专利名称：：癌转移判断方法及其装置的制作方法
技术领域：
：本发明涉及判断淋巴结中的癌转移的判断方法及装置。
背景技术：
：淋巴结组织有多少癌转移，一般通过组织学诊断来判断。在组织学诊断中，将淋巴结组织切薄片制作切片，用可对癌细胞特异性结合的标记抗体对切片中的癌细胞染色，然后镜下观察，以此测定癌转移的程度。但是，检査需要熟练，在很大程度上依赖于检査者的技术，很难得到客观的判断结果。作为判断癌细胞淋巴结转移的方法，比如为人所知的是JP2006053113上记载的方法。JP2006053113上对肺腺癌淋巴结转移的诊断方法有所记述。具体而言，以有淋巴结转移的患者的肺组织切片和无淋巴结转移的患者的肺组织切片为试样，测定各种分子的表达量，以此鉴别作为转移判断标记物有用的分子。用该分子可以判断在肺腺癌患者中的肺癌淋巴结转移。然而，使用这种技术无法判断有多少癌转移到淋巴结。
发明内容本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节
发明内容的陈述所限。本发明的目的是提供一种能够客观判断有多少癌细胞转移到淋巴结的方法。本发明提供一种用于判断癌转移灶大小的癌转移判断方法，包括以下步骤定量从疑有癌细胞转移的淋巴结制备的检测试样中的肿瘤标志物mRNA;以及根据所述mRNA的定量结果求所述淋巴结中转移灶大小。其中所述mRNA的定量结果是所述检测用试样中所述mRNA的绝对其中所述肿瘤标志物为细胞角蛋白19。其中还包括将所述mRNA的定量结果与第一阈值比较的步骤，当所述mRNA的定量结果大于所述第一阈值时实行求所述转移灶大小的步骤。其中所述第一阈值设定为50~3000拷贝数/^L'Lysate。本发明所提供的癌转移判断方法，包括以下步骤定量从疑有癌细胞转移的淋巴结制备的检测试样中的肿瘤标志物mRNA;将所述mRNA的定量结果与第一阈值比较；以及根据比较结果判断所述淋巴结为癌转移阴性还是癌转移阳性。其中还包括输出步骤，即根据所述判断结果输出表示该淋巴结为癌转移阴性还是为癌转移阳性的信息。其中所述输出步骤在所述判断结果为癌转移阳性时，还输出转移灶大小。其中所述比较步骤可以将所述mRNA定量结果与第一阈值和比该第一阈值高的第二阈值进行比较；所述判断步骤根据与第一阈值和第二阈值的比较结果判断所述淋巴结为癌转移阴性、癌转移弱阳性还是癌转移强阳性。其中还包括根据与第一阈值和第二阈值的比较结果输出表示所述淋巴结为癌转移阴性、癌转移弱阳性还是癌转移强阳性的信息的步骤。其中所述输出步骤在所述判断结果为癌转移弱阳性时输出表示转移灶为微转移的信息。其中所述输出步骤在所述判断结果为癌转移强阳性时输出表示转移灶为大转移的信息。，其中所述第二阈值设定为200020000拷贝数4iL'Lysate。本发明提供一种癌转移判断装置，包括定量系统，定量从疑有癌细胞转移的淋巴结制备的检测试样中的肿瘤标志物mRNA;比较系统，将所述mRNA的定量结果与第一阈值进行比较；以及判断系统，根据比较结果判断所述淋巴结为癌转移阴性还是癌转移阳性。其中还包括显示系统，该显示系统根据判断结果输出表示所述淋巴结为癌转移阴性还是癌转移阳性的信息。其中所述显示系统当所述判断结果为癌转移阳性时还输出转移灶大小。其中所述比较系统将所述mRNA的定量结果与第一阈值和比第一阈值高的第二阈值进行比较，所述判断系统根据所述与第一阈值和第二阈值的比较结果判断所述淋巴结为癌转移阴性、癌转移弱阳性还是癌转移强阳性。其中还包括显示系统，它根据所述判断结果，输出表示所述淋巴结为癌转移阴性、癌转移弱阳性还是癌转移强阳性的信息。其中所述显示系统当所述判断结果为癌转移弱阳性时，还输出表示转移灶为微转移的信息。其中所述显示系统当所述判断结果为癌转移强阳性时，还输出表示转移灶为大转移的信息。通过本发明可以判断有多少癌细胞转移到淋巴结。图1为本发明一实施方式装置1的整体结构的斜视图。图2为核酸定量系统101的整体结构的斜视图。图3为核酸定量系统101的平面略图。图4为控制器102d的结构框图。图5为控制器102d的处理流程图。图6为显示器102c上判断结果显示界面的一例。图7为乳腺癌转移灶尺寸和CK19mRNA定量结果的关系图。图8为大肠癌转移灶尺寸和CK19mRNA定量结果的关系图。图9为有来自乳头腺管癌的癌细胞转移的淋巴结中的mRNA表达量与转移灶所含癌细胞数的关系图。图10为有来自充实腺管癌的癌细胞转移的淋巴结中的mRNA表达量与转移灶所含癌细胞数的关系图。