确定含有粒子的样本的特征性质的方法

专利名称：：确定含有粒子的样本的特征性质的方法
技术领域：
：本发明涉及一种确定含有至少一个物种的粒子的样本的特征性质的方法，该粒子在固定的连续的时间间隔内在观察容量中发射、散射和/或折射光子。另外，本发明还延伸到对不同的时间间隔确定含有粒子的样本的特征性质。
背景技术：
：上述方法是才艮才居荧光涨落i脊方法(FluorescenceFluctuationSpectroscopy,FFS)[参见LMandel:Fluctuationsofphotonbeamsandtheircoirelations，/Voc..72，pages1037-1048，(1958)],它被建立为在广泛的应用领域、特别是在生物物理学和生物化学领域的标准方法。4皮研发以应用在高压过程筛选(High-throughputScreening)和在线分析方面的理论和实现是从WO98/16814和PeetKask，KaupoPalo,DirkUllmann，andKarstenGall:Fluorescence-intensitydistributionanalysisanditsapplicationinbiomoleculardetectiontechnology,尸nTVff,/.5W.96，pages13765-13761，(1999)而获知的荧光强度分布分析(FIDA)。在单个分子实验中，情况如下从小观察容量V中的分子发射的光子击中光子检测器。离散的时间点ti(i-0，l，2…)将观察时间分成等距离的时间间隔Atj=[tN1，ti)(i二1，2，3，…N)。在时间间隔Atj中计数的光子的数目呈数列(EU，n2，n3，...}。一次完整的测量给出有限数目的计数率ih,n2，...，nN。在其中有n个光子被计数的时间间隔(^k)的数目给出了光子计数分布(弁k(n))。。将序列弁k(n)中的每个元素除以间隔的总数S给出了一实数它至少在"大量"测量的时间间隔的极限的情况下可被解释为在时间间隔At内测量到n光子的概率。相应的物理概率分布由定义。为简单起见，我们假设所有的光子都是由感兴趣的分子产生而忽略例如由检测器硬件或散射光产生的背景噪声。合并的背景噪声是直接的，它对p(n)的影响以后将被讨论。在FFS中确定样品的特征性质的方法包括两个基本步骤1)将在观察时间r=f>ti的连续时间间隔Atj-[t"，ti)(i=1,2，3，...N)内登记的光子事件的数目ni(计数率)进行登记和计数，2)确定在预定时间间隔At内的光子事件数目n的分布函数p(n)，和3)以这种方式确定感兴趣的一个或数个性质，在该方法中给定的理论模型以最优符合(下文成为"拟合")说明测量结果p(n)。可以从p(n)提取的典型的性质包括1.在纯溶液中的分子的浓度2.在混合物中的分子的浓度3.分子间结合过程的动力学4.分子间离解过程的动力学速率5.分子内保形变化的动力学速率6.分子的扩散率7.分子亮度8.光学装配(设置，setup)的空间亮度函数9.分子特有的单态活期10.检测器的后脉冲(after-pulse)率在FIDA中，理论的光子计数分布p(n)通过生成函数^计算。G(g)表示为对依赖于所谓空间亮度函数Bf)的函数的空间积分的指数。空间亮度函数是光学设备的激发光强度和荧光传输系数的积，作为在样本中的粒子的坐标的标准化(归一化，normalized)函数。应用B(。的简单模型来特征化光学设备，由单个物种的实验确定B(。的调整参数。未知的样本参数、浓度c和特定亮度值q由非线性拟合法或由规则化逆变换来确定。FIDA的缺点是1.生成函数的方法使理论模型很不直观，并且将方法延伸到更复杂的应用中是困难的。2.模型在未知参数c和q方面是高度非线性的，确定这些参数是复杂的。3.每个分子的亮度被表示为对所有物种都是共同的空间亮度函数和对每一个物种具有一个特征值的特定亮度的积。因为对不同物种三重态种群差别极大，所以在所有的测量中，在某种程度上违反了这个假设。4.假i殳分子的坐标在计数时间间隔(区间宽度，binwidth)期间不变。即使是对在几微秒的范围内的非常短的时间间隔，这也只是粗略的近似。而且，p(n)对分子的扩散运动的依赖(相依性，dependence)带有不能从模型提取的有用信息。通过在FIDA中引入半经验校正因子，建立了所谓的荧光强度多分布分析(FIMDA)来同时确定扩散时间和分子亮度[参见KaopoPalo,tjloMets，StefanJSger，PeetKask,andKarstenGall:Fluorescenceintensitymultipledistributionanalysis:Concurrentdeterminationofdiffusiontimesandmolecularbrightness,5/<7/;/rj^/c"//79，pages2858-2866,(2000)。与FIDA相比，通过主方程直接计算光子计数分布显示出显著改进的拟合质量。然而，这种数值仿真是非常慢的，并且不适合于高生产率应用[参见KaopoPalo，tloMets，VelioLoorits，andPeetKask:Calculationofphotoncountnumberdistributionsviamasterequatons，必/0/7/^5ic"//90，pages2179-2191,(2006)。替代FIDA及其后继者的方法是基于光子计数区间PCH算法[参见YanCheng,D.MttllerJoachi，PeterT.C.So,andEnricoGratton:Thephotoncountinghistograminfluorescencefluctuationspectroscopic,必/o/i/f戸.cfl//.77，pages553-557，(1999)，YanCheng:y4冊/"/s1flwflfa/p//cff,/ows"/7woresce"ce//w"w^Vws/;ec的sco/^.博士论文，UniversityofIllinoisatUrbana-Champain，Urbana，Illinois,(1999)，可在http:〃www.lfd.uiuc.edu/staff/gratton得到，ThomasD.Perroud，BoHuang,andRichardN.Zare:Effectonbintimeonthephotoncountinghistogramforone-photonexcitation,C&附尸一C^附6，pages905，912，(2005)，Y.Cheng,M.Tekmen，L.Hillesheim，J.Skinner,B.Wu，andJ.Mtiller:Dual-colorphotoncountinghistogram,/88,pages2177-2192，(2005)]。这些方法仅在技术细节上有别于FIDA,并且为空间激光亮度分布假设不同的形状。PCH方法对商业应用起次要作用。在PCH方法中检测容量必须相当任意地选择。像起作用的分子的平均数目和单个分子的光子概率分布这样的性质变成抽象性质，而没有任何物理意义。本发明的目的在于提供改进的理论平台来先验预测光子计数区间。本发明的另一目的在于给FFS提供更深刻的物理洞察力和使PCH方法直观地延伸到复杂的实验任务中。具体实施例方式本发明的上述目的由具有权利要求1的特征的方法解决。