专利名称：裸子植物花粉管微管骨架的免疫荧光标记方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域中花粉管微管骨架的免疫荧光标记方法及其应用，特别是涉及一种对裸子植物花粉管微管骨架进行免疫荧光标记的方法以及用该方法对裸子植物花粉花粉管微管骨架进行显微镜观测中的应用。
背景技术：
花粉管作为有花植物受精过程中雄性生殖单位的载体，具有典型的顶端生长特性，因而成为生物技术领域中研究细胞极性生长的理想模式系统。此外，花粉管系统对细胞间的相互作用研究以及信号传导研究也具有重要意义。细胞骨架是花粉管的基本组织结构，参与细胞形态建成、极性维持、细胞器及囊泡运动等重要的生理过程，特别是存在于花粉管顶端区域的微管，对花粉管内细胞器转运以及维持花粉管形态和结构具有极其重要的调节功能。
对于花粉管中微管骨架的分布至今仍然存在争议。目前，花粉管微管骨架的荧光标记方法主要有固定细胞荧光标记法、转基因荧光标记法以及显微注射荧光标记法等。迄今为止，对裸子植物花粉粒与花粉管中微管骨架进行标记的有效方法和技术还未见报道，从而导致与裸子植物相关的生物学研究相对被子植物而言比较滞后。
发明内容
本发明的目的是提供一种较快速、有效的裸子植物花粉管微管骨架的免疫荧光标记方法。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种对裸子植物花粉管微管骨架进行免疫荧光标记的方法，包括以下步骤1)将裸子植物花粉管用浓度为3-5g多聚甲醛/100ml 40-60mM Pipes缓冲液的固定液固定40-60min；2)洗涤花粉管；3)将花粉管置于浓度为0.5-1g果胶酶和纤维素酶/100ml水的酶溶液中，在20-30℃下酶解30-40min；4)洗涤花粉管；5)将花粉管置于体积/体积百分比浓度为0.5-1％的Triton X-100中渗透1-3h；6)洗涤花粉管；
7)加入作为一抗的抗β-tubulin单克隆抗体孵育1-3h；8)洗涤花粉管；9)加入与一抗特异结合的荧光标记的二抗避光孵育1-3h，微管骨架被免疫荧光标记。
在上述荧光标记方法中，步骤1)中的40-60mM Pipes缓冲液的配方为每升水含40-60mM PIPES，2mM MgCl2，5mM EGTA，pH6.8-7.0(优选为6.9)。
步骤1)中的固定液优选浓度为4g多聚甲醛/100ml 40-60mM Pipes缓冲液，固定时间优选为60min。
步骤3)中果胶酶和纤维素酶液的浓度优选为1g果胶酶和纤维素酶/100ml水；所述果胶酶和纤维素酶液中的果胶酶和纤维素酶的重量份数比为1∶0.5-2；酶解温度及酶解时间可根据所用酶的性质进行选择，酶解温度优选为25℃，酶解时间优选为40min。所用果胶酶和纤维素酶均可选择市售产品。
步骤5)中的渗透剂优选为1％的Triton X-100，渗透时间优选为1.5h。
步骤7)中的抗β-tubulin单克隆抗体可为市售的各种抗β-tubulin的单克隆抗体，尤以Sigma公司(USA)的效果最佳；所述抗β-tubulin单克隆抗体溶液的工作浓度一般为1∶50-150比例的稀释液，优选为1∶100的稀释液；所述孵育时间优选为3h。
步骤9)中的二抗可为市售的各种与步骤7)中所述一抗特异结合的经荧光标记的二抗，如Sigma公司(USA)出售的产品，所述荧光标记可为FITC标记、TRITC标记、Alexa 488、Cy2、Cy3、Rhodamine B或Texas Red等；所述二抗溶液的工作浓度一般为1∶50-150比例的稀释液，优选为1∶100比例的稀释液；所述孵育时间优选为1h。
步骤2)、步骤4)、步骤6)和步骤)8中的洗涤液均为40-60mM Pipes缓冲液，优选为50mM Pipes缓冲液。
上述荧光标记方法特别适用于松杉纲、银杏纲以及苏铁纲的裸子植物；所述松杉纲中包括白杆、青杆、油松、云杉或冷杉等松科裸子植物；所述银杏纲的代表植物为银杏；苏铁纲的代表植物为苏铁。
所述的任一项方法对裸子植物花粉管微管骨架荧光标记，然后滴加含质量百分含量0.15-0.25％抗荧光淬灭剂的浓度为40-60％的甘油，封片，最后用激光共聚焦显微镜对花粉管微管骨架进行观测。
本发明的第二个目的是提供一种对裸子植物花粉管微管骨架进行显微镜观测的方法。
本发明所提供的对裸子植物花粉管微管骨架进行显微镜观测的方法，是先用上述方法对裸子植物花粉管微管骨架荧光标记，然后滴加含0.15-0.25％(W/W)抗荧光淬灭剂的40-60％(V/V)甘油，封片，用激光共聚焦显微镜进行观测，可清晰地观测到花粉管的微管骨架。
所述抗荧光淬灭剂的选择是多种多样的，如Propyl gallate、Vectashield或Fenyleen diamine等。