图11为有特定体积转移灶的淋巴结中CK19mRNA表达量的推测值。图12为使用采自乳腺癌患者的淋巴结时CK19mRNA定量结果的显示图。图13为使用采自大肠癌患者的淋巴结时CK19mRNA定量结果的显示图。具体实施例方式本发明一实施方式是判断从生物体采集的淋巴结所含癌转移的方法。用此方法可以求出淋巴结中癌转移灶(以下也简单称为转移灶)的大小。在此，所谓转移灶的大小包含从淋巴结制作组织切片时观察到的转移灶长边和面积、从该长边计算出的转移灶体积、转移灶质量和转移灶所含癌细胞数量等。在本说明书中所说的癌症指恶性的肿瘤，与恶性肿瘤同义。癌症包括癌、肉瘤和来源于造血器官的癌等。癌为乳腺癌、胃癌、大肠癌、前列腺癌、宫胫癌和子宫癌等来自上皮组织的癌。肉瘤有骨肉瘤和软肉瘤等。来自造血器官的癌有白血病和恶性淋巴瘤等。求转移灶的大小首先要定量淋巴结中所含的肿瘤标志物mRNA(以下也简称为mRNA)。所谓肿瘤标志物mRNA指从肿瘤标志物遗传基因转录的mRNA。所谓肿瘤标志物遗传基因指如上所述在癌细胞的表达量和在正常细胞的表达量不同而且有用的遗传基因。作为肿瘤标志物遗传基因，例如有编译CK18、CK19、CK20等CK(细胞角蛋白)、CEA(癌胚抗原)、MUC1、MMG(乳腺球蛋白)、PSA(前列腺特异抗原)、CA15-3、EPCAM(上皮细胞粘附分子)等的遗传基因。定量mRNA时，最好从所述淋巴结制备检测试样，再定量该检测试样中所含mRNA。比如，通过混合淋巴结和缓冲剂，对缓冲剂中的细胞进行化学和/或物理处理，即可将细胞中的RNA移至(溶解)液中，以此含RNA溶液为检测试样。为了控制RNA的分解，最好缓冲剂为强酸性。PH的理想范围为2.55.0，最好为3.04.0。为了使缓冲剂保持在这一范围，可以使用公认的缓冲剂。缓冲剂里最好含有表面活性剂。用表面活性剂破损细胞膜和核膜。通过这种破损，细胞中的核酸更易移到溶液中。对表面活性剂的种类没有特别限制，只要有这种作用即可，不过最好为非离子型表面活性剂，以聚氧乙烯类非离子型表面活性剂为好。特别以以下通式表示的聚氧乙烯类非离子型表面活性剂最为合适R1-R2-(CH2CH20)N-H(在此，Rl是碳原子数1022的烷基、链烯基、炔基、异辛基；R2是-O画或-(C6H6)-O-;N为8120的整数。)比如有聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鲸蜡醚、聚氧乙烯油酯醚、聚氧乙烯肉豆蔻醚、聚氧乙烯硬脂醚、聚氧乙烯壬基苯酚醚和聚氧乙烯异辛苯酚醚等。其中尤以BRij35(聚氧乙烯(35)月桂醚)为宜。表面活性剂在缓冲液中的浓度0.16%(v/v)为宜，15%(v/v)更好。用后述核酸扩幅法定量mRNA时，该缓冲剂最好含有二甲亚砜(DMSO)。淋巴结中有时含有阻碍核酸扩幅中的酶反应的物质(阻碍物质)，通过DMSO的作用可以有效地减少阻碍物质的影响。DMSO还有抑制核扩增酶的活性降低的作用。作为处理液中的DMSO浓度，以150%(v/v)为宜，530%(v/v)更好，最好是1025%(v/v)。制备检测用试样时，最好对淋巴结进行均质化等物理处理。这样，淋巴结的细胞膜和核膜被物理性破碎，细胞内的核酸更易移至溶液中。可以有效地将存在于细胞膜内的癌标志物移至溶液中。均质化可以用杵等工具手工进行，也可以使用市场上出售的电动均质器。将所得粉碎物离心分离数秒数分钟，即可使浮在粉碎物中的细胞碎片等沉淀。以此即可得到作为检测用试样的含RNA等物的上清液(溶解产物)。定量mRNA可以用核酸扩增和DNA切片等众所周知的方法。若使用核酸扩增法，以在核酸扩增反应前含逆转录反应的RT-PCR(ReverseTranscriptionPCR)法禾口RT-LAMP(ReverseTranscriptionLAMP:关于LAMP法参照US6410278)法等为宜。特别是定量核酸扩增法，可以使用SYBRGREEN法和TAqMAN(罗氏诊断产品公司的注册商标)法(参照LindaG.Lee,1993,NucleicAcidsResearch,vol.21,p3761-3766等)等众所周知的方法。用于mRNA定量的DNA芯片，可以使用固定了能与所述肿瘤标志物基因cDNA杂交的DNA的多核甙酸及/或其片段的基质。使用DNA芯片检测RNA可以使用众所周知的常用方法。比如可以如下进行。