专利名称：血管发生的快速体内模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于研究生理现象及测定为调控生理现象而设计的药物和 方案的有效性的模型系统。具体而言，本发明关注一种动物模型，它可用来 评估血管发生(angiogenesis)及评估各种药物对其发展的影响。
背景技术：
血管发生、血流、血管内肿瘤细胞运输、和外渗(extravasation)是肿瘤生 长、进展和转移中的关键步骤，因此全世界的药物发现研究项目也以它们为 耙标。抗血管发生性物质的发现和评估以前依赖于体内方法，诸如绒毛膜尿 囊膜测定法、猴虹膜新血管形成(neovascularization)模型、盘式(disc)血管发 生测定法、和各种使用角膜来评估血管生长的模型。这些模型在了解血管生 长及其抑制的机制中发挥了重要作用。
在我们的实验室中开发了一种新的用于将人肿瘤血管发生成像的转基 因棵鼠。干细胞标志物巢蛋白(nestin)在新生血管中表达，而在此转基因小鼠 中，巢蛋白的一种调节元件驱动绿色荧光蛋白(NDGFP)，使得新生血管能够 通过它们的GFP表达来可视化。许多表达红色荧光蛋白(RFP)的人和啮齿动物 癌细胞系被植入ND-GFP棵鼠(nude mouce)中并广泛生长。ND-GFP在正在增殖的内皮细胞中高度表达。通过双色荧光成像来可视化正在生长的肿瘤中的
新生血管。Amoh, Y.等，Cancer Res. (2005) 65:5352-5357。多柔比星 (doxorubicin)已被证明可抑制移植有B16F10-RFP鼠黑素瘤的ND-GFP小鼠中 的新生肿瘤血管发生及肿瘤生长。Amoh, Y.等，(见上文)2337-2343。
另外，通过双色成像可视化了正位移植有表达RFP的MIA PaCa-2人胰腺 癌的ND-GFP转基因棵鼠中的初级(primary)胂瘤血管发生。吉西他滨 (Gemcitabine)显著降低了肿瘤中的平均新生血管密度且降低了肿瘤体积。这 些结果首次证明了吉西他滨在胰腺癌中不但是肿瘤生长的抑制剂，还是血管 发生的抑制剂。Amoh， Y.等，J. Surg. Res. (2006) 132:164-169。在进一步的工 作中，通过双色焚光成像可视化了ND-GFP转基因棵鼠中XPA-1-RFP人胰腺 癌的肝转移的血管发生。ND-GFP在正在增殖的内皮细^^和正在生长的肝转 移的新生血管中高度表达。通过ND-GFP表达容易地定量了肝转移中的新生 血管密度。吉西他滨显著降低了肝转移中的平均新生血管密度。Amoh,Y.等, Anticancer Res.(印刷中)。
2005年5月12日公布的PCT公开文本WO 2005/042715 (通过提述并入本 申请)也记载了关于可用于观察新血管形成的转基因动物的说明，其中荧光 蛋白在巢蛋白衍生的控制序列的控制下表达。
发明公开
本发明提供了上文所述血管发生检测系统的改进。在这种方法中，可以 不依赖于肿瘤移植来测量血管发生，这通过在转基因动物中皮下植入的药物 投递基质中提供激励新血管形成的适宜生长因子来实现，所述转基因动物在 源自巢蛋白的控制序列的控制下生成荧光蛋白。然后可以通过荧光显微术直 接观察所述生长基质植入物中新血管的存在。可以在同 一动物中植入缺乏生 长因子的对照基质，并且也可以观察各种药物和方案对新血管形成的影响。
本发明与血管发生的肿瘤模型相比是有优势的，因为宿主动物不必是免 疫缺损的(immunocompromised)。由于不需要导入异种生物材料(除了荧光 蛋白本身)，可以使用有免疫活性的(immunocompetent)的受试者。通过适当 选择基质，可以采用不引发免疫应答的基质。
如此， 一方面，本发明涉及用于观察转基因动物中的新血管形成的方法， 该方法包括通过荧光显微术直接观察所述动物中由植入皮下层(subcutis)中的生长 基质中荧光标记的细胞所形成的荧光标记的新生血管的存在、不存在或量；
其中所述荧光是由所述细胞中表达的荧光蛋白生成的。