有效容量Veff不容易由光学装配描述，还取决于要考虑的粒子物种的性质。当且仅当粒子对计数率起作用时，粒子才被定义为在某一特定时间间隔期间在容量"内"。对位于任何空间位置的粒子，对计数率起作用的概率不为零。因此，有效容量Veff不能由物理空间边界确定。不管怎样，"进入"和"离开"这个容量的过程是一个随机过程，类似于进出一个小的物理容量的扩散过程。可以注意到，像受激发射损耗(STED)[参见LarsKastrup,HansBlom，ChristianEggeling，andStefanW.Hell:Fluorescencefluctuationspectroscopyinsubdiffractionfocalvolume,i^".及ev.le汰94,(2005)的技术能够大大减少有效容量。根据定义，有效容量内的"单个粒子，，不能产生任何零计数率。因此，术语有效容量内的"单个粒子，，与在任何空间容量有"单个粒子，，在概念上有很大的不同。通过只考虑非零计数率，在物理上可以在理想实验(Gedankenexperiment)中测量概率分布P^n)。在时间间隔Ati期间所有的光子事件只源自一个单个的粒子。源自几个粒子的信号的叠加必须,皮忽纟见掉。根据本发明，对给定的实验装配，用两个量有效容量Veff和单个粒子分布Pi(n)来将例如分子物种的粒子物种特征化。如上文所讨论的，这两个量有明确的物理意义。可以利用其独特的性质P"n-0"0来将单个粒子分布Pi(n)与FIDA方法和PCH方法中的同名的单个粒子分布区分开来。可以利用Veff和P"n)的知识来快速和稳健地确定包括一个或几个物种(混合物)的分子的样本中的分子浓度。该方法对限制诸如FIDA、FIMDA或PCH算法等所有现有方法的例如后脉冲、分子扩散或单态激发等干扰效果是稳健抗干扰的。根据本发明的方法不仅限于如FIDA或PCH算法的短区间宽度。它适用于任分子何环境，例如流、微结构、细胞、囊、乳胶或凝胶(到现在为止尚未实验验证)。根据本发明的方法比所有的现有方法更简单。从技术上讲，它可以与例如非线性拟合、生成函数或矩方法(矩量方法，methodofmoment)的标准拟合方法结合。根据技术实现，这是一个适于在线诊断的非常快速的方法。在FIDA中，一种分子用由实数值所给的特定分子亮度特征化。根据本发明，一种分子由Veff和P"n)完全特征化。就它们包含如扩散率或单态激发概率的与实验装配有关的所有信息的意义上说，性质Veff和P"n)是丰富的。原则上，对例如分子的粒子特征化的所有的信息都可以从Veff和P"n)提取。但是，要获得此信息，必须应用具体的理论模型。就它们对单个粒子的性质特征化、在任何实验中没有因几个粒子同时作用而存在平均过程的意义上说，性质Vw和P"n)是单纯的。在本发明的优选实施例中，基于马尔可夫过程理论的单个粒子分布函数P"n)由给出，其中^(11=0):=0，其中ft(O表示粒子的亮度函数，其由在位置尸的单个粒子的光子事件的平均值和泊松分布Poi(n，ji)=exp(卞)n7n！定义。因为空间上不同的激光强度和光学装配的光子收集性质，所以，给定区间宽度Ati的光子计数率ni强烈依赖于所有分子相对于激光焦点的位置。在激光焦点附近的分子对光子计数率产生大的作用，而远离激光焦点的分子产生小或零的作用。单个分子的作用可以通过将其固定在表面(如玻璃表面)上或矩阵(如凝胶)中的指定的位置F来测量。该装配所记录的光子计数Hi的序列给出了概率分布p(n)。这样测量的光子计数的平均值〈"〉-"^n)被称为在位置F的分子亮度H。分子亮度KO的测量可对任何位置f进行，H(。的函数形式可以通过对分子的各个位置重复这一过程，例如通过对等距空间网格上的所有位置测量n并在网格点之间插值，进行测量。由于分子亮度函数n(。的测量费时昂贵，所以通常是用基于分子荧光光谱理论的模型和空间激光光照强度的给定模型近似。在此背景下，分子的亮度nO取决于例如区间宽度At、空间分布和在激发波长(X)的光强度、光学装配的收集效率函数、检测器(q)的量子效率、横截面((T)和给定类型的分子的荧光量子产率(q)f)的参数。诸如三重态激发和检测器的后脉冲的参数也被证明发挥了重要作用。对任何从头开始预测实验光子计数分布，对分子亮度nf)的了解是必然的。在FIDA和PCH中，应用了n(0的理论模型。在这些模型中的自由参数通过在单个物种上试验来确定。如果假定分子亮度函数W。是由直接测量或理论模型的近似而已知的，那么，曼德尔(Mandd)的经典公式描述了从单个分子测量n个光子的概率P"n)[参见L.Mandel:Fluctuationsofphotonbeamsandtheircorrelations,/Vw.尸一.72，pages1037-1048,(1958)式中泊松分布Poi(n，n)=exp(-ji)nn/n!对分子的所有可能的位置求平均。p(。-IZV表示找到空间点F处粒子的恒定概率。不幸的是，上述方程y在无限大积分容量V的极限下产生了简单解P"n):^。n，这反映一个物理事实，即在无限大容量中的单个分子对应于零浓度，根本不能产生任何光子计数事件。一种普遍的做法是通过引入大而有限的容量来规避这一缺点，参见例如在YanCheng,JoachimD.Mtiller,PeterT.C.So,andEnricoGratton:Thephotoncountinghistograminfluorescencefluctuationspectroscopic,77，pages553-557,(1999)中的讨论。根据本发明，通过将有效容量Veff中的"单个分子，，的定义应用到曼德尔公式，PCH算法的上述问题是可以避免的，那么曼德尔公式变为其中Pi(n-O):=0。该公式建立了在P"n)、Vw和ji(F)之间的关系，这可用于确定这些特征性质中的一个或其它。此外，基于马尔可夫过程理论的泊松近似导致用于<111>和Veff的下面的公式。考虑到在真实的物理情况下的非零浓度c，对每一个计数率起作用的分子的平均数目<111>由〈w〉=]I卜尸o/("-0,/i(。)],给出，其中cdV表示在容量元dV中的分子数目，因子[1-Poi(n-0，15表示dV中的每个分子产生至少一个光子计数事件的概率。通过关系式Veff:=<m>/c，得到j[l一尸oi(n-0，;/(F))rf厂，上述公式分别建立了在<111>、H(。和C之间以及在Veff和fl(O之间的理论关系，这可用于确定这些特征性质中的一个或其它。在大多数FFS的应用中，同一物种的粒子(分子)发荧光或荧光标记的，并且使用激光束来激发粒子。亮度函数H(O的最大值由分布函数的一次矩(一阶矩)来确定一v，0)-v,2(/;)-v,(力#鹏—o作为非线性拟合过程的替代过程的该矩方法的重要性将在下面进一步考虑。如果考虑到噪声作用〈H、。ise，亮度函数Jl(F)的最大值就通过具有参数aj和不同的亮度函数hf)(j=1，2，...，K)的不同的亮度函数的叠加y来建模。可替换地，亮度函数(j=1,2，…，K)可以通过具有参数aj和不同的亮度函数j=1,2,..，，K)的不同的亮度函数的叠加'来建模。每一个亮度函数(j-l，2，…，K)由给定数目的M个特征参数Hjk(k=l，2,...，M)来确定。用于亮度函数的一种常见的模型是空间高斯分布exp(-2r2/a2)'其中Jl隨是激光焦点中心中的分子的亮度，a表示激光束的腰参数。