本发明提供了一种对裸子植物花粉管微管骨架进行免疫荧光标记的方法。本发明的标记方法具有以下优点1)操作简单，快速省略了常规标记方法中BSA的封闭步骤；2)标记效果好可在激光共聚焦显微镜下清晰地观测到花粉管呈网络状排布的微管骨架；3)标记后材料可稳定保存免疫荧光标记的材料封片后在4℃避光条件下可保存2周以上。本发明将在裸子植物花粉管细胞骨架的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为在激光共聚焦显微镜下观察到的白杆花粉管微管骨架的分布状态图2为在激光共聚焦显微镜下观察到的青杆花粉管微管骨架的分布状态具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/W)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例1、白杆花粉管微管骨架的免疫荧光标记及其显微镜观测用本发明的方法对白杆花粉管微管骨架进行免疫荧光标记，包括以下步骤1)收集待标记的白杆花粉管样品，在新鲜配制的含4％(g/ml)多聚甲醛的50mMPipes缓冲液(每升水含50mM PIPES，2mM MgCl2，5mM EGTA，pH6.9)中快速抽气固定60min，缓冲液的用量以浸泡过花粉管样品为准；2)用50mM Pipes缓冲液洗涤3次，每次10min，以去除残余的多聚甲醛；3)将花粉管置于1g/100ml的果胶酶(购自Yakult Honsha Co.Ltd，3000U/g)和纤维素酶(购自Yakult Honsha Co.Ltd，3000U/g)液中在25℃下酶解35min，其中，果胶酶和纤维素酶的重量份数比为1∶1；酶液的用量以浸泡过花粉管样品为准；4)用50mM Pipes缓冲液洗涤3次，每次10min；5)将花粉管置于1％(V/V)Triton X-100中渗透1.5h，Triton X-100的用量以浸泡过花粉管样品为准；6)用50mM Pipes缓冲液洗涤3次，每次10min；
7)加入单克隆一抗，抗β-tubulin抗体(购自Sigma，按1∶100的比例稀释)，添加量为2-4μg/mL(以浸泡过花粉管样品为准)，在25℃下孵育3h；8)用50mM Pipes缓冲液洗涤3次，每次10min；9)加入连接FITC的二抗-羊抗小鼠IgG(购自Sigma，按1∶100的比例稀释)，添加量以浸泡过花粉管样品为准，在25℃下避光孵育1h，微管骨架被免疫荧光标记。
然后，将经免疫荧光标记的微管骨架用50mM Pipes缓冲液洗涤3次，再向经过荧光标记的花粉管样品中滴入含0.2％(V/V)Propyl gallate(Sigma公司，USA)的50％(V/V)甘油，用指甲油封片，最后在激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 510，Ar/Kr激光，激光波长514nm)下进行观测，沿Z轴进行连续光学切片，并将所有光学切片进行三维重构，观测结果如图1所示，用本发明的方法对白杆花粉管微管骨架进行免疫荧光标记后可在激光共聚焦显微镜下清晰地观测到微管骨架在花粉管中的分布状况。
实施例2、青杆花粉管微管骨架的荧光标记及其显微镜观测用本发明的方法对青杆花粉管微管骨架进行免疫荧光标记，包括以下步骤1)收集待标记的青杆花粉管样品，在新鲜配制的含3％(g/ml)多聚甲醛的60mMPipes缓冲液(每升水含60mM PIPES，2mM MgCl2，5mM EGTA，pH6.9)中快速抽气固定60min，缓冲液的用量以浸泡过花粉管样品为准；2)用40mM Pipes缓冲液洗涤4次，每次5min，以去除残余的多聚甲醛；3)将花粉管置于1g/100ml的果胶酶(购自Yakult Honsha Co.Ltd，3000U/g)和纤维素酶(购自Yakult Honsha Co.Ltd，3000U/g)液中在30℃下酶解30min，其中，果胶酶和纤维素酶的重量份数比为2∶1；酶液的用量以浸泡过花粉管样品为准；4)用60mM Pipes缓冲液洗涤4次，每次5min；5)将花粉管置于1％(V/V)Triton X-100中渗透1h，Triton X-100的用量以浸泡过花粉管样品为准；6)用40mM Pipes缓冲液洗涤4次，每次5min；7)加入单克隆一抗，抗β-tubulin抗体(购自Sigma，按1∶150的比例稀释)，添加量为2-4μg/mL(用量以浸泡过花粉管样品为准)，在25℃下孵育3h；8)用50mM Pipes缓冲液洗涤3次，每次10min；9)加入连接FITC的二抗-羊抗小鼠IgG(购自Sigma，按1∶50的比例稀释，用量以浸泡过花粉管样品为准)，在25℃下避光孵育1h，微管骨架被免疫荧光标记。