先利用存在于检测用试样中的mRNA3'端polyA(多聚腺苷酸)序列进行逆转录反应。进行逆转录反应时，比如使用以Cy3和Cy5等荧光物质标记的核甙酸合成经荧光标记的cDNA。让该cDNA与所述固定了多核甙酸的基质接触，则此多核甙酸和被标记的cDNA形成双链。形成双链后，测定cDNA的荧光即可定量mRNA。用所述方法测出的mRNA定量结果可以是单位体积的mRNA的物质量、mRNA质量和拷贝数等。也可以是反应液的荧光强度、浑浊度和透射光强度等达到一定值所需的时间和周期数(使用PCR时)等。通常与肿瘤标志物mRNA定量的同时，定量所有细胞表达量都为一定恒量的遗传基因(比如管家基因等以下称标准化基因)的mRNA，再用标准化基因等的mRNA的定量值除以肿瘤标志物mRNA的定量值，以此换算每单位标准化基因的mRNA的肿瘤标志物mRNA表达量(比如参照M.Inokuchietal.，BritishJournalofCancer(2003)89,1750-1756)。但是，当淋巴结不仅含有癌细胞，还含有大量正常淋巴结细胞时，由于测定结果受正常细胞数的左右，有时会无法求出正确的转移灶大小。因此，在本实施方式中，不对肿瘤标志物mRNA的定量值迸行标准化，而直接使用定量值(绝对值)。mRNA的定量结果与转移灶大小有关。因此，如上所述，根据mRNA的定量结果可以求出转移灶在淋巴结的大小。也可以分阶段地求转移灶的大小。当求各阶段的转移灶大小时，拿mRNA的定量结果和数个阈值进行比较。此时，应至少有一个阈值(第一阈值)设定为可识别癌阴性和癌阳性。阈值根据癌和肿瘤标志物种类适当设定。当求转移灶大小时，最好先用此第一阈值识别阴性和阳性，再对转移阳性的病灶求转移灶大小。第一阈值可以设定为低于己确认有癌细胞存在的淋巴结(阳性标本)所含mRNA的定量值，高于已确认无癌细胞存在的淋巴结(阴性标本)所含mRNA的定量值。最好预测数个阳性标本的mRNA的定量值和数个阴性标本的mRNA的定量值，将能以最高概率识别阳性标本和阴性标本的值设定为阈值。如要取得所述阶段性信息，则除第一阀值外还使用第二阈值。即，当mRNA的定量结果低于第一阈值时，可判断实际上不存在转移灶(即癌转移阴性)。当mRNA的定量结果高于第一阈值、低于第二阈值时，可判断存在较小转移灶(癌转移弱阳性)。当mRNA的定量结果高于第二阈值时，可判断存在较大转移灶(癌转移强阳性)。淋巴结中的转移灶根据大小分为微转移(Micrometastasis)和大转移(Macrometastasis)。在由淋巴结组织制作的组织切片中，已确认有转移灶且转移灶长边不足2mm的转移灶称为微转移灶。转移灶长边超过2mm的称为大转移灶。所述第二阈值可以设定为能识别微转移灶和大转移灶。除第二阈值以外，还可以根据转移灶大小设定数个阈值。从肿瘤标志物mRNA的表达量也可以取得转移灶大小的定量信息。即，可以定量求得淋巴结中癌细胞数和转移灶的面积、体积或质量等。本发明的另一个实施方式是实施所述方法的癌转移判断装置。用该装置可以阶段性地求出淋巴结中的转移灶大小。下面根据附图，就此装置进行说明。图1为显示本发明一实施方式的装置1整体结构的斜视图。此装置1由核酸定量系统101和与核酸定量系统101连接可以进行有线通信的个人电脑(PC)102构成。个人电脑102如图1所示，包含由键盘组成的输入设备102A、由监视器组成的显示器102c和分析测定结果的控制器102d。以下用图2和图3就装置1的核酸定量系统101进行说明。图2为显示核酸定量系统101的整体结构的斜视图。图3为图2的核酸定量系统101的平面略图。核酸定量系统101如图2所示，包括分装机构IO、上样单元20、吸嘴安装单元30、吸嘴废弃单元40、由5个反应检测块50a构成的反应检测单元50和用于向X方向和Y方向移送分装机构10的移送器60。分装机构10如图2所示，包括被移送器60向X方向和Y方向(水平方向)移动的旋臂11和与旋臂11相对可各自独立向Z方向(垂直方向)移动的一对(二支)注射器12。如图2和图3所示，上样单元20从装置眼前开始依次有10个试样管插孔21A21j、一个酶试剂容器孔21K和一个引物试剂容器孔21L。10个试样管插孔21A21j分5行2列排列。试样管插孔21c和21d、试样管插孔21E和21f、试样管插孔21g和21H、试样管插孔21i和21j分别从装置里面向外依次置于试样放置位置l、试样放置位置2、试样放置位置3和试样放置位置4。