几个小组展示了以这种粗逼近来说明相当复杂的三维空间亮度函数的局限性，参见BoHuang,ZhomasD.Per削d,andRichardN.Zare，Photoncountinghistogram:One-photonexcitation,ChemPhysChem5，pages1323-1331，(2004)及其中的文献。适合做几处说明来证实作为说明性的例子的这一选择。首先，本发明我们的方法可以适用于任何空间亮度函数。其次，高斯函数近似通常易于处理，已经证明，高斯函数的缩并收敛到任何可积的空间函数[参见BrunoKlahnandWernerA.Bingel:TheconvergenceoftheRaleigh-RitzMethodinQuantumChemistry,77reor".^4""44，pages9-43，(1977)。这是它们已被广泛应用于现代量子化学研究几十年的原因之一。分别将高斯分布插入有效容量的定义和单个分子函数，坐标r—n的转换和在旋转对称上的积分得到和其中，和可以应用数值Romberg积分来计算函数F和Q。说明的是，Q只对n^l是有限的，对n-0发散。对高斯型nf)，有效容量Veff变得与FCS中的相应的检测容量相同，对F(〃咖)-^，^"2"3,即，对Pmax的一些值，P!(ll)可以以对于Hm^数值稳定和快速的方式计算并具有确定的物理意义。一个更精确的亮度函数H(F)的建模通过具有参数^和fij2(j-l，2，."，K)的高斯分布的叠加来执行特征参数fijk(j=l，2，...，K;k=l，2，...，M)由标准去巻积方法来确定。特征参数nJk(j=l,2，...，K;k=l，2，…，M)也可以由迭代理查森-露西(Richardson-Lucy)去巻积算法来确定。上述的单个分子函数P"Il)和Veff的理论运算是基于经典曼德尔公式的。但是，这个公式具有一定的局限性。光子计数率的分布可能偏离泊木〉分布Poi(n，n())，因为在时间间隔AT期间光子的产率(productionrate)可能会改变。一些影响可能会导致这种光子的产率的改变。在时间点t处于位置F的单个分子可能运动，该分子可能会在时间间隔At期间访问其它地点。由于空间激光强度改变，所以扩散过程例如可能会导致重大的非固定的光子产率和曼德尔公式的无效。在这些情况下，曼德尔公式中的泊松分布必须替换为更广泛的分布p(n，F)，对n>0，/U")=l/^Jp(",F)W以及P"n-0》=0。有效容量由给出。p(n，0是在时间点t。处于位置f的单个分子在时间间隔te[t。，t。+At)期间计数的光子事件数目的分布。分布p(n，？)的计算一般来说是一个理论性的任务。考虑到分子的扩散运动，分布p(n，F)可以正式写成=limJ化f[叱c(^-^"，A〃w)的形式，式中G表示扩散的Greens函数。G(;c，r):-1/[術P2在緩慢扩散D—0的极限情况下，通过lim/K",F)=尸o'("，MO)得到了经典的曼德尔公式。这个例子示出了上面介绍的单个粒子分布函数Pi(n)的概念可以很容易地延伸到复杂的测量状况。但应当指出，在理论考虑不可及的情况下，P"n)和Veff可由实验来确定。从单个粒子概率分布P"n)出发，如下得到了P"n)和测量的分布函数pO)之间的联系。在真实的物理情况下，平均数目<m>=cVeff的粒子同时对信号起作用。使用马尔可夫过程理论，给定浓度c的概率分布p(n，c)通过将所有m个粒子的作用相加而得到m0式中Pm(n)是指单个粒子概率分布PKn)的第m巻积以及P。(n)-5n。。可替换地，p(n，c)可通过递推公式计算/7("，c)=^"l>7U^("-''，c)其中p("=0，c)=exp#)忽略背景噪声，粒子的浓度完全由获得计数率为0的概率确定c=-lnCp("-0，c))/~如果考虑背景噪声，粒子的浓度c由得到计数率为0的概率和噪声作用来确定c=[-lnCp("-0，c))_〈"〉」粒子的平均数目<111>由得到计数率为0的概率来确定附〉-一l"(p("-0,c)).考虑到噪声作用，粒子的平均数目<111>由〈—--1"(/7("=0，C》-得到。单个粒子概率分布函数P"n)可以通过递推公式1来计算。19分布函数p(n，c)可能必须与泊松分布Poi(n，〈n、。iM)巻积以考虑额外的背景信号(例如硬件的随机噪声)&(",c,〈"〉J=(P(c)尸o'(〈"〉根据上述理论考虑，对给定的实验装配，使用浓度c、亮度函数H()、有效容量Veff和单个粒子分布PKn)将含有荧光粒子(如分子)的样本特征化。因为在大多数实验装配中的噪声作用<n>n。ise不能忽略，也必须考虑到噪声作用〈n、。ise。遵循在FIDA和PCH算法中说明的规范，可以通过例如Marquard-Levenberg算法或适于本任务的任4可其它数值标准拟合方法的非线性多参数拟合过程来确定这些参数。因此，亮度函数p(O必须由具有多个可调参数的分析函数来近似。的分析形式可被选为高斯函数(如上面的例子中)，几个高斯函数的缩并或任何其它适当形状的函数。所有的可调参数的n()以及浓度c和噪声作用〈n、。ise必须通过将理论模型与实测量的分布p(n)进行非线性拟合来确定。如上文所述，有效容量Veff和单个粒子分布P"n)直接来自于对n。的积分。非线性拟合过程的可替换的过程是矩方法，它采用预先计算的对可调参数p(F)、浓度c和噪声作用〈n、。ise的任何一组值所预期的矩的列表。由于这种列表可以对合适范围内的参数预先计算并储存，所以这是用于在线应用的可能的最快的过程。分布p(n)的矩由伸o定义。以ai，i-l，2，".，k表示要确定的k个参数。在参数aj的值的适当的范围内，可以计算出期望的矩Vi，i=l，2，...，l。对所有可能的组的参数值ai,i=l，2，...，k预计算第一阶1矩v产生了一个映射(a,,a2，…，at*)—(v，，v2，…，v,)离散参数值的网格减少了计算力度，并且不在这个网格上的参数值的期望的矩必须例如用样条外推来推断。将矩1的数目选得尽可能低，但足够高以保证上述映射是双射函数。该映射可以倒过来(v,,v2，…,v,)~>(a,，a2，.",。*)这为任何一组测量的矩pi，i=l，2，...，l给出了需要的参数，单个粒子的概率分布函数的矩通过递推公式计算。可以使用没有荧光粒子的样本的介质液体直接测量实验装配的噪声作用〈n、。ise。样本的介质液体可由具有相同或相似的(光)性质的液体取代。事先确定〈n、。ise，该参数可以在非线性拟合过程和矩方法中保持固定。这样，在这些过程中需要的参数的数目减少了一个。上述考虑关注单个物种的粒子样本。本发明还明确适用于含N个不同物种的粒子(粒子物种的混合物)的样本。在粒子物种混合物的情况下，每个物种的浓度的确定都是在多步过程中完成。首先，必须为混合物中存在的每一个物种s和给定的实验装配测量有效容量和单个粒子分布W)W。这通过上述过程中的一个来完成。根据确定的性质^和W)(")，期望的总分布p(n;d，C2，…，Cn)可以由单个物种的作用p(s)(n;cs)，s=1，2，...,N的巻积来表示p("(";c》0p(2)(";c2)"',)(";cw)尸o/("《"〉加Jnoisc《要确定的参数是浓度cs，s=1，2，…，N和噪声作用<11>。要求的参数能够通过使用将测量数据与理论模型的非线性拟合来确定。与上面说明的非线性拟合过程相同，可以应用标准数值技术。