可以使用诸如以上指出的那些酶。本发明的试剂盒含有AREG的阳性对照。AREG阳性对照包括已经预先测定了浓度的AREG。在以上测定应答性的方法中，优选的浓度可以是，例如，设定为标准值的浓度。或者，可以组合具有更高浓度的阳性对照。在本发明中AREG阳性对照可能还包括预先测定过浓度的TGFA。本发明的阳性对照优选的是含有AREG和TGFA二者的阳性对照。在本发明中阳性对照优选的是液体形式。在本发明中使用液体样品作为样品。因此，用作对照的样品也需要处于液体的形式。或者，可以在使用时用给定体积的液体溶解经干燥的阳性对照，来制备具有预先测定的浓度的对照。如果将溶解所需的一定体积的液体和干燥的阳性对照包装在一起，那么用户可以仅仅将二者混合就可获得必需的阳性对照。用作阳性对照的AREG或者TGFA可以是天然蛋白或者重组蛋白。本发明的试剂盒不仅可以包含阳性对照，也可以包含阴性对照。使用阳性或者阴性对照可以确认通过免疫测定获得的结果是正确的。下面，将基于实施例具体地描述本发明。实施例患者从2002年8月到2005年2月之间，50位患有进行性非小细胞肺癌的患者接受了吉非替尼(250mg/天)的治疗，在此以前的化疗对于这些患者没有任何效果。试验包含了下列患者患有局部晚期(IIIB期)以及转移的(IV期)癌症的患者，和对于一种或多种常规化疗方法具有耐性、患有手术后复发的非小细胞肺癌的患者。测试受试者的标准与以前的报道中所描述的标准相同(KakiuchiS，etal.Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43)。概括地说，受试者是至少20岁的患者，一般状态(PS)为0、1或者2,并且其肝或者肾功能没有严重的异常情况。对患者持续进行治疗直到患者由于疾病恶化、毒性不耐受、撤回用药同意等原因而退出本研究。在施用吉非替尼前一周获得血清并且将其储存在-80。C。对50位患者的血清样品进行了ELISA分析；从接受了作为最初治疗的手术之后又接受了针对复发和化疗抵抗的吉非替尼治疗的13位患者(九位腺癌患者，三位鳞状细胞癌患者以及一位腺鳞状细胞癌患者)获得了原发性非小细胞肺癌组织样品，并用福尔马林固定。所有临床样品的使用均基于患者的书面同意，并得到了研究伦理委员会的批准。在治疗开始之后每四个星期都按照以前报道的标准对针对可评价损害的肿瘤客观疗效和进行了评估(KakiuchiS,etal.Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43)。治疗四个月之后，4姿照以下的定义对治疗进行了总体的评价完全应答(CR):在间隔至少28天实施的两次治疗中被评价为CR的患者；部分应答(PR):在间隔至少28天实施的两次治疗中#1评1介为PR或者更好的效果的患者；病况稳定(SD):在间隔至少28天实施的两次治疗中^皮评1介为SD或者更好的效果，且不是CR或者PR患者的患者。首次SD判定必须在开始药物治疗之后28天或者更长时间后的肿瘤评价时间点进行；进展性疾病(PD):在开始吉非替尼治疗以后28天的第一次肿瘤评价点时或者在此之前被判定为PD的患者。ELISA如前所述(KakiuchiS,"a/.Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43.;IshikawaN,Wa/.Clin.CancerRes.2004;10:8363-70)利用市售ELISA试剂盒(TGFAELISAkit,R&DSystems,Minneapolis,MN)测量了血清TGFA值。对于血清中溶解的双调蛋白的检测，用lng/mL的第一抗体(抗双调蛋白单克隆抗体，R&DSystems)包净皮96孔《鼓量滴定4反(NalgeNuncInternational,Rochester,NY)过夜。然后对每个孔加入300^L含有1%BSA,5%蔗糖以及0.05%NaN3的PBS(pH7.4)封闭两个小时，然后向每个孔内加入按照1:3的比例用含有10/。BSA的PBS(pH7.4)稀释过的血清样品，并将该4反静置一l殳时间。