技术简介：
本发明针对现有技术中薄层色谱法灵敏度低、气相色谱法分离能力差、酶联免疫法抗体制备复杂等问题，提出采用DB-5MS毛细气相色谱柱与微池电子捕获检测器联用的新方法。通过优化样品衍生化处理流程，实现DON和NIV的高灵敏度、高精度同步检测，检出限分别达1.78μg/kg和24.7μg/kg，回收率80%以上，显著优于传统方法，解决了粮食毒素检测的准确性与效率瓶颈。
关键词：气相色谱法,毒素检测
专利名称：测定粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的方法
技术领域：
本发明属分析化学领域，具体涉及一种测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀 菌烯醇在粮食中含量的方法。 背录技术脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，又名为呕吐毒素(vomitoxin or vomiting toxin, VT)，以及雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol， NIV)都是某些镰刀 菌(主要是禾谷镰刀菌)产生的毒素，属B族单端孢霉稀族毒素。DON的结构为 3a ， 7a ， 15-三羟基-12、 13-环氧单端孢霉_9烯-8酮，NIV的结构为3a ， 4 e， 7a， 15-四羟基-12、 13-环氧单端孢烯-9烯-8酮。DON和NIV的结构式如 下<formula>formula see original document page 3</formula><table>table see original document page 3</column></row><table>DON和NIV的毒性包括急性毒性、慢性和亚慢性毒性、细胞毒性、致突变、 致崎、致癌作用及免疫毒性。它们主要在田间浸染小麦、玉米等谷类作物。DON 是赤霉病麦中毒的主要病原物质。当人误食入受污染的粮谷作物时，其典型症状 是呕吐，有地方称其为"醉谷病"。现有技术公开的测定粮谷中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的方 法有薄层色谱法；填充柱气相色谱法；酶联免疫法(脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测)等。其中，薄层色谱法，由于随机误差以及不确定因素太多，导致其测定结果不是很稳定；并且薄板测定方法的检出限大于125yg/kg;填充柱气相色谱法，其中填充柱的制备较为繁复，且与毛细气相色谱相比分离能力较低；酶联免疫法，影响因素太多以及抗体制备复杂，且在一系列研究方面与毛细气相色谱法比较显示出了,联免疫方法的缺点。发明内容本发明的目的是提供一种简便而准确的能同时测定粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪Hii刀菌烯醇含量的方法。本发明方法采用毛细气相色谱法测定谷物以及豆类中的脱氧雪腐镰刀菌烯 酵的含量。本发明方法对粮食类待测样品经过样品预处理后，加入反应溶剂以及衍生化 试剂进行衍生化反应，然后采用毛细色谱法测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇与雪腐镰刀 菌烯醇衍生物的浓度，再经过换算成粮食类样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及雪腐镰 刀菌烯,的含量。本发明釆用DB-5MS毛细气相色谱柱以及微池电子捕获检测器(y ECD)，测定 谷物以及豆类粮食类样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，明显提高了检测的灵 敏度以及准确度。本方法的毛细气相色谱仪操作条件为DB-5MS毛细柱，载气流速1.82.5ml/min;温度为气化室300 350°C; u ECD 300 350°C，层析柱250 300 'C。本发明方法测定粮食类样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇与雪腐镰刀菌烯醇含量 准确、可靠。脱氧雪腐镰刀菌烯醇出峰时间为4.9分钟左右，线性范围9 150 lig/kg，线性相关系数ri. 99952，最小检出量1.78ug/kg。雪腐镰刀菌烯醇出 峰时间为7.1分钟左右，线性范围50 800ug/kg，线性相关系数ri. 99353， 最小检出量24.7yg/kg。谷类中脱氧雪腐镰刀菌烯醇回收率86%以上，RSD小于 9.8%，毒腐镰刀菌烯醇回收率80%以上，RSD小于6。/q。本发明对面粉，玉米，豆类共20份粮食样品进行毛细气相色谱法与现有技 术的国家标維GB/T5009. 111-2003的第二法中规定采用的酶联免疫(ELISA)测 定结果比较，所得的结果经Wilcoxon秩和检验，P=0. 5，显示统计学上没有显著差异。本发明方法与酶联免疫法比较，具有回收率高，精密度好，变动系数小等优 点，测定结果准确，能极大地提高工作效率，，显示出如下显著优势(1) 本发明方法的回收率为86.84% 101.85%，变异系数〈10%;酶联免疫 方法的回收率为85 110%，变异系数〈10%，本发明方法的回收率区间更窄，方 法更可靠；(2) 最低检出限酶联免疫方法检测下限为18.5ug/kg，本发明方法的检 测下限为1.78ug/kg，本发明方法的灵敏度以及检测能力可达到酶联免疫方法 的10倍；(3) 成本以及效率本发明方法采用了 DB-5MS毛细柱以及先进的毛细气相 色谱仪自动进样，且配备精密的纪录软件，操作大为简便；(4)本方法的待测样品稳定时间可维持12个小时以上，但酶联免疫法的样品需要在完成后的IO分钟以内完成；本方法的样品不受数量多而影响前后样品反应时间不同而造成误差，相反，酶联免疫方法由于受到严格的时间限制，采用的 是微量注射器，所以带来的系统误差大，且每批样品不可太多，检测操作较繁琐。表1是本方法(毛细气相色谱法)与酶联免疫法测定粮食中DON的结果比较。表l<table>table see original document page 5</column></row><table>