在某些情况下，生成函数法可能加快p(n;d，C2，…，CN)的计算。与非线性拟合可替换地，如上所述，可用矩方法确定参数。这一过程利用p(n;d，C2，.,.，CN)的矩能够表示为p，n;Cs)的积这样一个事实而在技术上被简化了，其中s-l，2，…，N。没有任何模型或分子亮度函数方面的知识而进行Vd和P"n)的测量是可能的。这些性质可能通过分析测量分布p(n，c)直接确定。由于测量分布是有噪声的数据，所以误差传播效应能够使用于提取P"n)的数值方法不稳定。出于这个原因，Pi(n)的整体表示是有利的。一个强大的方法是所谓的离散Galerkin逼近，其形式为其中ak是广义矩，Y(n，p，k)是具有可调参数p和k的加权函数，lk(n，p，X)是相应的多项式。参数p和X由P"n)的一次矩确定。这种误差控制的Galerkin预测是数值数学中研究透彻的方法，通常适用于高分子化学[参见P.DeuflhardandJ.Ackermann:AdaptiveDiscreteGalerkinMethodsforMacromolecularProcesses,inH.P.DikshitandCharlesA.Michelli,editors:AdvancesinComputationalMathematics,WorldScientificPublishingCo.，Inc.,(1993);J.AckermannandM.Wulkow:MACRON一AProgramPackageforMacromolecularReactionKinectics，Konrad-Zuse-Zentrum，PreprintSC-90-14,(1990),M.WulkowandJ.Ackermann:NumericalSimulationofMacromolecularKinetics-RecentDevelopments,TXZ-iMCM^rA^Vigi*"/*<V，M"c/vg""/,(1990);M.WulkowandJ.Ackermann:TheTreatmeantofMacromolecularProcesseswithChain-Length-DependentReactionCoefficients-AnExamplefromSootFormation,Konrad-Zuse-ZentrumBerlin,Preprint-91-18，(1991);U.BuddeandM.Wulkow:Computationofmolecularweightdistributionsforfreeradicalpolymerizationsystems,Chem.Ing.Sci.46，pages497-508，(1991)，M.Wulkow:NumericalTreatmentofCountableSystemsofOrdinaryDifferentialEquations,ThesisandTechnicalReport-90-8，Konrad-Zuse-ZentrumBerlin,(1990);M.Wulkow:AdaptiveTreatmentofPolyreactionsinWeightedSequenceSpaces,IMPACTComput.Sci.Engrg.4，pages152-193，(1992)。该逼过程)或与上面说明的矩方法相类似的矩方法从p(n，c)得到。在这方面一个有用的性质是生成n个光子的平均分子亮度，定义为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>，>n以有效光子产率的形式将空间亮度Jl(。特征化，通过与概率分布P^n)关联。通常情况下，对低计数率n，分子亮度线性增加，<n>n-n，在激发光焦点的中心的分子处于最大亮度时变为常数。这个性质使得单个分子信号明显区别于给出恒定分布，、=常数的随机噪声信号。在下面的三个实施例的基础上，本发明的上述和其它目的、方面和优势将得到更好的理解，其中在实施例中分析了聚苯乙烯微球面悬浮系列、染料若丹明(dyeRhodamine)6G稀释系列以及聚苯乙烯微球面和若丹明6G染料的混合物。使用现有技术的荧光光镨单元来收集实验数据，所述荧光光镨设备包括在50微瓦的强度下发射532nm激发光的光源、内置高灵敏度的光电倍增管及数字相关器。所使用的焚光光镨单元具有30纳秒的反应时间。用在接连的两次光子登记之间的计数时钟脉冲实现数据采集。根据这些收集到的数据，可以为不同的区间宽度At计算出数个光强度轨迹。样例1:微球面悬浮系列作为第一实施例，对一个荧光聚苯乙烯微球面悬浮系列进行了分析。图1示出了为含有摩尔浓度CM-1.9E-10Mol/L的聚苯乙烯樣t球面(滴)的样本记录达3.2秒的典型光照强度迹线。图2示出了自相关曲线(对100个图1所示的3.2秒迹线平均)。图3示出了区间宽度At=0.1毫秒的相应的光子计数分布p(n，c)。图4示出了各个样本的由荧光相关光镨(FCS)取得的分子的数目(虚线)以及由根据本发明的方法取得的分子的数目(实线)。作为参考，还示出了理论的下降斜度(未连的方块)。图1示出了为含有已知摩尔浓度CM-1.9E-10摩尔/L的0.014微米的滴的样本记录的典型光照强度迹线。区间时间已调整为l毫秒。强度峰值表示通过聚焦FCS容量的分子的转变。图2示出了相应的自相关曲线(对100个3.2秒环平均)。拟合导致了扩散时间t=1.74毫秒和在聚焦FCS容量中有n=0.1529个滴。对数个FCS测量求平均的扩散时间为t=1.9U0.33毫秒。该扩散时间确定了滴通过聚焦FCS容量所需的时间。根据制造商的信息，采用的荧光光镨设备具有VFCS-1飞升(fL)的FCS容量。图3示出了区间宽度At=0.1毫秒的相应的光子计数分布p(n，c)。概率p(n=0，c)=0.79976意味着图1中约80%的所有光子计数为零。使用纯净水的测量给出了背景噪声级〈n、。is^0.0230642。根据本发明，有效容量Veff中的分子的平均数目〈m〉由上式给出cVeff-〈m〉。-infp("/J-0,c"_<n>n0iSe=0,20038。并因此，根据本发明的有效容量Veff结果是在(CM-1.9E-10Mol/L，NA=6.022E23)Veff=<m>/(CMNa)-1.75fL量级的幅度上，因此，稍大于聚焦FCS的容量。可以注意到，通过減少(增加)区间宽度At或激发光强度，该值Veff可能下降(增大)，数据未示。通常，Veff取决于仪器参数以及分子参数。图4示出了各个样本的由标准FCS分析所得的分子的数目(虛线)。对每一样本执行两次测量；每一次测量分别以点(测量I)和星(测量II)所示。该系列的测量以预定的CM=2.44E-8Mol/L的初始溶液从步骤l开始。这一初始溶液用"混分法，，在12步骤中稀释。50nL的样本以50pL水稀释;所得的100nL—半被拿去测量，另一半作为样本的下一个"混分，，步骤的样本。理想的是，微球面滴的浓度在每一个稀释步骤下降两倍。在步骤13达到了微球面的最低浓度，导致CM=3E-12Mol/L。在图4的对数标度中，由标准FCS所得的滴的数目应该如未连接的方块那样线性下降。从这一理论行为的小的偏离可能源于在系列"混分，，步骤期间处理小容量中的不确定性。然而，4艮明显，用标准FCS进行的对同一样本的两次测量的结果相差在10%和50%之间。这种差别指示出确定数目的滴的相当大的统计误差以及类似的由FCS得到的浓度的不确定性。