用含有0.05%Tween20的PBS(pH7.4)洗涤之后，向每个孔中加入100ng/mL生物素标记的抗双调蛋白的多克隆抗体(R&DSystems)并静置两小时，然后使用底物溶液(R&DSystems)与亲和素标记的过氧化物酶(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)进4亍了反应。通过加入2N的硫酸终止显色反应。使用光度计在450nm处测定颜色强度，使用的参考波长为630nm。使用重组双调蛋白或者TGFA蛋白作为参考物质为每个平板绘制标准曲线。血清双调蛋白和TGFA的最小检测限分别是10.1pg/mL以及3.1pg/mL。从五位患有进行性非小细胞肺癌并且确认了其血清中的双调蛋白/TGFA的患者获得恶性胸腔积液，用该胸腔积液进行Western印迹和免疫沉淀分析，确认了这些商品化的抗双调蛋白抗体和抗TGFA抗体能够特异地检测每种蛋白。EGFR突变在来自于十三位施用吉非替尼的非小细胞肺癌患者的切除的肿瘤组织中对EGFR外显子18到21的突变进行了筛查(见下文)，该区域是报道过的突变的热点区域(LynchTJ，"a/.N.Engl.J.Med.2004;350:2129-39.;PaezJG，a/.Science2004;304:1497-500.;PaoW，da/.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004;101:13306.11.;TokumoM，da/.Clin.CancerRes.2005;11:1167-73.;MitsudomiT,"a/.J.Clin.Oncol.2005;23:2513-20;从p环到活化环，密码子位置709-870)。通过以前报道过的方法提取了基因组DNA(DaigoY，aa/.，Am.J.Pathol.2001;158:1623-31)。概括地说，将肿瘤组织迅速的重悬到20pL含有10mmol/LTris-HCl(pH8.3)、2.5mmol/LMgCl2、50mmol/LKCl、0.45%NP40、0.45%Tween20以及O.lmg/mL蛋白酶K的緩冲液中，然后将该悬浮液在55°C静置过夜。将该混合物煮沸十分钟来使蛋白酶K失活，然后将其用于PCR。使用与在别处描述过的针对外显子18到21的引物相同的引物(TokumoM,"a/.，Clin.CancerRes.2005;11:1167-73)实施了PCR直接测序。免疫组化和组织微阵列所用的样品是来自于已经接受过手术的患者的449份福尔马林固定的原发性癌组织样品(285份腺癌，121份鳞状细胞癌，28份肺大细胞癌以及15份腺鳞细胞癌)以及邻近的正常肺组织样品。将腺癌的组织学模式分成以下的亚型腺泡腺癌(acinaradenocarcinoma),乳头腺癌(papillaryadenocarcinoma),细支气管月巿泡癌(bronchiolo-alveolarcarcinoma),以及粘液形成的实体癌(solidcarcinomawithmucusformation)。按照国际抗癌联盟(UnionInternationaleContreleCancer)的分级法确定了病J里期(TravisWD,da/.,3rded.NewYork:Springer-Verlag;1999)。使用该449份福尔马林固定的原发性癌组织按照以前发表的方法实施了肺瘤组织微阵歹'J分析(IshikawaN，"a/"Clin.CancerRes.2004;10:8363-70)。为了观察具有临床病理差异性的临床样品中双调蛋白和TGFA蛋白的水平，利用Envision+试剂盒/辣根过氧化物酶(HRP;DakoCytomation)对切片进4亍了染色。在封闭之后，使用以下的抗体来实施该试验1:40稀释的兔抗人双调蛋白抗体(Ab-l，LabVisionCorp.,Fremont,CA)和1:80稀释的小鼠单克隆抗TGFA抗体(Ab-2，OncogeneScience,Manhasset，NY)。使每个组织与作为第二抗体的HRP标记的抗兔或者抗小鼠IgG进行反应。加入显色底物并利用苏木精对标本进行复染。三位独立的评价医师在以前不知晓临床数据的情况下，分别对双调蛋白和TGFA的存在进行了半定量的评价。利用以下的标准对胞质染色的强度进行了打分O(无)，1+(卩日性)以及2+(强阳性)。