然后，将经免疫荧光标记的微管骨架用50mM Pipes缓冲液洗涤4次，每次5min，再向经过荧光标记的花粉管样品中滴入含0.25％(V/V)Vectashield(购自Sigma公司)的40％(V/V)甘油，用指甲油封片，最后在激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 510，Ar/Kr激光，激光波长514nm)下进行观测，沿Z轴进行连续光学切片，并将所有光学切片进行三维重构，观测结果如图2所示，用本发明的方法对青杆花粉管微管骨架进行免疫荧光标记后可在激光共聚焦显微镜下清晰地观测到微管骨架在花粉管中的分布状况。
实施例3、油松花粉管微管骨架的荧光标记及其显微镜观测用本发明的方法对油松花粉管微管骨架进行免疫荧光标记，包括以下步骤1)收集待标记的油松花粉管样品，在新鲜配制的含5％(g/ml)多聚甲醛的40mMPipes缓冲液(每升水含40mM PIPES，2mM MgCl2，5mM EGTA，pH6.9)中快速抽气固定50min，缓冲液的用量以浸泡过花粉管样品为准；2)用60mM Pipes缓冲液洗涤2次，每次15min，以去除残余的多聚甲醛；3)将花粉管置于0.5％(W/W)的果胶酶(购自Yakult Honsha Co.Ltd，3000U/g)和纤维素酶(购自Yakult Honsha Co.Ltd，3000U/g)液中在25℃下酶解40min，其中，果胶酶和纤维素酶的重量份数比为1∶2，用量以浸泡过花粉管样品为准；4)用40mM Pipes缓冲液洗涤2次，每次15min；5)将花粉管置于0.5％(V/V)Triton X-100中渗透3h，Triton X-100的用量以浸泡过花粉管样品为准；6)用60mM Pipes缓冲液洗涤2次，每次15min；7)加入单克隆一抗，抗β-tubulin抗体(购自Sigma，按1∶50的比例稀释)，添加量为2-4μg/mL(用量以浸泡过花粉管样品为准)，在25℃下孵育1h；8)用50mM Pipes缓冲液洗涤2次，每次15min；9)加入Alexa 488标记的二抗-羊抗小鼠IgG(购自Sigma，按1∶150的比例稀释，用量以浸泡过花粉管样品为准)，在25℃下避光孵育3h，微管骨架被免疫荧光标记。
然后，将经免疫荧光标记的微管骨架用50mM Pipes缓冲液洗涤2次，每次15min，再向经过荧光标记的花粉管样品中滴入含0.15％(V/V)Fenyleen diamine(购自Sigma公司)的60％(V/V)甘油，用指甲油封片，最后在激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 510，Ar/Kr激光，激光波长488nm)下进行观测，沿Z轴进行连续光学切片，并将所有光学切片进行三维重构。结果在激光共聚焦显微镜下可清晰地观测到油松微管骨架在花粉管中的分布状况，证明本发明的免疫荧光标记方法可用于花粉管微管骨架的显微观测。
实施例4、银杏花粉管微管骨架的荧光标记及其显微镜观测用本发明的方法对银杏花粉管微管骨架进行免疫荧光标记，包括以下步骤1)收集待标记的银杏花粉管样品，在新鲜配制的含4％(g/ml)多聚甲醛的50mMPipes缓冲液(每升水含50mM PIPES，2mM MgCl2，5mM EGTA，pH6.9)中快速抽气固定40min，缓冲液的用量以浸泡过花粉管样品为准；2)用35mM Pipes缓冲液洗涤3次，每次10min，以去除残余的多聚甲醛；3)将花粉管置于1.2％(W/W)的果胶酶(购自Yakult Honsha Co.Ltd，3000U/g)和纤维素酶(购自Yakult Honsha Co.Ltd，3000U/g)液中在25℃下酶解35min，其中，果胶酶和纤维素酶的重量份数比为1∶0.5，酶液用量以浸泡过花粉管样品为准；4)用35mM Pipes缓冲液洗涤3次，每次15min；5)将花粉管置于0.8％(V/V)Triton X-100中渗透2h，用量以浸泡过花粉管样品为准；6)用45mM Pipes缓冲液洗涤2次，每次15min；7)加入单克隆一抗，抗β-tubulin抗体(购自Sigma，按1∶100的比例稀释)，添加量为2-4μg/mL(用量以浸泡过花粉管样品为准)，在25℃下孵育2h；8)用45mM Pipes缓冲液洗涤2次，每次15min；9)加入TRITC标记的二抗-羊抗小鼠IgG(购自Sigma，按1∶100的比例稀释，用量以浸泡过花粉管样品为准)，在25℃下避光孵育2h，微管骨架被免疫荧光标记。