但是，更激烈的是在低浓度的FCS的表现。对低于CM=3.8E-10M的浓度，FCS方法无法确定正确的浓度，并给出错误的高值。FCS为在稀释步骤13中的样本给出了幅度高于两个数量级的过高的值。上述的FCS的这种表现众所周知，呈现了FCS方法特别是对低浓度的严重的限制。在下面将看到，相对于现有技术的FCS方法，本发明的方法产生了更精确地确定荧光粒子的数目。如上所示，根据本发明，荧光粒子的浓度即在Veff中粒子的数目〈m〉可由p(n-0,c)确定。可以注意到，p(n-O，c)能够在低浓度状态下以高的统计精度测量。分子的相应数目示于图4(实线)。本发明的方法已应用于与FCS方法使用的相同的采集数据记录中。因此，没有进行额外的测量来取得本发明的方法的这些结果。与FCS得出的值相比，<m>的统计变化要低得多(在对大约CM=5E-10Mol/L的浓度的1。/。和对最低的浓度CM=3E-12M的10%之间)。更重要的是，测量的浓度遵循正确的理论线性下降斜度，在低至CM=3E-12M的浓度时也未见检测极限。样例2:染料若丹明6G稀释系列对染料若丹明6G的稀释系列(与样例l相同的条件)，得到了类似的结果。在这里，FCS的检测极限由装置(apparus)的灵敏度确定，是在CM=3E-9MoI/L的量级。本发明证明使浓度的测量精度甚至比FCS的检测极限低2%，数据未示。对若丹明6G，对荧光光镨单元的给定装置参数，有效容量的值减少到Veff-0.2fL。为了提高荧光粒子产生的光子计数信号的统计意义，选择相当大区间宽度可能是有益的。与标准分析方法及其后继方法相比，本发明能够以极佳的简单性和精度检测非常低的浓度。样例3:滴(bead)和若丹明6G的混合物对于含有滴和染料若丹明6G(Rh6G)的混合物的样本的测量给出了有效容量中的粒子的平均数目<111>=2.2(实验条件如上)。该值与FCS2.35相似。但是，两参数FCS无法单独确定每个物种的浓度。根据本发明，滴和Rh6G的浓度可通过各种方法确定。一个办法是利用矩方法。对于滴和Rh6G，分别从在上面的样例1中说明的测量中计算出单个分子分布的一次矩Vi(p,eads))=1.55和Vl(p/脇))=1.06。因此，应用在测量的分布V！(pt。t)的一次矩和单个分子分布Vl(Pj的矩之间的关系可以注意到，值W(p/bea叫)和^(p/Rh6^)将每一物种特征化，与其实际浓度无关。对混合物获得的单个分子信号的一次矩给出^(Pleads+Rh6G))=1.30,既不与滴的矩拟合也不与染料的矩拟合。为计算W(P,eads+Rh6G)),应用关系式(<m>(^*〉+<m>(効");)*i/JiV6^+助");)滴对混合物中的信号的作用部分可由关系式vW+麵))=;c*WC+(1-"*容易得到。我们得出<m>beads=x*<m>=0.95<m>Rh6G=(l-x)*<m>=1.25产生的浓度(以mol/L为单位)是cM(beads)=<m>bead3/(Veff(beads)*NA)1E_9Mol/LCM(Rh6G)=<m>to6G/(Vef￡(Rh6G>*NA)*1E-8Mol/L为这个样本的稀释系列测量的浓度再为两个物种生成正确的浓度下降，数据未示。确定比率X的替代方法是分别比较滴、Rh6G和混合物的单个分子分布^(n=l)的第一非零分量。应用关系式以从测量的Pt。t(n-l)得到单个分子分布P！(1)。利用x-[柳一+薩)-柳(薩)/[柳—)-柳(歸)〗确定比率x，得到值x-0.36±0.15。上述两种方法都能将混合物与纯溶液区分开来并确定混合物中的每个物种的浓度幅值的量级。上述方法和样例适用于确定含有粒子的样本的特征性质的固定的区间时间At。这些性质依赖于分子物种的光学物理属性，其可从为给定区间时间记录的光照强度迹线中提取。因此，区间宽度的选择对由上述方法所得的结果有影响。本发明延伸到作为At的函数确定合适或最优区间宽度和确定含有一个物种粒子或几个不同物种的混合物的样本的特征性质Eh.,.，Ei^的另一方法。能够利用方法对区间宽度At的依赖来通过例如其扩散时间的动态特性对分子物种进行特征化。一种测量扩散时间的标准方法是荧光相关光语(FCS)，它利用了光迹线的时间行为，但忽略了物种的不同的光学物理属性。因此，当不同亮度的分子物种存在于样本中时，FCS方法的应用变得困难[参见E.VanCraenenbroeck，G.Matthys，J.Beirlant，andY.Engelborghs:"Astatisticalanalysisoffluorescencecorrelationdata":JournalofFluorescence,9，pages325-331,1999。在以下文献中说明了区间时间对PCH方法的参数的影响，[ThomasD.Perroud，BoHuang,RicardN.Zare,"Effectofbintimeonthephotoncountinghistogramforone-photonexcitation",ChemPhysChem:6，pages卯5-912,(2005)和对FIDA的参数的影响[参见KaopoPalo，tloMets，StefanJ3ger，PeetKask，andKarstenGall:"Fluorescenceintensitymultipledistributionanalysis:Concurrentdeterminationofdiffusiontimesandmolecularbrightness",BiophysicalJ.79，pages2858-2866,(2000)。这些方法分别被称为时间依赖性光子计数多区间(PCMH)和荧光强度多分布分析(FIMDA)。PCMH和FIMDA已经被用来同时测量分子物种的扩散时间和分子亮度。已经示范了由混合物确定浓度和确定蛋白质-配体的相互作用的结合常数的FIMDA的应用。FIMDA的应用以及PCMH的应用有几个缺点。1.为每一个区间宽度确定分子亮度需要一个复杂、费时和数值上不稳定的非线性拟合过程。2.这两种方法都依赖于复杂的公式来说明模型参数对区间宽度的依赖。3.此外，这些公式是基于未保存的特设假设(adhocassumption)。根据本发明的另一方法涉及对一系列不同的时间宽度At确定含有根据本发明的上述第一种方法说明的粒子的样本的特征性质。对固定区间宽度确定的特征性质在这里理解为作为区间宽度At的函数。因此，本发明的另一方法包括如下步骤1)将在观察时间r-f△、的连续预定时间间隔Ati-[tw，tj)(i=,=11,...，N)内登记的光子事件的数目ni(计数率)进行登记和计数，其中At产At=常数，2)确定在预定时间间隔At内的光子事件数目n的分布函数p(n)，和3)执行根据本发明上述第一方法的其它步骤；还包括进一步的步骤4)使用不同的时间间隔Atk(k=lv..，K)重复步骤l)至3)K次，并且通过每一系列的这些步骤确定相同的特征性质Eb...，Eu5)确定特征性质Eh...，EL对Atk的依赖，和6)从根据步骤5)的测量的依赖来确定合适的或最优At或粒子的其它特性。可以利用作为区间时间At的函数的特征性质的知识来执行以下操作1.为上述的根据本发明的第一种方法的区间时间选择一个合适的或最优的值，2.特征化分子物种，3.通过将给定的分析函数与测量的依赖拟合来获得另一特征性质，4.识别混合物中分子物种并计算其浓度。