本实施方式中，正面左侧的试样管插孔21c、21E、21g和21i用于插装有对预先切除的生物组织进行所述处理(匀质化、过滤等)制作的溶解产物(检测用试样)的试样管22，正面右侧的试样管插孔21d、21f、21H和21j插装有所述试样稀释到10倍的稀释试样的试样管23。试样管插孔21A用于放置装阳性对照物(INCt)的容器24，该阳性对照物用于确认应该扩增的核酸正常扩增；而试样管插孔21B用于放置装有阴性对照物的容器25，该阴性对照物用于确认不该扩增的核酸正常未扩增。酶容器插孔21K和引物试剂容器插孔21L分别放置装有用于扩增对应于CK19mRNA(肿瘤标志物mRNA:以下也称CK19mRNA)的cDNA(以下也称CK19cDNA)的核酸扩增酶试剂的酶试剂容器26和引物试剂容器27，该引物试剂容器27装有含可杂交为CK19cDNA的引物的试剂(以下称引物试剂)。反应检测单元50的各反应检测块50A如图2和图3所示，由反应部51、二个浊度检测部52和闭合机构53(参照图3)构成。设置于各反应检测块50A的反应部51如图3所示，设置有二个用于放置检测池54的检测池孔51A。各反应检测块50A从装置里侧向外依次排列于池位1、池位2、池位3、池位4和池位5。浊度检测部52由置于反应部51—侧基板55A上的由有465nm波长的兰色发光二极管组成的发光二极管光源部52A和配置于反应部51另一侧基板55b上的光电二极管集光部52b构成。各反应检测块50a分别配置了由一个发光二极管光源部52A和一个光电二极管集光部52b组成的一组浊度检测部52各二组。检测池54有装试样的2个试样池54a和盖2个试样池54a的2个盖子54b。移送器60如图2所示，有向Y方向移送分装机构10的直行向导61和球型螺杆62、驱动球型螺杆62的步进电动机63、向X方向移送分装机构10的直行向导64和球型螺杆65、驱动球型螺杆65的步进电动机66。向X方向和Y方向移送分装机构10是靠步进电动机63和步进电动机66分别转动球型螺杆62和65实现的。下面参照图1~图3就本实施方式的核酸定量系统101的运行过程进行说明。在本实施方式中，如上所述，用RT-LAMP法对与手术切除的淋巴结组织中的CK19mRNA(肿瘤标志物)对应的cDNA进行扩增，测定随着扩增产生的焦磷酸镁形成的白色沉淀物的浑浊度变化。根据浑浊度达到一定值所需时间(扩增开始时间)，测定CK19mRNA的量(拷贝数/pLLysate)，以此与阈值比较。Lysate意指溶胞产物。首先如图2和图3所示，对从生物切除下来的组织进行预处理(匀质化、过滤等)，将由此制备的检测用试样装入试样容器22，将该试样容器22插入试样管插孔21c21j。将装有阳性对照物的容器24和装有阴性对照物的容器25分别插入试样管孔21A和21B(参照图3)。在酶试剂容器孔21K(参照图3)和引物试剂容器孔21L分别放入装有CK19cDNA扩增用核酸扩增酶试剂的酶试剂容器26和装有CK19cDNA扩增用引物试剂的引物试剂容器27。吸嘴安装单元30设置2个各自收纳36个使用后丢弃的吸移管吸嘴31的托盘32。核酸扩增装置101—启动，首先，分装机构10被图2所示移送器60从初始位置移到吸嘴安装单元30后，分装机构10的二个注射器12在吸嘴安装单元30向下移动。于是，二个注射器12的顶端插入二个吸移管吸嘴31的上部开口处，从而自动装上吸移管吸嘴31。当二个注射器12向上移动之后，分装机构10的旋臂11向X方向移动，移向装有引物试剂的引物试剂容器27的上方。位于引物试剂容器27上方的一个注射器12向下移动，吸移引物试剂后向上移动。分装机构10的旋臂11被移送器60向Y方向移动，使另一个注射器12同样位于引物试剂容器27的上方。然后另一个注射器12向下移动，同样从引物试剂容器27吸移引物试剂后向上移动。如此，引物试剂容器27内的引物试剂被安装在注射器12上的二个吸移管吸嘴31吸移。引物试剂吸移后，二个注射器12都移向上方后，分装机构10的旋臂11被移送器60移向位于最里面(正对装置的里侧)池位1的反应检测块50a上方。在最里面的反应检测块50a，二个注射器12向下移动，使装在二个注射器12的二个吸移管吸嘴31分别插入检测池54的二个池54a中，再用注射器12将引物试剂分别吐到二个池54a中。引物试剂吐出后，二个注射器12向上移动，分装机构10的旋臂11被移送器60向X方向移动，移到吸嘴废弃单元40的上方。