也按照以前报道的方法确定了双调蛋白的胞质、核、或胞质及核的染色模式(EbertM,etal.,CancerRes.1994;54:3959-62.;Bostwickda/.,Prostate2004;58:164-8)。统计分析为了比较患者的特性和疗效，使用StatView统计程序(SAS，Cary,NC)进行了统计分析。使用Fisher检验(Fisher，stests)比较了包括血清中双调蛋白和/或TGFA的有无在内的临床病理学多样性与对于吉非替尼的应答性之间的关系。使用Kaplan-Meier方法评估了肿瘤特异的存活率和95%置信区间(95%CI),并且使用时序检验(log-ranktest)评估了两组之间的差异。通过采用步减(step-down)法的Cox比例风险回归模型(Coxproportionalharzardregressionmodel)评估了与预后相关的风险因素。该评估的结果，满足了比例风险假定；即，"仅有那些伴有统计学上显著的单变量分析结果的变量也被包括在多变量分析之中"。消除变量的标准是似然比，该标准是基于最大部分似然法(对^^型的不匹配比例是P二0.05)。临床信息对五十位满足了特定条件的患者施用吉非替尼，剂量为每天250mg。患者的年龄中值为62岁(范围为30到80岁)；36位患者为男性，14位患者为女性(表3)。表3A.NSCLC患者的特征与针对吉非替尼治疗的应答性之间的关联性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>B.对于患有进行性NSCLC并接受吉非替尼治疗的患者进行的Cov比例风险模型分析变量_风险比(95o/。CI)_P值单变量分析AREG(+/—)2.235(1.0504.761)0.037+TGFA(+/—)3.315(1.557—7.059)0.002+AREG或者TGFA(+/—)2.50(1.197—5.262)0.08+年龄(65^/<65)1.044(0.487—2.237)0.912性别(男性/女性)1.555(0.885-3.532)0.29组织学类型(其他/ADC+)1.6D(0.8484.013)0.309疾病阶段(11旧/其他)1.088(0.445-2.706)0.8390一般状态(2/0—1)6.707(2.544-17.682)0.001*吸烟史(吸烟者/从未吸烟)1.596(0.736-3.462)0.237多变量分析AREG(十/-)1.042(0.384—2.825)0.835TGFA(十/一)2.457(1.072—5.625)0.034+_体力状态(2/0-1)_4.792(1.420—16.171)0.0〗2+_缩写ADC，腺癌；SCC，鳞状细胞癌；ASC，腺鳞细胞癌；NS,不显著。*腺癌(ADC)对其他(SCC，鳞状细胞癌;以及ASC，腺鳞细胞癌).**11旧对其他分类。***PS0-1对PS2。****事先化疗0-1对其他疗法。*****从未吸烟对其他。+P<0.05(Fisher才企-睑)。NS:无明显差别+ADC腺癌。P<0.05按照东部协作肿瘤研究组(ECOG)的一般状态分类(PS)为0的有14位患者，为1的有26位患者，为2的有10位患者。有21位患者接受过至少两种化疗，34位接受过使用铂制剂的化疗。在研究开始时，32位患者目前(17)或者以前(15)吸烟。从组织学诊断的角度来看40人(80.0%)患有腺癌，7人(14.0%)患有鳞状细胞癌，3人(6.0%)患有腺鳞细胞癌。在吉非替尼治疗之后，八位患者被归类为PR,没有患者被归类为CR;12位患者被归类为SD，30位患者被归类为PD。对于吉非替尼治疗的应答率(CR+PR/CR+PR+SD+PD)为16.0%,疾病控制率(CR+PR+SD/CR+PR+SD+PD)为40.0°/。。在最后一名患者参与治疗后超过了四个月的2005年7月作出了最终判断。随访时间的中值是240天(范围为33-1011天)。血清双调蛋白/转化生长因子a的浓度，临床病理特征以及针对吉非替尼治疗的应答性通过cDNA微阵列分析对接受了第二线到第七线的吉非替尼单一疗法的进行性非小细胞肺癌患者的肿瘤中表达的基因进行检查，结果发现在PD的病例中双调蛋白和TGFA显著地过表达，但是在PR的病例中几乎无表达，(置换检验中的P值分别为9.3x10'12和0.0095;KakiuchiS，a"/.，Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43)。为了建立一种用于预测对于药物应答性的常规应用、侵害性小的临床测试方法，使用了两种蛋白作为血清学标记。更具体地说，使用来自于接受了吉非替尼治疗的50位不同的非小细胞肺癌患者的血清样品进行了针对两种蛋白的ELISA。基于每种蛋白的截断值(双调蛋白为93.8pg/mL,TGFA为15.6pg/mL)作出"阳性"或者"阴性"的判断。通过制定ROC曲线设定了截断值，该曲线是按照最佳诊断准确度以及区分疾病控制病例(PR+SD)与PD病例的似然比而制定的(图2)。按照这些截断值，在该50份血清样品中，将14位患者(28.0%)的血清判断为双调蛋白阳性，15位患者(30.0%)的血清判断为TGFA阳性(图1)。如在表1中所示，对这群患者中血清双调蛋白和TGFA的阳性度与吉非替尼治疗之间的相关性进行了分析。在30位PD患者中，12份(40.0%)血清样品是双调蛋白阳性的，然而采集自疾病受到控制的(PR或者SD)患者的20份样品中的18份(90.0%)是阴性(按照Fisher检验P=0.026)。来自于PD患者的30份样品中的13份(43.3%)是TGFA阳性的，而采集自PR或者SD患者的20份样品中的18份(90.0%)是阴性(按照Fisher检验P=0.014)。采集自PD患者的30t分血清样品中的19份(63.3。/。)是至少一种蛋白阳性的，然而来自于PR+SD患者的20份样品中的17份(85.0°/。)是阴性的(按照Fisher检验P=0.001)。这表明在63%的PD病例中，结合使用双调蛋白和TGFA的分析是良好的低应答性预测标志物。显示PD的假阳性比例仅有15.0%。表1也显示出在该50位患者中临床病理学因素与针对吉非替尼治疗的应答性之间的相关性。在本研究中，发现了一般状态(0/1对2;按照Fisher检验P=0.037)和吸烟史(目前和以前是吸烟者的对从不吸烟的人；按照Fisher检验P=0.035)以及双调蛋白和/或TGFA阳性度也同样地与针对吉非替尼的应答性有显著的相关性。如上所述，发现了吉非替尼治疗对双调蛋白阳性的14位患者中的12位以及TGFA阳性的15位患者中的13位没有作用。在标志物中的任意一种是阳性的22位患者中，有19位被判断为PD。接受吉非替尼治疗的双调蛋白阴性患者的存活时间的中值显著地长于双调蛋白阳性患者(按照时序检验P二0.032;图3A)。在TGFA-阴性患者中观察到了相同的结果(按照时序检验P二0.001;图3B)。也使用单变量分析对患者的预后与其它因子之间的相关性进行了评价，其中所述其它因子包括年龄、性别(男性对女性)、PS(0/1对2)、疾病阶段(IIIB对其他阶段)、吸烟史(目前或以前吸烟对从未吸烟)、组织学分类(腺癌对其他组织学类型)、血清双调蛋白值(阳性对阴性)以及血清TGFA值(阳性对阴性)(表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在这些变量中，血清双调蛋白阳性[优势比(OR),2.235;95%CI,1.050-4.761;P=0.037]、血清TGFA阳性(OR,3.315;95%CI,1.557-7.059;P=0.002)、以及PS(OR,6.707;95%CI，2.544—17.682;P<0.002)与预后不艮显著相关。然而，多变量分析的结果表明血清TGFA水平(OR，2.457;95%CI,1.072—5.625;P=0.034)以及PS(OR,4.792;95%CI,1.420—16.171;P=0.012)与接受了吉非替尼治疗的进行性非小细胞肺癌患者的预后征候并不显著相关。为了考察在EGFR突变与血清中双调蛋白水平及TGFA水平之间是否存在机理上的关系，使用13位患者的肿瘤通过PCR进行了对EGFR酪氨酸激酶结构域(外显子18-21)的直接测序，对这些患者的血清也进行了ELISA分析。如在表5中所示，在接受吉非替尼治疗之后显示PR或者SD的八位患者中的四位(50%)和显示PD的五位患者中的两位(40%)检测到了EGFR突变，这表明在EGFR突变与血清中双调蛋白以及TGFA的水平之间没有显著的相关性。