时间间隔(区间宽度)At14(k=l，...，K)能够在10"秒和几秒之间选择。特征性质的一个例子是单个分子的有效亮度，对于小的区间宽度，有效亮度是高的，对于大的区间宽度，有效亮度下降(参见样例4)。亮度的下降源于可见分子远离激光焦点的扩散。因此，最高亮度和亮度的斜率特征化了分子物种。离散区间宽度可以选择为在对数标度上等距离，例如Atk-0.8秒，k-0，…，72。最高亮度Jlm^对区间宽度的依赖生成了实验的衰减函数，它是特定物种的分子的亮度和大小的特征。通过测量的依赖来计算这种函数可以高速(在几秒钟之内)执行。从原理上讲，能够对单个物种的粒子的所有性质确定这种对区间宽度At的依赖，其已经如上对根据本发明的第一种方法进行了说明。度At的测量依赖拟合。特征性质可以是要测量的样本中的分子的特定物种。进一步的特征性质可以是样本中的几个物种的分子的混合物中的部分浓度。k测量的依赖可以与已经测量的依赖或理论函数比较，以确定样本中的分子的特定物种或分子的部分浓度。根据已测量的依赖的叠加或理论函数通过非线性拟合将特征性质对区间宽度At的测量依赖引入，以确定样本中的粒子的特定物种或特定物种的粒子的部分浓度。在一个根据本发明的方法的特定应用中，测量了分布函数p(nk，Atk)(k=l，...，K)，并且通过适当的拟合过程，从p(n、At"来确定最大亮度函数H皿x(Atk)作为特征性质。上述方法还可进一步包括，通过适当的拟合函数，从Hmax(At)来确定时间极限At—0的nmax(At)、扩散运动、扩散时间td和/或装置的结构参数SP。作为进一步的步骤，从flmax(At)来确定衰减时间Tp和/或样本中特定物种的粒子的比例。在根据本发明的方法的另一样例中，可以测量有数个物种的粒子的样本，其中确定pmax(Atk),通过公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>由先前测量的或以其它方式确定的pmax，s(At)来确定样本中物种s的摩尔比例Xs。可替换地，通过将参数OSXSl)(s-l，...，S)与边界条件^Xs=l进行非线性拟合来确定样本中物种的摩尔比例Xs。在下面的另外的样例4和5中，例示了特征对区间宽度At值的依赖。示例4:特征性质的一个说明性的例子是由公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>计算的亮度值gmax，其中Vl(p)和v2(p)是测量的概率分布的一次矩和二次矩。在高亮度的情况下，即对vAp^xn、。ise，噪声作用〈n、。ise可以忽略。由上式计算的亮度值p隨是高斯分布ji():=ftmaxexp(-2r2/a2)的亮度函数fi(F)的最大值，但也是其它分布类型的特征亮度值。在ConSense检测系统(FIuITBiosystems，圣奥古斯丁(SanktAugustin)，德国，http:〃www.fluit-biosystems.de)中观'量了含有摩尔浓度C-56E-10M的染料ATT0532(ATTOTEC，希根，德国)的样本。记录了3分钟的荧光强度的光迹，并用虚拟实验室软件(FIuITBiosystems)分析。对从1秒到几微秒(1(T6秒)的范围内的各种区间时间，构建了概率分布p(n，c)。特别是，我们选择离散区间时间Atn=At00.8n秒，n=0，1，2，3，.."72，At0=ls。对于每个区间时间和相应的概率分布p(n，c)，通过p(n，c)的一次和二次矩计算亮度值nmax，见上面的公式。所得的Jlmax值取决于应用的区间时间，在图5绘出了对应于At的fimax。因此，特征性质Jlmax被理解为是At的函数，在下面以flmax(At)表示。最大亮度Hmax可以解释为激光焦点的中心的单个分子的亮度。通过扩散，位于中心的单个分子移离中心，并且其亮度(以每秒计数为单位，CPS)下降。因此，对长的区间时间At，测量的有效最大亮度Pmax(At)下降。对短的区间时间，有效最大亮度变大。物种的(有效)亮度值取决于区间宽度At。在图5中绘制的曲线可与具有参数P咖x(At-O)、^和SP的分析函数<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>拟合。参数fimax(At=0)、IV和SP分别指在极限短的区间时间时的最大亮度、衰減时间和光学装配的结构参数。拟合给出亮度值fi咖x(At=0)=15.1kcps，衰减时间^=0.731ms，和结构参数2。亮度值pmax(At=O)和衰减时间^是在给定光学装配中的分子物种的特征性质。亮度值ji皿(At-O)取决于分子的光学物理性质和最大局部激光光强度。衰减时间^与分子的扩散常数，即其水动力学半径和共焦检测容量成正比。为了说明光学装配的影响，对含有摩尔浓度3.0.1(T"M的染料ATTO的样本测量了两次。首先，使用直径为100nm的针孔来降低背景噪声，用ConSense检测系统记录3分钟样本的荧光光强度的光迹。在第二个装配中代之以测量30秒带有75nm直径的针孔的相同的样本。如上所述分析荧光光强度的两个光迹；在图6中示出了获得的两个装配的亮度函数。针孔直径的直径从100fiin减少到75pm也导致衰减时间1>从0.567毫秒下降到0.343毫秒。较小的针孔直径产生检测容量的较小的尺寸，并因此减小了衰减时间。样例5:为了辨别样本中的不同分子物种，可以利用特征性质对区间时间的依赖。在第一步，必须对探针中的所有可能的分子物种测量特征性质及其对区间时间的依赖。在图7和表1中描绘了一个典型的情况。已经为荧光染料测量了亮度函数H，x(At);如样例4中所示，已经用非线性拟合确定了参数Jl,x(At-0)和T"已经使用此染料标记了一种抗体。由于抗体要远远大于染料，所以对标记抗体测量的该衰减(fadeout)时间Tf255fis远远长于为纯染料测量的衰减时间Tp=33jis。标记的抗体以衰减时间和其较高的亮度值来区别于染料。最有可能是每个抗体分子由两个染料分子标记；这由抗体的高亮度值Jlmax(At-O)标示。另一方面，抗体能结合到(bind)蛋白质上。为了特征化复杂抗体+蛋白质，超过样本来提供蛋白质。可以注意到，蛋白质分子没有标记，并且在没有加到荧光抗体上时是黑的。较长的衰减时间s=663jis对应于复合体的增加的直径。蛋白质的结合减少了抗体分子的亮度值，这表明蛋白质取代了两个染料分子中的一个。蛋白质可以结合到聚合物上。超过溶液地添加聚合物产生只包含复杂抗体+蛋白质+聚合物(和黑的分子)的样本。由长的衰减时间Tp=1611jis标示出，这个复合物是相当大的。减少的亮度值可以被解释为有相当大群体的分子处于电子三重态。三重态寿命和群体可通过文献中说明的对三重态对亮度的影响进行建才莫[JerkerWidengren，tloMets，andRudolfRigler:FluorescenceCorrelationSpectroscopyofTripletStatesinSolution:ATheoreticalandExperimentalStudy,C^附/勿，99，pages13368-13379(1995)并采用非线性拟合方法来得到。可以选择一个适当的或最优的区间时间At来区分一个区间时间的不同的复合物。因此，必须选择这样的区间时间，即在该区间时间时每个物种的亮度值是相互很好分离的。