在吸嘴废弃单元40的上方，吸移管吸嘴31被丢弃。具体而言，二个注射器12向下移动，使吸移管吸嘴31插入吸嘴废弃单元40的二个吸嘴废弃孔40a(参照图3)。在此状态下，分装机构10的旋臂11被移送器60向Y方向移动，使吸移管吸嘴31移到槽40b下面，然后向上移动二个注射器12，吸移管吸嘴31上部的缘卡在槽40b下面，受到向下的力，从而吸移管吸嘴31自动脱离二个注射器12的嘴部，这样，吸移管吸嘴31就被丢弃在吸嘴废弃单元40。接下来，以同样的动作酶试剂从酶试剂容器26吐到所述池54a，再以同样的动作将试样从试样容器22和试样容器23吐到所述池54a。引物试剂、酶试剂和试样向所述池54a的吸移动作完成后，检测池54的盖子54b闭合。当此闭合动作完成后，将检测池54内的液温从约20°C加温到约65°C，通过RT—LAMP反应对与CK19mRNA对应的cDNA进行;扩增。随扩增生成的焦磷酸镁形成白色沉淀物，用比浊法检测该白色沉淀物。具体而言，用图3所示发光二极管光源部52a和光电二极管集光部52b检测(监测)扩增反应过程中检测池54内的浊度。试样的浊度数据从核酸定量系统101实时传送到计算机102。计算机102的控制器102d实时接收浊度数据。,图4为控制器102d的结构框图。此控制器102d主要由CPU6A、ROM6B、RAM6c、硬盘6d、输出输入接口6E、图像输出接口6f和通信接口6g构成，CPU6A、ROM6B、RAM6c、硬盘6d、输出输入接口6E、图像输出接口6f和通信接口6g通过总线6H连接，可进行数据通信。CPU6A可以执行存储在ROM6B和硬盘6d的计算机程序和读到;RAM6c中的计算机程序。ROM6B存储由CPU6A执行的计算机程序及其所用数据等。RAM6c用于读取存储在ROM6B和硬盘6d的计算机程序。还可以作为CPU6A执行这些计算机程序时的工作空间。硬盘6d装有供CPU6A执行的各种计算机程序以及执行计算机程序所>需的数据。这些计算机程序用于分析核酸定量系统101输送的浊度信息，并输出分析结果。输出输入接口6E接由键盘组成的输入设备102A。输入设备102A用于在输出界面进行操作等。图像输出接口6f接显示器102c，显示器102c用于实时显示从核酸定量系统101接收的浊度，输出分析结果等。通信接;口6g接核酸定量系统101，用于接收浊度信息。下面，根据图5就计算机102的控制器102d处理过程进行说明。控制器102d实时从核酸定量系统101接收浊度数据(步骤Sl)。根据反应液浊度达到一定值所需的时间，计算出mRNA的拷贝数(拷贝/VL，Lysate)(步骤S2)，比较此拷贝数和预设阈值(第一阈值和性第二阈值)，以此判断癌转移灶的大小(步骤S3)。具体地说，mRNA的拷贝数低于250拷贝/^t1^Lysate(第一阈值)的话，即判断为癌转移阴性，实际上不存在转移灶。如果mRNA的拷贝数超过250拷贝&LLysate(第一阈值)、不到5000拷贝/^L.Lysate(第二阈值)的话，则判断为癌转移弱阳性(+)，即有微转移灶。如果mRNA的拷贝数在10000拷贝/^iLLysate(第二阈值)以上，则判断为癌转移强阳性(++)，即有大转移灶。最后，控制器102d将这些判断结果输送到计算机102的显示器102c(步骤S4)，并显示出来。所谓"拷贝/pLLysate"表示直径约6mm的淋巴结组织在4mL的缓冲液(pH3.4，含200mM甘氨酸-HCI、5%Brij35(聚氧乙烯(35)十二醇，希格玛公司生产)和20。/。DMSO(和光纯药制))中溶解、再稀释10倍所得的lpL溶解物中的mRNA拷贝数。在所述实施方式中，第一阈值可设定在503000拷贝/VLLysate之间，以1001000拷贝/pLLysate为宜，200300拷贝/pLLysate更好。第二阈值可设定在200020000拷贝年LLysate，以400010000拷贝/pLLysate更好。下面，根据图6就显示器102c中的判断结果显示界面的一例进行说明。栏200显示CK19mRNA扩增所需的时间，栏205显示了阳性对照物的扩增所需时间。CPU6A据此算出的CK19mRNA表达量(拷贝/iiL)显示在栏201。将此表达量与第一阈值和第二阈值进行比较，所得有关转移灶大小的信息显示在栏202。图6显示为++，即癌强阳性。进行了CK19mRNA扩增的反应液浑浊度的实时曲线显示在栏203，阳性对照物扩增后的反应液浑浊度的实时曲线显示在栏205。