表5NSCLC患者的临床病理学特性以及EGFR突变状态'PR,部分应答；SD,稳定；PD,进行性ND,未检测到突变双调蛋白和转化生长因子a在通过随机取样获得的肺癌组织中的表达状态为了考察双调蛋白和TGFA过表达的临床意义，还通过组织微阵列的方法检测了双调蛋白和TGFA蛋白的表达，其中该分析使用采自于随机选取的449位已经接受了手术的非小细胞肺癌患者的组织。如前报道的，主要在肿瘤细胞的细胞质和/或核中检测到了双调蛋白(EbertM,a/.,Cancer例子年龄.年1692663574645646537478489461053115912801369组织学ECOG—类型般状态ADC1ADC1ADC1SCC1SCC0ASC1ADC0ADC1ADC0ADC1ADC2SCC2ADC0EGFR突变针对吉非替尼的应答性缺失E746-A750PR缺失E746-A750PRL858RPRNDPRL858RSDNDSDNDSDNDSDL858RPDL858RPDNDPDNDPDNDPD吸烟史别性性性性tSi5J!法性3!&如如^1如^&^如^男1^如AcG王性汰性性wi!wi法Is!法法未未未前未前前未前前前未未从从从以从目以从目以以从从Res.1994;54:3959-62.;BostwickDQ"a/.,Prostate2004;58:164-8)。TGFA主要在肿瘤细胞的细胞质中被染色。如在表6中所示，性别(男性更高；按照Fisher检验P〈0.001)，组织学分类(非腺癌更高；按照Fisher检验P<0.001)以及吸烟史(目前和以前吸烟的人更高；按照Fisher检验P<0.001)与双调蛋白阳性显著地相关。对于TGFA发现了相似的趋势(男性更高，P-0.001;非腺癌更高，P<0.001;目前和以前吸烟的人的比例更高，按照Fisher检验P=0.005)。在非细支气管肺泡(P=0.004)和非乳头状(P=O.Oll)类型的腺癌中双调蛋白阳性的比例显著更高，但是对于TGFA阳性来说没有观察到显著的差别。表6在NSCLC组织中AREG/TGFA阳性与临床特性之间的相关性(n=449)AREG状态TGFA状态由I又里合计AREGAREGP值TGFA-TGFA-P值n=449-阳性n=163-阴性n=286阳性n=301阴性n=148性别体寐310141342976110<0.001*2237887610.001+年龄，y<6521577148NS14471NS2348613815777组织学类型ADC28578207170115secLCC121286119609<0.001*+9426272ASC15510114优势组织学类型乳头状非乳头状218555223166320.011+127329123NSBAC非BAC1381352748111870.004*78816054NS疾病阶段I+1I+HIA359130229NS248111NSII旧TT1+T29033575337320108212NS217103NST3+T412955748445NN0+N1336114222NS221115NSN2+N311349648033吸烟史非吸烟者吸烟者13931025138114172<0扁*8022159890駕*缩略i吾LCC,大细月包癌(large-cellcarcinoma);BAC,纟田支气管肺泡癌(bronchioloalveolarcarcinoma)。+P<0,05(Fisher检验)fADC对其它分类双调蛋白阴'性患者的存活时间的中值与双调蛋白阳性患者相比显著较长(按照时序检验P=0.013;表7)。同样地，TGFA阴性患者的存活时间的中值与TGFA-阳性患者的该值相比更长(按照时序检验P=0.029;表7)。表7对未接受吉非替尼治疗的进行性NSCLC患者的预后因子进行的Cov比例风险模型分析<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>十P<0.05吉非替尼是作为EGFR酪氨酸激酶的"选择性"抑制剂被开发的。然而，在体外或者体内系统中都没有发现在癌细胞对于吉非替尼的应答性与EGFR水平之间有明显的相关性。