在一个实施方案中，所述荧光蛋白的表达受到巢蛋白控制元件的控制。 新血管形成的量可以通过测量新生血管的长度来定量。典型地，采用包含生 长因子的生长基质，以及植入同 一动物中用于比较的对照药物投递基质。
另一方面，本发明涉及血管发生的转基因动物模型，该动物模型经修饰 而在新生血管形成细胞中表达荧光蛋白，且其中所述动物模型进一步包含植 入皮下层中 一个或多个基质，其中至少 一个基质包含至少一种激励血管发生 的生长因子。在一个实施方案中，所述荧光蛋白的表达处于源自巢蛋白的控 制元件的控制之下。
另一方面，本发明涉及鉴定调控血管发生的药物或方案的方法，其中该 方法包括将所述药物或方案施用于上文所述动物模型，观察当存在所述药物 或方案时，与该药物或方案不存在时相比，所述药物或方案对血管发生的存 在、不存在或量的影响，由此鉴定调控血管发生的药物或方案。
附图
简述
图l示意性显示了整个过程的一个例子。如该图第一部分所示，将 Gelfoam⑧移植到小鼠的体侧皮下层中，其中该小鼠已过修饰而包含处于巢蛋 白第二内含子增强子控制下的绿色荧光蛋白核苷酸序列(ND-GFP转基因小 鼠)。该移植后7天，创建皮瓣(skinflap)，该皮瓣含有已与先前存在的血管汇 合(merge)的Gelfoam 。通过焚光显微术直接测量皮瓣中的Gelfoam⑧。
图2显示了在各种条件下观察到的血管发生的比较。图2a显示了当 Gelfoam⑧含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)时，植入的Gelfoam 中的血 管发生。图2b显示了不含bFGF的对照Gelfoam⑧中血管发生的缺失。图2c显 示了多柔比星对含有bFGF的Gelfoam⑧中的血管发生的影响。图2d是另一种 对照，其显示了不含bFGF且用多柔比星处理的对照中血管发生的缺失。
图3显示了冷冻的、血管化的Gelfoam⑧的组织化学切片中的荧光与内皮 细胞标志物CD31的相关性。图3a显示了通过荧光测定的血管分布，而图3b 显示了CD31的分布。
图4显示了给小鼠植入含有各种成分的Gelfoam⑧后7天平均新生血管长度(单位为mm/mm2)的比较(对小鼠施用或不施用多柔比星)。本发明的最佳实施方式本发明为测量任何药物或方案对新血管系统(neovasculature)形成的影响 提供了便利且高效的模型。本文所述模型不依赖于与肿瘤形成和生长并发的 血管发生，本文所述模型单纯地(cleanly)在人工基质中诱导血管发生，如此 可以测定药物或方案对血管发生的特异性影响，并可以鉴定成功的方案和药 物。所述模型可以是、但并非必须是免疫缺损的。它是这样的转基因动物， 在负责新生血管形成的内皮细胞中生成荧光蛋白。在这些细胞中的表达是通 过将编码荧光蛋白的核苷酸序列置于组织选择性启动子或其它组织选择性 控制序列的控制下来实现的。在本发明中特别有用的是源自巢蛋白的控制序 列，但是也可以使用内皮或其它血管形成细胞的其它控制序列。然后转基因 动物会在适宜的血管形成细胞中选择性生成荧光蛋白。然而，特异性不必是 完全的，因为新生血管会生长成不提供背景"噪音，，的中性基质。所述动物模型是对此目的有用的任何物种，典型的是哺乳动物，诸如啮 齿动物诸如大鼠或小鼠、家兔、灵长动物、或其它合适的受试者。新血管系统将在激励下侵入合成基质，诸如Gelfoam⑧(Upjohn)。本文中 列举Gelfoam⑧为例来进行说明，但是也可以使用其它基质，诸如MatrigelTM (BD Biosciences).基质仅须足够多孔以支持新血管形成，而且有足够保持力 (retentive),以能够在皮下层中局部地供应生长因子。各种基质在本发明中是 有用的。所述基质既充当新血管系统的支架，又充当已知激励血管发生的生 长因子的来源。典型地，会在动物模型中植入含有生长因子的基质及不含所 述生长因子的对照基质二者。在对照基质中，通常几乎观察不到新血管系统。 要植入的基质块的尺寸取决于动物模型的性质。例如，对于小鼠，可以使用 边长2-6mm的片。对于大型动物，则采用更大的片。片的厚度在l-3mm左右。 所述片应当是这样的尺寸(dimension),使得它可以被包括在皮瓣中。