所述实施方式的装置根据与阈值的比较结果，阶段性地判断淋巴结中的转移灶大小。但是，如上所述，从mRNA的拷贝数的计算结果也可以定量取得转移灶面积和转移灶所含细胞数等信息。举例(实施例l)(1)免疫组织化学染色用11个从乳腺癌患者切除的淋巴结组织和7个从大肠癌患者切除的淋巴结组织，通过免疫组织化学染色测定转移灶面积(转移灶尺寸)。'在这些淋巴结(约50600mg/个)中央部位附近切出厚约10pm的切片(以下也称片)，放在载玻片上。对该切片用抗CK19抗体和Envision试剂盒(均为DAKO公司产品)进行癌细胞染色。再用GS-710CalibratedDensitometer(Bio~Rad公司制)检测该切片癌细胞的转移灶大小。测定结果(mm2)见以下表l。(2)CK19mRNA定量在所述切片邻近处切片(厚约10pm)，用RNeasyMini试剂盒(QIAGEN公司制)提取RNA，制备RNA试样。用此RNA试样配制以下成份的反应液，通过TAqMAN法计算出CK19mRNA的拷贝数。TAqMAN法的测定用TaqMan—步法RT-PCR混合试剂盒(TaqManOne-stepRT-PCRiMasterMix)和PRISM@7700实时荧光PCR仪(Prism7700RealtimePCRsystem)(均为ABI(应用生物系统公司)产品)按照所附使用说明书进行。反应液(50pL)构成蒸溜水20.10^iLRNA试样2pL;TaqMan2XUniversalPCR混合试剂盒25|aL40XMultiScribeandRNaseInhibitorMix1.25lOOuM上游引物0.15uL100uM下游引物0.15uL7.4PmOL/uL(终浓度200Nm)TaqMan探针1.35&L检测CK19mRNA的引物序列和TaqMan探针的序列如下上游引物5'-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3'(序列号l)下游引物5'-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3'(序列号2)TaqMan探针5，-GCCTACCTGAAGAAGAACCATGAGGAGGAA-3，(序列号3)此TaqMan探针5，端有6-羧基荧光素(FAM),3，端有6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)。mRNA的定量值(拷贝数/片)如以下表1所示。乳腺癌的转移灶大小与CK19mRNA定量结果的关系如图7所示，大肠癌的转移灶大小与CK19mRNA定量结果的关系如图8所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>从表l、图7和图8可以看出，无论大肠癌还是乳腺癌，CK19mRNA定量结果与转移灶大小(mm2)都有相关关系。因此，得以确认，通过定量CK19mRNA即可预测转移灶大小(mm2)。(实施例2)从1个有来源于乳头腺管癌的癌细胞转移的淋巴结以一定间隔切出35片厚约10pm的切片。对这35片切片与实施例1(1)一样进行免疫组织化学染色，计算癌细胞数(个/片)。由于不能把用于免疫组织化学染色的切片用于mRNA定量，故与实施例1同样测定该切片邻近切片(厚约lO(iL)的mRNA表达量(拷贝数/片)，把此定量结果与免疫组织化学染色算出的癌细胞数对应起来。mRNA表达量与癌细胞数的关系如图9所示。从1个有来源于充实腺管癌的癌细胞转移的淋巴结以一定间隔切出30片厚约10pm的切片。对这30片切片与实施例1(1)一样进行免疫组织化学染色，计算癌细胞数(个/片)。然后使用各切片邻近的切片，与实施例l(2)同样测定mRNA表达量(拷贝数/片)。再与实施例2—样，将供癌细胞计数的一定切片中的mRNA表达量作为邻近切片的mRNA表达量，mRNA表达量与癌细胞数的关系如图10所从图9和图IO可以看出，CK19mRNA的表达量与癌细胞数显示出良好的相关性。由此得知，通过定量CK19mRNA可以预测转移灶中的癌细(实施例3)用11个确认没有癌转移的淋巴结(阴性标本)同实施例1(2)制备胞数。检测用试样，测定各标本中的CK19mRNA表达量(背景值)。