对于以前的研究中的患者进行的多变量分析发现就对于吉非替尼的应答的比例来说女性高于男性，并且腺癌患者高于鳞状细胞癌患者(FukuokaMd"/.,J.Clin.Oncol.2003;21:2237-46.;KimYHda/.,Clin.CancerRes.2004;10:7311-7)。近年的临床研究提示，吉非替尼可能有效的患者主要是患有细支气管肺泡肺瘤或者以乳头类型为优势的腺癌，并且无吸烟史(上述的KimYH""/.2004;MillerVAda/.,J.Clin.Oncol.2004;22:1103-9)。近年，由Lynch等(LynchTJ.，"a/"N.Engl.J.Med.2004;350:2129-39)和Paez等(PaezJGa/.,Science2004;304:1497-500)进行的研究显示EGFR的酪氨酸激酶结构域的突变与非小细胞肺癌对吉非替尼的敏感性之间有关联。包括EGFR突变在内的对于吉非替尼敏感性的临床病理学判断在一定程度上能够预测；然而，已知的因子都不能完美地预测非小细胞肺癌对于吉非替尼的应答性(上述的LynchTJ.,"a/"2004;上述的PaezJGaa/.,2004;PaoW&a/"Proc.Natl.Acad,Sci.USA2004;101:13306-11.;TokumoMda/.,Clin.CancerRes.2005;11:1167隱73.;MitsudomiT"a/.，J.Clin.Oncol.2005;23:2513-20.;上述的KakiuchiS自/.，2004)。此外，吉非替尼治疗的临床效果并不局限于诸如PR这样的客观见效，并且也应该适用于SD患者(上述的KakiuchiSe^/.，2004)。在以前的报道的临床试验(上述的FukuokaM"a/.,2003;KimYH"a/.，2004)中，一组患者虽然肿瘤尺寸没有可观的减小，但是显示出了症状的改善和病况稳定期的延长。该研究与本发明的研究也是一致的就是说，与PD患者的存活时间(按照时序检验P=0.011)相比PR+SD组患者的存活时间大大延长了。对于突变或者表达谱的分析是耗时的程序，并且需要含有足够数目的癌细胞的活检样品。进行性非小细胞肺癌患者很少选择外科手术，并且其治疗方案的选择不一定需要为了病理学诊断而进行侵害性的活检样品采集，因此上述的突变或者表达语分析等方法不适于进行常规的药物应答性诊断。事实上，涉及经支气管活检的主要并发症的发病率为0.5%到6.8%(BritishThoracicSociety.Guidelinesondiagnosticflexiblebronchoscopy.SubcommitteeonStandardsofCareCommittee,BritishThoracicSociety.Thorax2001;56:il-21)。因此，本发明人认为必须马上建立诸如血清学检测这样的能够很容易在任何医院应用的安全的更小伤害性的系统来预测个体患者对于药物应答性。本发明人发现，双调蛋白和TGFA这两种EGFR和ErbB的配体在对于吉非替尼无应答性的肺瘤细胞中显著地过表达，但是在应答性细胞中很难检测得到(上述的KakiuchiSda/.,2004)。通过对一群进行性非小细胞肺癌患者的血清中双调蛋白和TGFA的值考察，发现双调蛋白和TGFA蛋白对于预测这样的患者对于吉非替尼的低应答性具有很高的诊断价值。30位吉非替尼非应答性的患者中的12人(40%)的血清双调蛋白是阳性的，而对于TGFA,30位患者中的13人(43.3。/。)的血清是阳性的。联合使用两个标志物将对于非应答性患者的检测灵敏度提高到了63.3%。分析EGFR突变的已知方法能够选择PR患者，但是根本不能识别SD患者(上述的LynchTJ.,&a/.,2004;PaezJGWa/.,2004;PaoWWa/.,2004;TokumoM"a/.，2005;MitsudomiTWa/.，2005)。另一方面，基于本发明的<吏用这两种标志物的预测系统，主要针对吉非替尼，能够将PD病例与PR或者SD患者区分开来。这是本发明重要的优点之一。实际上，统计分析也支持血清双调蛋白和TGFA值在生物学上与EGFR突变状态不相关的假设。这项研究也显示，与双调蛋白或者TGFA阴性的患者相比，阳性患者的存活时间更短。