合适的生长因子包4舌血管生成素(angiogenin)、 angiopoietin 1 、 Del 1 、成 纤维细胞生长因子(酸性的(aFGF)和碱性的(bFGF))、卵泡抑素(follistatin)、 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HPGF)或散射因子(scatter factor, SF)、白介素-8、瘦蛋白(leptin)、胎盘生长因子、血小板衍生的内皮生 长因子(PDEGF)、血小板衍生的生长因子BB (PDGF-BB)、多效营养因子(pleiotropin, PTN)、增殖素(proliferin)、转化生长因子-a (TGF-a)或-卩(TGF-卩)、 肿瘤坏死因子-a (TNF-a)、血管内皮生长因子(VEGF)、和前孩i粒体蛋白 (progranulin)。有些实施方案特别地使用酸性或碱性FGF、 VEGF、和PDEGF。
关于标记内皮细胞，可以使用具有足够辉度(brilliance)的任何荧光蛋白。 本文中例示了绿色荧光蛋白，但是也可以采用其它颜色的荧光，包括红色、 黄色和蓝色。在必要时，还可以修饰焚光蛋白以使其与宿主相容。
在一个典型的实验中，在动物的一侧皮下植入一小片经生长因子处理的 生长基质，而在另一侧植入另一片不含生长因子的基质。合适长度的时间段 后，典型的是几天，但是在一个典型的实施方案中可以在4小时与2周之间任 意选择，暴露包含基质的皮瓣，并使用荧光显微镜进行评估。新血管系统作 为荧光是直接可见的。
然后可以通过对施用方案的动物中所观察到的血管发生与类似构建但 未经处理的动物进行比较，来评估药物或方案的影响。可以以这种方式评估 施用药物或提供方案的任何合适方法。
许多以前的血管发生模型是胂瘤模型，它们要求肿瘤的宿主对于肿瘤是 严重免疫缺损的或同基因的。因为合成的生长基质不引发免疫应答，而荧光 蛋白或者不引发此类应答，或者可以经修饰而成为免疫透明的 (immunotransparent),所以在使用本发明的模型时不要求这些限制条件。这 能够实现更现时的结果和更便利的分析。虽然下文实施例中使用了棵鼠，但 是在所述测定法中并非必须使用免疫缺损的动物。
"合成基质"意指自单体或其它成分从新合成的基质，或者是从活体系 统(但不是肿瘤)分离的基质。如此，例如，例示的Gdfoam源自猪明胶。
提供以下实施例来例示而非限制本发明。
实施例l:多柔比星对血管发生的影响
使用在内皮细胞中生成绿色荧光蛋白(GFP)的转基因C57/B6棵鼠。用三 溴乙醇麻醉这些转基因小鼠(6-8周龄)。将Gelfoam⑧(Pharmacia & Upjohn company, Kalamazoo, MI)块(5 x 5 mm)用75pl RPMI 1640培养基(Cellgro， Herndon， VA)中的300ng石咸性成纤维细胞生长因子(bFGF) (Chemicon, Temecula， CA)处理，或者不处理。将Gelfoam⑧块移植到转基因小鼠两边体 侧皮下层中， 一侧植入一块经过处理的Gelfoam⑧块，另一侧植入一块未经处理的Gelfoam⑧块。在移植Gdfoam⑧后第0、 1、和2天，给一组小鼠每天一次 ip注射5pg/g多柔比星，而另一组给予0.9% NaCl溶液(溶媒对照)。第7天在 麻醉下制作皮瓣。通过体内焚光显微成像来测量皮瓣中发焚光的新生血管的 长度，由此对血管发生定量。
使用配备有汞灯和50W电源的Leica LZ12型荧光立体显樣H竟。通过 D425/60带通滤光片和470 DCXR双色镜产生GFP的选择性激发。在 Hamamatsu C5810 3芯片冷色电荷耦合器件相机(Hamamatsu Photonics, Bridgewater， NJ)上穿过长通(long-pass)滤光片(GG475; Chroma Technology, Brattleboro, VT)收集所发射的焚光。使用IMAGE PRO PLUS 3.1软件(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)对图像进行反差和亮度加工并进行分析。在 IBM PC上直接捕获1024 x 724像素的高分辨率图像，或者通过高分辨率Sony VCR (SLVR1000型；Sony, Tokyo)上的视频输出来连续地捕获该图像。