图7中以AT^示出了一个例子，在ATJ斤有组成成分都具有不同的亮度值。参见图7，不好的选择是AT2,因为复杂抗体+蛋白质+聚合物和染料在此区间时间有相同的亮度。在抗体、蛋白质和聚合物的混合物中，在表l所列的复合物可能中的这些复合物中的每一个的摩尔浓度。这对于用标准稀释系列测量结合常数是特别重要的。含有S种不同物种的混合物的样本的亮度曲线(具有预定的各自的亮度函数nmax，s(At)，s=l，2""，S)由/^ax(A0=1>乙(")义,/(^>隨,(AOI,)给出。参数XsS-l，2，."，S能够用非线性拟合来确定，并且描述了成分s的相对摩尔份数，!'=1Cs是組分s的浓度。在本例中，参见表l，组分的数目为4。必须应用图7所示的四个亮度函数来通过非线性拟合算法得到相应的摩尔份数Xss=l，2，3，4。权利要求1.一种确定含有至少一个物种的粒子的样本的特征性质的方法，所述粒子在观察容量中发射、散射和/或折射光子，其特征在于，该方法包括如下步骤1)将在观察时间<mathsid="math0001"num="0001"><math><![CDATA[<mrow><mi>T</mi><mo>=</mo><munderover><mi>&Sigma;</mi><mrow><mi>i</mi><mo>=</mo><mn>1</mn></mrow><mi>N</mi></munderover><mi>&Delta;</mi><msub><mi>t</mi><mi>i</mi></msub></mrow>]]></math>id="icf0001"file="A2007800510310002C1.tif"wi="19"he="11"top="57"left="75"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/></maths>的连续时间间隔Δti＝[ti-1，ti)(i＝1，2，3，...)内登记的光子事件的数目ni(计数率)进行登记和计数，2)确定在预定时间间隔Δt内的光子事件数目n的分布函数p(n)，和3)使用在期望的分布函数p(n)、浓度c、每一光子事件只是源自单个粒子的理想实验中在预定时间间隔Δt内期望的光子事件数目n的单个粒子分布函数P1(n)、以及有效容量Verr＝&lt;m&gt;/c之间的理论关系来确定P1(n)、Veff、浓度c和/或其它特征性质，其中&lt;m&gt;是对每一个计数率起作用的粒子的平均数，其可通过将这些性质与测量的p(n)进行拟合来确定。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，基于马尔可夫过程理论的单个粒子分布函数PKn)由下式给出<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，&(11=0)=0，其中jt(F)表示粒子的亮度函数，其由在位置F的单个粒子的光子事件的平均值和泊木>分布Poi(n，n)=exp(卞X/n！定义。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，亮度函数通过对多个位置？测量fi并在这些位置之间插值H来确定。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，亮度函数由基于分子荧光光谱理论的理论模型和空间激光强度的给定模型来确定。5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于，P"n)由亮度函数H(F)来确定。6.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于，Veff由亮度函数n(。来确定。7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，亮度函数由P"H)或Veff来确定。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，P"n)或Veff被直接测量。9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于，相同物种的粒子发荧光或用荧光标记，并由激光束激发。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，亮度函数n(0的最大值由分布函数的一次矩来确定〃咖一。11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，亮度函数jif)的最大值由分布函数的一次矩和噪声作用来确定12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，亮度函数n。通过具有参数aj和不同的亮度函数(j=1，2，...，尺)的不同的亮度函数的叠加来建^^。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，每一个亮度函数0}=1，2，...，10由给定数目的M个特征参数Hjk(k=l，2，…，M)来确定。14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，亮度函数n(。由空间高斯分布〃(。:-A,exp(-2r2/。2),来建模，其中Hmax是激光焦点中心中的粒子的亮度，a表示激光束的腰部参数。15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，亮度函数n(F)通过具有参数nn和nj2(j-l，2,…，K)的高斯分布的叠加来建模。16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，特征参数njk(j=l，2，...，K;k=l，2，...，M)由标准去巻积方法来确定。17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，特征参数jijk(j=l，2,.."K;k=l，2，…,M)由迭代Richardson-Lucy去巻积算法来确定。18.如权利要求l所述的方法，其特征在于，单个粒子分布函数P"n)由<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>给出，其中P(n/)是在时间点to位于位置F的单个粒子在时间间隔te=[t0，t。+At)期间计数的光子事件的数目的分布。19.如权利要求1至18中任一所述的方法，其特征在于，基于马尔可夫过程理论，使用在概率分布函数p(n，c)和单个粒子分布函数P"n)之间的理论关系/K",c)-尤Poi'(附，W)尸J")其中P4n)表示单个粒子分布函数PAn)的第m巻积'1，和20.如权利要求1至19中任一所述的方法，其特征在于，概率分布函数p(n，c)通过递推公式来计算，其中，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>21.如;K利要求1至20中任一所迷的方法，其特征在于，粒子的浓度c由得到计数率为0的概率来确定c=-lnO("-0，c))/Kejr22.如权利要求1至20中任一所述的方法，其特征在于，粒子的浓度c由得到计数率为0的概率和噪声作用〈n、。