以表1所示乳腺癌数据为基础，计算假设转移灶在各切片中为一边lmm的立方体(体积lmm3)时的CK19mRNA表达量和假设一边为2mm的立方体(体积8mm3)时的CK19mRNA表达量。再在转移灶为lmm3时的CK19mRNA表达量和8mm3时的CK19mRNA表达量上分别加背景值阴性标本的CK19mRNA表达量。艮卩，这些值为1个没有转移灶的淋巴结的CK19mRNA表达量(背景值)、1个有lmm3转移灶的淋巴结的CK19mRNA表达量推测值和1个有8mm3转移灶的淋巴结的CK19mRNA表达量推测值。这些值如图11所示。从图11可以通过将第一阈值设为1.0E+07拷贝数，将所述标本分为阴性和阳性。即，当从淋巴结测定的CK19mRNA表达量低于第一阈值时，可以预测该淋巴结没有癌细胞转移，若超过第一阈值，则可以预测该淋巴结有癌细胞转移。在本实施方式中，第一阈值可设定为背景最高值3.0E+06拷贝数以上。在组织判断中，转移灶长边为2mm时称为大转移，不到2mm则称为微转移。从图11可知，假设一边为2mm的立方体的CK19mRNA表达量的最低值约为2.0E+8.0拷贝数，因此，通过以此为第二阈值也可预测转移灶是微转移还是大转移。(实施例4)分别在64个采自乳腺癌患者的淋巴结(42个阴性标本、22个阳性标本)和69个采自大肠癌患者的淋巴结(33个阴性标本、36个阳性标本)(直径约6mm/个)中添加4mLpH3.4的缓冲液(含200mM甘氨酸-HCI、5%Brij35(聚氧乙烯(35)十二醇，希格玛公司生产)和20%DMSO(和光纯药制))，用搅拌机匀质化，再以10,000xg离心分离l分钟，取上清。将此上清用所述缓冲液稀释10倍，取检测用试样(Lysate)2pL。将此检测用试样和核酸扩增用试剂"细胞角蛋白试剂"(希森美康公司制)装入核酸扩增装置"GD-100"(希森美康公司制)，定量检测试样中的CK19mRNA(拷贝数/pLLysate)。使用采自乳腺癌患者的淋巴结时的CK19mRNA定量结果如图12所示，使用采自大肠癌患者的淋巴结时的CK19mRNA定量结果如图13所示。本实施例使用的检测用试样比起实施例3使用的检测用试样稀释到4万倍，因此，在图12和图13中，将第一阈值设定为250拷贝数/VL丄ysate，第二阈值设定为5000拷贝数/pLLysate。从图12，通过比较CK19mRNA的表达量(拷贝数/pLLysate)和第一阈值，可以判断所有阴性标本为阴性，所有阳性标本为阳性。即，能够确认，可以以百分之百的准确率判断淋巴结为阴性还是阳性。在本实施例中，通过将第一阈值设定在200~1000拷贝数/pLLysate之间，可以得到与所述同样的结果。根据图12还可以设想到CK19mRNA表达量(拷贝数/pLLysate)超过第二阈值的标本含乳腺癌的大转移灶，高于第一阈值低于第二阈值的标本含有乳腺癌的微转移灶。从图13，通过比较CK19mRNA的表达量(拷贝数/pLLysate)和第一阈值(250拷贝数4iI^Lysate)，可以判断出所有阴性标本为阴性，36个阳性标本中有35个判断为阳性。gp，能够确认，可以以99%的准确率判断淋巴结为阴性还是阳性。在本实施例中，通过将第一阈值设定在100-300拷贝数4iLLysate之间，可以得到与所述同样的结果。在图13还可以设想到CK19mRNA表达量(拷贝数/^iLLysate)超过第二阈值的标本含大肠癌的大转移灶，高于第一阈值低于第二阈值的标本含有大肠癌的微转移灶。从本实施例结果可以看出，无论是乳腺癌还是大肠癌均可用同一阈值(第一阈值和第二阈值)测定淋巴结中的转移灶。前述的详细说明及附图是通过文字解释和图示来进行的，其目的不在于限定权利要求的保护范围。本说明书中的具体实施方式的各个变种对于普通技术人员来说显而易见，并处于权利要求及其等同技术的保护范围内。序列表<110>希森美康<120>癌转移判断方法及其装置<130〉IP3869<160>3<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>CK19mRNA的设计引物<400>1cagatcgaaggcctgaagga20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>CK19mRNA的设计弓|物<400>2cttggcccctcagcgtact19<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>CK19mRNA的设计引物<400>3gcctacctgaagaagaaccatgaggaggaa30权利要求1.