图1是DON和NIV的标准色谱图，其中，在出峰时间为4.9分钟有一个脱氧雪腐镰刀菌烯醇的峰；7.1分钟 有一个雪腐镰刀菌烯醇的峰。
具体实施方式 实旛例l色谱条件美国Agilent 6890型气相色谱仪(包括微池电子捕获检测器、 自动进样系统)；色谱柱DB-5MS毛细气相色谱柱载气流速1. 8 2. 5ml/min; 温度为气化室300 350。C;uECD 300 350°C,层析柱250 300°C。样品制备1.提取称取20g粉碎过筛的谷类样品置于250ml具塞锥型瓶中，加30ml 石油醚和100ml甲醇-水(3: 1)溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡 30分钟，静置片刻，以快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待分层后，放出下层 甲醇-水溶液于另一锥型瓶中，水浴蒸干。加入4ml甲醇，置超声波发生器内超 声2分钟，取4ml上柱。2. 柱层析层析柱制备按照Tanaka方法制备层析柱。在层析柱底端塞上少许玻璃棉， 加入5g无水硫酸钠，加入约30ml石油醚后，再加入10克弗罗里硅土，振摇、 敲紧后再覆兼5g无水硫酸钠。柱层析取4ml甲醇提取液上柱。先用30ml石油醚以2ml/min的速度淋洗， 洗脱杂质。再用150ml氯仿一甲醇(9: 1)以2ml/min的速度洗脱毒素。收集氯 仿一甲醇液，水浴蒸干。残渣用2ml甲醇溶解。3. 衍生取上述甲醇提取液0.5ml于具塞试管中，在45'C下用氮气吹干。加 入O. lmlTMS衍生剂,塞紧瓶盖，作用20分钟，加入lml乙酸乙酯，摇匀后以2000 转/分的速度离心3分钟，取lul进气相色谱仪分析。线性试验配制标准系列，使DON的浓度分别为0. 045、 0. 09、 0. 15、 0. 3、 0. 75 y g/ml,NIV的浓度分别为0. 25、 0.5、 1.0、 2.0、 4.0ixg/ml，取1 y 1进样。以浓度为 横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，以下按"样品制备"项处理。以衍生 物峰面积对脱氧雪腐镰刀菌烯衍生物浓度进行线性回归，其回归方程为 f-MZ .67《75J-7fti^^^,相关系数r=0.99952 (n=5);以衍生物峰面积对雪腐 镰刀菌烯衍生物浓度进行线性回归，其回归方程为P幼忍似WLT-3银2浙私 相关系数户O. 99353 (n=5) 精密度和回收率试验-取空白谷类样品，加入18、 30、 60ug/kg的DON标准样品和100、 500和 1000ug/kg的NIV标准样品。每个浓度取4个平行样品，以下按"样品制备"项 处理。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标 准偏差，精密度以相对标准偏差(RSD)表示，(C. /C ) 乂100%即为回收率。表2是D0N的精密度和回收率试验结果。表3是NIV的精密度和回收率试验结果。表2<table>table see original document page 7</column></row><table>表3脱氧雪腐镰刀菌100400800烯醇加入量(ug/kg)78. 776.285. 7回收率(%)79.479.281. 776.686.285.286.578.487.9RSD%(n=4)5. 35. 43. 0平均回收率(%)80. 3080. 0085. 13(n=4)
权利要求1. 测定粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的方法，其特征是采用毛细气相色谱法测定粮食中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，包括下述步骤(1)对粮食类待测样品预处理；取粉碎过筛的粮食样品，加石油醚和甲醇-水3∶1溶液，振荡，静置，过滤分层后，放出甲醇-水溶液，水浴蒸干，加入甲醇，超声后，得提取液；(2)加入反应溶剂以及衍生化试剂进行衍生化反应；取上述甲醇提取液上柱，用石油醚淋洗，洗脱杂质后，用氯仿-甲醇9∶1洗脱毒素，收集氯仿-甲醇液，水浴蒸干；取上述甲醇提取液，45℃氮气吹干，加入TMS衍生剂作用后，加入乙酸乙酯，摇匀、离心，取样品进气相色谱仪分析；(3)采用毛细色谱法测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇与雪腐镰刀菌烯醇衍生物的浓度；(4)换算成粮食类样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及雪腐镰刀菌烯醇的含量，以衍生物峰面积对脱氧雪腐镰刀菌烯衍生物浓度进行线性回归，其回归方程为Y＝1272.81675X-10.28932，；以衍生物峰面积对雪腐镰刀菌烯衍生物浓度进行线性回归，其回归方程为Y＝2832.04931X-348.28655。
2、 按权利要求1所述的方法，其特征是步骤1所述的粮食类待测样品是谷 物或豆类样品。
3、 按权利要求1所述的方法，其特征是步骤3所述的毛细色谱法的条件为DB-5MS毛细柱，载气流速1.8 2.5ml/min;温度为气化室300 350°C; u ECD 300 35(TC,层析柱250 300°C。
全文摘要本发明属分析化学领域，具体涉及一种测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇在粮食中含量的方法。本发明采用DB-5MS毛细气相色谱柱以及微池电子捕获检测器，测定谷物以及豆类粮食类样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，能明显提高检测的灵敏度以及准确度。本发明方法测定结果准确，能极大地提高工作效率，与现有技术比较，具有回收率高，精密度好，变动系数小等优点。
文档编号G01N30/00GK101226173SQ20071003651
公开日2008年7月23日 申请日期2007年1月16日 优先权日2007年1月16日
发明者星 李, 郭红卫, 马易怡 申请人:复旦大学