iM来确定c-[-ln(/7("-0,c))-〈"〉J/々23.如权利要求1至22中任一所述的方法，其特征在于，粒子的平均数目<1>由得到计数率为0的概率来确定〈》i>--ln(p("-O，c))24.如权利要求1至22中任一所述的方法，其特征在于，粒子的平均数目〈m〉由得到计数率为0的概率和噪声作用〈n、。ke来确定25.如权利要求1至24中任一所述的方法，其特征在于，单个粒子概率分布函数P"n)通过递推公式辨-丄&聰"-W《附〉"S来计算。26.如权利要求1至25中任一所述的方法，其特征在于，分布函数p(n，c)通过与泊々〉分布巻积<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>以考虑额外的背景信号(例如硬件的随机噪声)来确定。27.如权利要求1至26中任一所述的方法，其特征在于，根据权利要求1的步骤(3)的特征性质通过标准非线性多参数拟合过程来确定。28.如权利要求1至26中任一所述的方法，其特征在于，根据权利要求1的步骤(3)的特征性质通过标准矩方法来确定。29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，单个粒子概率分布函数的矩通过递推公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>来计算。30.如权利要求24、26和29中任一所述的方法，其特征在于，噪声作用-n、。^通过使用没有任何所述物种粒子的样本的介质液体或使用与样本具有相同或相似性质的液体以使〈n、。ke在权利要求1的步骤(3)中固定来直接测量。31.—种确定含有N个不同物种的粒子的混合物的样本的特征性质的方法，所述粒子在观察容量中发射、散射和/或折射光子，其特征在于，混合物的总体分布函数？(11;<^，<;2，...，(^)由单个物种作用p(s)(n;cs)，s=1，2，...，N的巻积来确定/7(";0,，<;2，."，)=由此单个物种作用p，n;Cs)是根据权利要求1至30中之一由预定有效容量Veff、在混合物中存在的每一物种s的单个粒子分布函数P严(n)以及给定的实验装配来确定。32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，参数cs，(s=1，2，...，N)和噪声作用<n>n。ise通过使用预定参数与理论模型的非线性拟合来确定。33.如权利要求31或32所述的方法，其特征在于，p(n;q,C2,".，CN)的计算通过生成函数法加快。34.如权利要求31或32所述的方法，其特征在于，要求的参数由矩方法确定，由此卩(11;<:1，(!2，...，<^)的矩由？(8)(11;0的矩的乘积来表示，s=1，2，""N。35.—种确定含有至少一个物种的粒子的样本的特征性质Eb...,EL的方法，所述粒子在预定的观察容量中发射、散射和/或折射光子，其特征在于，该方法包括如下步骤1)将在观察时间r-^Ati的连续预定时间间隔AtiH小ti)(i=1，2,3，…)内登记的光子事件的数目Hi(计数率)进行登记和计数，其中M=:At=常数，2)确定在预定时间间隔At内的光子事件数目n的分布函数p(n)，和3)根据权利要求1至34中之一执行其它步骤；还包括进一步的步骤4)使用不同的时间间隔Atk(k=l，...，K)重复步骤l)至3)K次，通过每一系列的这些步骤确定相同的特征性质E1v..，El,5)确定特征性质E!，…，EL对A一的依赖，6)从根据步骤5)的测量的依赖来确定最优At或粒子的其它特性。36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，时间间隔Atk(k=l，".，K)在l(T6秒和1秒之间。37.如权利要求35或36所述的方法，其特征在于，时间间隔Atk(k=l,...，K)选择为在对数标度上等距离。'38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，Atk=0.8k秒，其中k=0，.."72。39.如权利要求35至38所述的方法，其特征在于，根据步骤5)通过标准拟合过程来将给定的分析函数与测量的依赖进行拟合。40.如权利要求35至39中任一所述的方法，其特征在于，根据步骤4)和5)的特征性质Elv.，，EL中的一个是样本中的粒子的特定物种。41.如权利要求35至40中任一所述的方法，其特征在于，根据步骤4)和5)的特征性质Eb...，Et中的至少一些是样本中的混合物中的数个物种的粒子的部分浓度。42.如权利要求35至41中任一所述的方法，其特征在于，将根据步骤5)的测量依赖与已测量的依赖或理论函数相比较，以识别样本中的粒子的特定物种或特定物种的粒子的部分浓度。43.如权利要求39所述的方法，其特征在于，根据已测量的依赖的叠加或理论函数通过非线性拟合将测量依赖引入，以确定样本中的粒子的特定物种或特定物种的粒子的部分浓度。44.如权利要求42所述的方法，其特征在于，测量分布函数p(nk，Atk)(k=l，...，K)，并且通过适当的拟合过程，从p0ik，At"来确定最大亮度Ji，x(At)作为特征性质。45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，作为进一步的步骤，通过适当的拟合函数，从Hmax(At)来确定极限At—0时的pmax(At)、扩散运动、扩散时间TD和/或装置的结构参数SP。46.如权利要求44或45所述的方法，其特征在于，其中，作为进一步的步骤，从jimax(At)来确定衰减时间iv和/或样本中粒子的特定物种的比例。47.如权利要求44所迷的方法，其特征在于，在有数个物种的粒子的样本中，确定flmax(At)，并且通过公式由先前测量的或以其它方式确定的nmax，s(At)来确定样本中物种s的摩尔比例Xs。48.如权利要求44所述的方法，其特征在于，在有数个物种s的粒子的样本中，确定n咖x(At)，并且通过将参数0SXs5l(s-l，…，S)与边界条件^Xs=1进行非线性拟合来确定样本中物种的摩尔比例Xs。全文摘要本发明提供了一种确定含有至少一个物种的粒子的样本的特征性质的方法，所述粒子是在预定的观察容量中发射、散射和/或折射光子的物种的粒子，该方法包括如下步骤1)将在观察时间T＝∑^N_i=1Δt_i的连续时间间隔Δt_i＝[t_i-1，t_i)(i＝1，2，3，...)内登记的光子事件的数目n_i(计数率)进行登记和计数，2)确定在预定时间间隔Δt内的光子事件数目n的分布函数p(n)，和3)使用在期望的分布函数p(n)、浓度c、在每一光子事件只是源自单个粒子的理想实验中在预定时间间隔Δt内期望的光子事件数目n的单个粒子分布函数P₁(n)、以及有效容量V_eff＝<m>/c(其中<m>是对每一个计数率有作用的粒子的平均数)之间的理论关系来确定P₁(n)、V_eff、浓度c和/或其它特征性质，其中<m>是对每一个计数率有作用的粒子的平均数，其可通过将这些性质与测量的p(n)进行拟合来确定。文档编号G01N21/64GK101627298SQ200780051031公开日2010年1月13日申请日期2007年12月28日优先权日2006年12月28日发明者H·马蒂斯,J·阿克曼申请人:Fluit生物系统有限公司