一种用于判断癌转移灶大小的癌转移判断方法，包括以下步骤定量从疑有癌细胞转移的淋巴结制备的检测试样中的肿瘤标志物mRNA；以及根据所述mRNA的定量结果求所述淋巴结中转移灶大小。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的定量结果是所述检测用试样中所述mRNA的绝对量。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤标志物为细胞角蛋白19。4.根据权利要求1所述的方法，其中还包括将所述mRNA的定量结果与第一阈值比较的步骤，当所述mRNA的定量结果大于所述第一阈值时实行求所述转移灶大小的步骤。5.权利要求4所述方法，其中所述第一阈值设定为50~3000拷贝数/pL罷Lysate。6.—种癌转移判断方法，包括以下步骤定量从疑有癌细胞转移的淋巴结制备的检测试样中的肿瘤标志物mRNA;将所述mRNA的定量结果与第一阈值比较；以及根据比较结果判断所述淋巴结为癌转移阴性还是癌转移阳性。7.根据权利要求6所述的方法，其中还包括输出步骤，即根据所述判断结果输出表示该淋巴结为癌转移阴性还是为癌转移阳性的信息。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述输出步骤在所述判断结果为癌转移阳性时，还输出转移灶大小。9.根据权利要求6所述的方法，其中所述比较步骤可以将所述mRNA定量结果与第一阈值和比该第一阈值高的第二阈值进行比较；所述判断步骤根据与第一阈值和第二阈值的比较结果判断所述淋巴结为癌转移阴性、癌转移弱阳性还是癌转移强阳性。10.根据权利要求9所述的方法，其中还包括根据与第一阈值和第二阈值的比较结果输出表示所述淋巴结为癌转移阴性、癌转移弱阳性还是癌转移强阳性的信息的步骤。11.根据权利要求IO所述的方法，其中所述输出步骤在所述判断结果为癌转移弱阳性时输出表示转移灶为微转移的信息。12.根据权利要求IO所述的方法，其中所述输出步骤在所述判断结果为癌转移强阳性时输出表示转移灶为大转移的信息。13.根据权利要求9所述的方法，其中所述第二阈值设定为2000~20000拷贝数/iaL'Lysate。14.一种癌转移判断装置，包括定量系统，定量从疑有癌细胞转移的淋巴结制备的检测试样中的肿瘤标志物mRNA;比较系统，将所述mRNA的定量结果与第一阈值进行比较；以及判断系统，根据比较结果判断所述淋巴结为癌转移阴性还是癌转移阳性。15.根据权利要求14所述的装置，其中还包括显示系统，该显示系统根据判断结果输出表示所述淋巴结为癌转移阴性还是癌转移阳性的信息。16.根据权利要求15所述的装置，其中所述显示系统当所述判断结果为癌转移阳性时还输出转移灶大小。17.根据权利要求14所述的装置，其中所述比较系统将所述mRNA的定量结果与第一阈值和比第一阈值高的第二阈值进行比较，所述判断系统根据所述与第一阈值和第二阈值的比较结果判断所述淋巴结为癌转移阴性、癌转移弱阳性还是癌转移强阳性。18.根据权利要求17所述的装置，其中还包括显示系统，它根据所述判断结果，输出表示所述淋巴结为癌转移阴性、癌转移弱阳性还是癌转移强阳性的信息。19.根据权利要求18所述的装置，其中所述显示系统当所述判断结果为癌转移弱阳性时，还输出表示转移灶为微转移的信息。20.根据权利要求18所述的装置，其中所述显示系统当所述判断结果为癌转移强阳性时，还输出表示转移灶为大转移的信息。全文摘要本发明提供一种能够客观地判断淋巴结有多少癌细胞转移的方法，即转移灶大小的判断方法，其包括以下步骤定量从疑有癌细胞转移的淋巴结制备的检测试样中的肿瘤标志物mRNA；以及根据所述mRNA的定量结果求所述淋巴结中转移灶大小。本发明进一步提供一种癌转移判断装置，包括定量系统，定量从疑有癌细胞转移的淋巴结制备的检测试样中的肿瘤标志物mRNA；比较系统，将所述mRNA的定量结果与第一阈值进行比较；以及判断系统，根据比较结果判断所述淋巴结为癌转移阴性还是癌转移阳性。文档编号G01N33/48GK101101288SQ200710127578公开日2008年1月9日申请日期2007年7月3日优先权日2006年7月3日发明者中林一树,大东元就,大友泰裕申请人:希森美康株式会社