使用抗大鼠免疫球蛋白辣根过氧化物酶检测试剂盒(BD Pharmingen， San Diego, CA)遵循制造商的说明书检测血管化的Gelfoam⑧的冷冻切片中发 焚光的新血管系统和CD31的共定位。 一抗是抗CD31单抗(1:50; Chemicon， Temecula, CA)。抗原染色使用底物-色原体3,3'-二氨基联苯胺染色。
实验数据表述成均值士SD。统计学分析使用双尾Student氏t检验来进行。
图2显示了结果的比较。图2a-2d中的短线代表50(Him的长度。如图2a所 示，在给予对照(0.9。/。NaCl)溶液的小鼠中，在含bFGF的Gelfoam⑧小块中形 成了大的新血管系统复合体。即使在这些小鼠中，在不含bFGF的Gelfoam⑧ 中没有观察到显著的新血管系统(图2b)。如图2c所示，施用多柔比星的小鼠 在经bFGF处理的泡沫体中显示出大大减少的新血管系统，而在不含bFGF的 泡沫体中观察不到血管发生。
图4是图2所示结果的图示。在施用作为对照的氯化钠的小鼠中，在含 bFGF的Gelfoam⑧小块中的平均新生血管长度(单位为mm/mm2)几乎为6， 而且这些小鼠中即使在未经如此处理的Gelfoam⑧中也表现出一些血管发生 的存在。在施用多柔比星的小鼠中，经bFGF处理的Gelfoam⑧中的血管发生 的程度降低到低于用氯化钠处理的小鼠中的未经处理的Gelfoam⑧。
图3显示了发焚光的血管与CD31 (—种内皮细胞标志物)表达之间的相 关性。在图3中，短线代表100nm。在第7天由经bFGF处理的Gelfoam⑧制成 冷冻切片。图3a显示了通过荧光测定的新血管分布，图3b显示了CD31分布。血管的分布与CD31的分布实际上是同样的,
权利要求
1. 一种血管发生转基因动物模型，该模型包含经修饰而在新生血管形成细胞中表达荧光蛋白的动物且进一步包含在皮下层中植入的一个或多个生长基质单元。
2.权利要求l的动物模型，其中所述荧光蛋白是由编码核苷酸序列在源自 巢蛋白的控制序列的控制下生成的。
3.权利要求l的动物模型，其中至少一个所述生长基质单元含有血管发生 的生长因子。
4.权利要求3的动物模型，该模型进一步包含至少一个未经生长因子处理 的生长基质单元。
5.权利要求3的动物模型，其中所述生长因子是VEGF或bFGF。
6.权利要求1的动物模型，其中所述生长基质单元包含在皮瓣中。
7. 权利要求1的动物模型，其中所述生长基质单元是胶原凝胶。
8. 一种鉴定调控血管发生的药物或方案的方法，该方法包括将所述药物或 方案施用于权利要求3的动物模型，比较未施用所述药物或方案的对照 动物模型中的血管发生程度。
9.一种观察转基因动物中的新血管形成的方法，该方法包括通过荧光显微所形成的荧光标记的新生血管的存在、不存在或量， 其中所述荧光是由所述细胞中表达的荧光蛋白生成的；且 其中所述生长基质包含血管发生的生长因子。
10.权利要求9的方法，其中通过测量所述新生血管的长度来对新血管形成 定量。
11.权利要求9的方法，其中所述荧光蛋白的生成受到源自巢蛋白的控制元 件的控制。
12.权利要求9的方法，其中所述生长基质是胶原凝胶。
13.权利要求9的方法，该方法进一步包括比较包含生长因子的所述生长基质中的新生血管量与不含生长因子的对照生长基质中观察到的新生血
14.权利要求9的方法，其中所述观察是通过荧光显微术进行的
15.权利要求14的方法，其中所述生长基质包含在皮瓣中。
全文摘要
本发明描述了血管发生的动物模型。新生血管被包含生长因子的生长基质所支持。新生血管被在形成这些血管的细胞中选择性表达的荧光蛋白所标记。
文档编号G01N33/00GK101523205SQ200780036277
公开日2009年9月2日 申请日期2007年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者天羽康之 申请人:抗癌公司