然后，将经免疫荧光标记的微管骨架用50mM Pipes缓冲液洗涤3次，每次10min，再向经过荧光标记的花粉管样品中滴入含0.2％(V/V)Propyl gallate(购自Sigma公司)的50％(V/V)甘油，用指甲油封片，最后在激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 510，Ar/Kr激光，激光波长543nm)下进行观测，沿Z轴进行连续光学切片，并将所有光学切片进行三维重构。结果在激光共聚焦显微镜下可清晰地观测到银杏微管骨架在花粉管中的分布状况，证明本发明的免疫荧光标记方法可用于花粉管微管骨架的显微观测。
权利要求
1.一种对裸子植物花粉管微管骨架进行免疫荧光标记的方法，包括以下步骤1)将裸子植物花粉管用浓度为3-5g多聚甲醛/100ml 40-60mM Pipes缓冲液的固定液固定40-60min；2)洗涤花粉管；3)将花粉管置于浓度为0.5-1.2g果胶酶和纤维素酶/100ml水的酶溶液中，在20-30℃下酶解30-40min；4)洗涤花粉管；5)将花粉管置于体积/体积百分比浓度为0.5-1％的Triton X-100中渗透1-3h；6)洗涤花粉管；7)加入作为一抗的抗β-tubulin单克隆抗体孵育1-3h；8)洗涤花粉管；9)加入与一抗特异结合的荧光标记的二抗避光孵育1-3h，微管骨架被免疫荧光标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中的固定液的浓度为4g多聚甲醛/100ml 40-60mM Pipes缓冲液，固定时间为60min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3)中果胶酶和纤维素酶液的浓度为1g果胶酶和纤维素酶/100ml水；所述果胶酶和纤维素酶液中的果胶酶和纤维素酶的重量份数比为1∶0.5-2；酶解温度为25℃，酶解时间为40min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤5)中的渗透剂为1％的Triton X-100，渗透时间为1.5h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤7)中的抗β-tubulin单克隆抗体为Sigma公司的抗β-tubulin的单克隆抗体；所述抗β-tubulin单克隆抗体溶液的工作浓度为1∶50-150比例的稀释液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤9)中二抗的荧光标记为FITC标记、TRITC标记、Alexa 488、Cy2、Cy3、Rhodamine B或Texas Red标记；所述二抗溶液的工作浓度为1∶50-150比例的稀释液；所述孵育时间为1h。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于所述步骤2)、步骤4)、步骤6)和步骤)8中的洗涤液均为40-60mM Pipes缓冲液。
8.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于所述裸子植物为松杉纲、银杏纲或苏铁纲植物；所述松杉纲植物为松科的白杆、青杆、油松、云杉或冷杉；所述银杏纲植物为银杏；所述苏铁纲植物为苏铁。
9.一种对裸子植物花粉管微管骨架进行显微镜观测的方法，是先用权利要求1-7所述的任一项方法对裸子植物花粉管微管骨架荧光标记，然后滴加含质量百分含量0.15-0.25％抗荧光淬灭剂的浓度为40-60％的甘油，封片，最后用激光共聚焦显微镜对花粉管微管骨架进行观测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述抗荧光淬灭剂为Propylgallate、Vectashield或Fenyleen diamine。
全文摘要
本发明公开了一种裸子植物花粉管微管骨架的免疫荧光标记方法及其应用。该方法包括以下步骤1)将裸子植物花粉管用浓度为3－5g多聚甲醛/100ml 40－60mM Pipes缓冲液的固定液固定40－60min；2)洗涤花粉管；3)将花粉管置于浓度为0.5－1.2g果胶酶和纤维素酶/100ml水的酶溶液中，在20－30℃下酶解30－40min；4)洗涤花粉管；5)将花粉管置于体积/体积百分比浓度为0.5－1％的Triton X－100中渗透1－3h；6)洗涤花粉管；7)加入作为一抗的抗β－tubulin单克隆抗体孵育1－3h；8)洗涤花粉管；9)加入与一抗特异结合的荧光标记的二抗避光孵育1－3h，微管骨架被免疫荧光标记。本发明将在裸子植物花粉管细胞骨架的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。
文档编号G01N21/64GK101074952SQ20071011775
公开日2007年11月21日 申请日期2007年6月22日 优先权日2007年6月22日
发明者林金星, 王晓华, 盛仙永 申请人:中国科学院植物研究所