特别地，使用这些血清中标志物的诊断显示，每种标志物都是独立地与预后不良相关。一项III期试验主要终点初始分析(对于1，692例肺癌患者的易瑞莎存活率的评价；http:〃www.astrazeneca.com/pressrelease/4245.aspx)显示，在双盲法分析中，吉非替尼与安慰剂相比不一定能延长所有的母群体(风险比，0.89;P=0.11;中值，5.6对5.1个月)和腺癌患者(风险比，0.83;P=0.07;中值，6.3对5.4个月)的存活时间。尽管如此，在统计学上，对这些人群的客观见效率有所提高、对东方裔患者以及从未吸烟的患者有延长生命的效果。本发明人所得到的结果表明，可以使用血清双调蛋白和/或TGFA值来挑选出可能对于吉非替尼无应答、不能得到任何延长生命的益处的患者，从而将吉非替尼的益处延伸到实际上能够从其治疗获益的患者身上。目前，对血清双调蛋白以及TGFA的检测是用于预测进行性非小细胞肺癌对吉非替尼治疗的非应答性的唯一常规的且有意义的方法。因此，开发基于本发明的试剂盒，在选择吉非替尼治疗的过程中检测血清中双调蛋白和TGFA的阳性度是有用的。'EGFR配体自分泌途径在肺癌细胞的存活和生长中的重要性是无可置l是的(FontaniniGda/.,Clin.CancerRes.1998;4:241-9.;HurbinAda/.,J.Biol.Chem.2002;277:49127-33)。然而，虽然一些证据表明双调蛋白的过表达与非小细胞肺癌患者存活时间的缩短之间有关联，但是双调蛋白和TGFA在肺癌细胞的发展和生长中的作用尚未得到很好的了解(上述的FontaniniGda/.，1998)。本发明人的研究还显示，在非小细胞肺癌组织中的双调蛋白和TGFA蛋白在一定程度上确实与已经接受了手术治疗的患者的预后不良有关。而且，男性、非腺癌、以及吸烟史均与非小细胞肺癌组织中的双调蛋白和TGFA阳性相关，并且在组织学上，腺癌的一些类型(非乳头状以及非细支气管肺泡肿瘤)也与双调蛋白阳性相关。近来，其他研究组已经报道过吉非替尼对于乳头优势型和/或细支气管肺泡胂瘤型的腺癌有效；他们的数据也提示双调蛋白/TGFA的表达以及组织学分类与吉非替尼抗性相关。另一方面，近来报道了双调蛋白在人肺腺癌细胞中的抗凋亡活性(上述的HurbinAetal.,2002)。为了观察在非小细胞肺癌细胞中是否由于双调蛋白的抗凋亡活性诱导产生针对吉非替尼的抗性，预先使用对吉非替尼敏感但是不表达双调蛋白的非小细胞肺癌细胞系PC9实施了生物学分析。其结果发现，由于双调蛋白的自分泌，吉非替尼对PC-9细胞的抗肿瘤活性显著下降(上述的KakiuchiS^a/.，2004)。该结果有力的证明，虽然EGFR的生长因子信号由于配体、二聚化因子、效应物、下游途径等等因素的多样性而与各种步骤相关，但是双调蛋白是配体-受体自分泌途径的首要激活因子，并且诱导癌细胞针对吉非替尼的抗性。总结来说，本发明显示了血清中双调蛋白以及TGFA值是对于非小细胞肺癌针对吉非替尼的应答性的预测而言最重要的因子。对于血清中双调蛋白和TGFA值的测定是预测对于erbB受体抑制剂的应答性的常规可行的、无伤害性而且廉价的方法。工业实用性可使用本发明来预测erbB受体抑制剂对肺癌的疗效。erbB受体抑制剂包括吉非替尼(商品名易瑞莎⑧)等物质。此外，本发明提供使用erbB受体抑制剂治疗肺癌的方法。可以根据本发明来鉴定被预测为对erbB受体抑制剂具有低应答性的患者。更具体地，本发明能够更灵敏地检测不能期望对erbB受体抑制剂会有应答性的患者。也就是说，本发明能够更特异地检测出对erbB受体抑制剂有应答性的患者。其结果是，根据本发明，可以使用'erbB受体抑制剂更有效地实施肺癌治疗。权利要求1.一种治疗肺癌的方法，该方法包括对血液AREG浓度与标准值相比较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。2.—种治疗肺癌的方法，该方法包括对血液AREG浓度或者血液TGFA浓度与标准值相比较低，或者此二者的浓度与标准值相比均较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。3.权利要求2的治疗肺癌的方法，该方法包括对血液AREG浓度或者血液TGFA浓度与标准值相比较低的患者施用erbB受体抑制剂的步骤。4.权利要求1的治疗方法，其中该erbB受体抑制剂是选自由吉非替尼、埃罗替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib组成的组的任意化合物。5.—种肺癌治疗剂，该治疗剂含有erbB受体抑制剂作为活性成分，供施用于血液AREG浓度与标准值相比较低的患者。6.—种肺癌治疗剂，该治疗剂含有erbB受体抑制剂作为活性成分，供施用于血液AREG浓度和血液TGFA浓度与标准值相比均较低的患者。7.权利要求5或6的肺癌治疗剂，其中该erbB受体抑制剂是选自由吉非替尼、埃罗替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib组成的组的任意化合物。8.erbB受体抑制剂在制备肺癌治疗剂中的用途，所述治疗剂供施用于血液AREG浓度和血液TGFA浓度与标准值相比均较低的患者。9.一种治疗肺癌用试剂盒，该试剂盒包括以下组件(1)含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂；以及(2)记载下列内容的说明书血液AREG浓度与标准值相比较高的患者对于含有针对erbB受体抑制剂的抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性较低。10.权利要求9的治疗肺癌用试剂盒，该试剂盒还包括以下组件(3)记载下列内容的说明书血液TGFA浓度与标准值相比较高的患者对于含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性较低。11.一种检查对于肺癌治疗剂的应答性的方法，其中该肺癌治疗剂含有erbB受体抑制剂作为活性成分，其中该方法包括以下步骤(1)测量肺癌患者的血液样品中的AREG浓度；以及(2)当AREG浓度与标准值相比较高时，确定该患者对于含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性较低。12.权利要求11的检查方法，该方法还包括以下步骤，(1)测量肺癌患者的血液样品中的TGFA浓度；以及(2)当AREG浓度或者TGFA浓度高于标准值或者此二者的浓度均高于标准值时，确定该患者对于含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性较低。13.权利要求11的方法，其中当AREG浓度或者TGFA浓度相比于标准值较高时，确定该患者对于含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性较低。14.权利要求U的检查方法，该方法包括使用免疫测定来测量血液样品中AREG浓度。15.—种检查试剂盒，用于检查针对含有erbB受体抑制剂作为活性成分的肺癌治疗剂的应答性，其中该试剂盒包括以下组件i.用于测量AREG血液浓度的免疫测定试剂；以及ii.AREG的阳性对照。16.权利要求15的检查试剂盒，该试剂盒还包括以下组件iii.用于测量TGFA血液浓度的免疫测定试剂；以及iv.TGFA的阳性对照。17.权利要求16的^:查试剂盒，其中阳性对照样品含有AREG和TGFA。18.权利要求17的检查试剂盒，其中阳性对照样品是液体。全文摘要本发明提供了治疗肺癌的方法，该方法使用针对肺癌的含有作为活性成分的erbB受体抑制剂治疗剂。还提供了测定肺癌患者对于erbB受体抑制剂应答性的方法，该方法使用血液双调蛋白(AREG)作为指示剂。此外，也提供了选择性地对预期有反应的患者施用治疗剂来治疗肺癌的方法，在该方法中基于血液中AREG浓度来确定针对erbB受体抑制剂的应答性。通过对按预想对erbB受体抑制剂有反应的患者施用该抑制剂可以期望获得更好的疗效。本发明有助于提高吉非替尼(产品名易瑞莎)以及此类药物对于肺癌的疗效。文档编号G01N33/574GK101415440SQ200680054190公开日2009年4月22日申请日期2006年2月10日优先权日2006年2月10日发明者中村佑辅,醒醐弥太郎申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司