专利名称：一种饲料有效磷测定方法
技术领域：
本发明涉及到饲料磷生物学效价的测定方法，特别是猪植物性词料有效磷的测定方法。
背景技术：
磷是动植物体内的必需矿物元素，它不但是骨骼组织的有效成分，而且是其它软组织和 能量代谢过程中必不可少的成分，对代谢功能的正常发挥起着重要的作用。因此，动物必须 从饲料中获取足够的磷，才能维持正常的生命和生产活动。特别是现代高产品种对磷营养十 分敏感，若磷缺乏，即可导致动物生长缓慢甚至停滞，饲料转化率降低。与此同时，作为一 种非再生资源，磷在词料工业中具有举足轻重的地位，是继蛋白质和能量以外的第三种最昂 贵的饲料原料(Lei等，2000; Novak等，2000; Fan等，2001;霍启光，2002)。据统计， 我国配合饲料生产量达7400万吨(国家统计年鉴，2001)，按磷酸氢钙添加量1.2%计，则年 消耗量近90万吨，所占原料费用达13.5亿元。，但与其形成鲜明对比的是，在养殖业发达的 地区，磷污染环境是个非常严重的问题，已成为一个全球性的问题(Jongbloed等，1997;01iglive 等，2000; Paik等，2001; Han等，2001;方热军等，2003)。例如，在欧洲一些地区(比利 时、荷兰和法国)动物排泄物所导致的P2O5量达300kg/ha/年(Eeckhout等，1994);在我国， 以养猪业为例，年生猪词养量达4.47亿头，年猪粪尿排放量达1.96亿吨，按排泄物中含磷 2.0%计(Poulsen等，1999)，仅养猪业一项，年向环境排放的磷量就达196万吨之多。因此， 磷资源的合理、有效利用对解决因过量磷的排泄所导致的环境污染具有重要意义。
植物性饲料中的磷由植酸磷和非植酸磷组成，是满足动物磷营养需要的重要来源。不同 植物性饲料植酸磷含量差异很大，植酸酶活力程度不一。因此，猪对不同植物性饲料磷的消 化吸收有很大差别(Nelson等，1967， 1968;中国资料数据库，1991)，由于尚缺乏有效的方 法，目前我国植物性词料磷营养价值的评定仍停留在估测水平(郑树贵等，2001)。生产上为 了避免磷营养的缺乏，往往向饲料中添加大量的无机磷盐，既增加了饲料成本，又导致过量 磷的排泄。
有效磷评定的传统方法主要是采用斜率比法，通过测定被考察磷源相对于标准磷酸盐差 异而确定的其相对生物学效价，或者直接测定磷的表观消化率(Jongbloed等，1987， 1990; Dellaert等，1990; Cromwell, 1992;贾刚等，1998; NRC， 1998; Fan等，2001)。由于受 到方法的限制和内源磷的干扰，二者均难以反映饲料磷被动物吸收利用的真实情况(Fan等， 2002)。
理论上，磷的真消化率更能准确反映饲料中磷源被动物利用的真实情况，但是内源磷的 准确评定方法复杂，试验条件难以控制。而且动物试验虽然客观，但耗时、耗财、费力。
体外透析法通过人工模拟动物的消化过程，其结果基本上可以反映饲料养分被动物消化 吸收的情况，在蛋白质生物学效价评定中被广泛应用(Wicke， 1972; Gueguen， 1977; Huyhebaert 等，1980)。 Liu等(1997， 1998)报道，体外法评定饲料有效磷含量的结果与体内法高度相 关(产0.999)，目前体外透析法已被用于饲料磷生物学效价的评定，且其与饲料磷真消化率的 相关系数达到0.899 (方热军等，2003)，但透析袋毕竟不是活体组织，无法反映饲料磷在动 物体内真实的吸收情况(计峰等，2003)。而外翻肠囊法就可以克服这一缺点，但是根据査阅 资料来看，外翻肠囊法尚未用于词料磷生物学效价的评定。因此，本发明拟采用体内消化试 验、体外透析法及外翻肠囊法分别测定饲料磷消化率、体外透析率及体外吸收率，分别将饲 料磷体外透析率、体外吸收率与饲料磷消化率进行比较分析，进而进行线性回归分析，比较 何种体外评定方法更接近体内评定方法，探索更适合于饲料磷生物学效价的体外评定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合饲料有效磷测定的新方法一外翻肠囊法，克服现有技术测 定词料有效磷的不足。
本发明的理论依据具有生理活性的猪十二指肠离体后短时间内其细胞仍具有生理活 性，可以进行物质的渗透与交换。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的 本发明提供一种饲料有效磷的测定方法，包括步骤如下
(1) 胃蛋白酶消化。准确称取待测饲料样品，放入玻璃试管中，加入适量胃蛋白酶溶液 振荡摇匀，用palafilm胶密封，在39'C的水浴中恒温培养75min。
(2) 胰蛋白酶消化。将经胃蛋白酶消化后的食糜与胰蛋白酶溶液混匀，用palafilm胶密 封，继续在39°C的水浴中恒温培养270min。
(3) 外翻肠囊的制作。参照Seal和Heaton(1983)的方法，用生理盐水将具有生理活性的 猪十二指肠冲洗干净，剪成约5cm的肠段，小心将肠段外翻后，先结扎肠囊的一端，然后向 浆膜腔内注入不含磷的Tris-Krebs缓冲液，结扎肠囊的另一端，即成外翻肠囊。
(4) 磷的体外吸收。将外翻肠囊放入已进行(1) 、 (2)酶饲料样品消化的试管中，加 入缓冲液，覆盖外翻肠囊并摇匀，继续在39。C的水浴中恒温培养40min。
(5) 磷的测定。将肠囊取出，用不含磷的Tris-Krebs缓冲液将肠囊表面冲洗干净后，放 入干净的坩埚中，于105"C下烘24小时，烘干后，将坩埚放入马福炉中灼烧8小时，溶解灰
分，采用钼蓝法测定灰分中的总磷含量。 具体的操作可以如下方式实施
(1) 胃蛋白酶消化。准确称取lg待测饲料样品，放入20mL玻璃试管中，加入4mL胃 蛋白酶溶液(内含750U/mL+0.18mol/LHCl)，振荡摇匀，用palafilm胶密封，在39'C的水浴 中恒温培养75min。
(2) 胰蛋白酶消化。将经胃蛋白酶消化后的食糜与lmL胰蛋白酶溶液(浓度为2.4mg/mL， 相当于在日粮样品中的含量为2.4mg/g)混匀，用palafilm胶密封，继续在39'C的水浴中恒温 培养270min。
(3) 外翻肠囊的制作。参照Seal和Heaton(1983)的方法，用生理盐水将具有生理活性的 猪十二指肠冲洗干净，剪成约5cm的肠段，小心将肠段外翻后，先结扎肠囊的一端，然后向 浆膜腔内注入2mL不含磷的Tris-Krebs缓冲液(Tris-Krebs缓冲液的组成Tris 15.5mmol/L; NaCl 120.7匪ol/L; KCl 5.6mmol/L; CaCI2 2.5mmol/L;水合MgCl2 1.2mmol/L;葡萄糖 11.5mmol/L)。注入2mLTris-Krebs缓冲液后，结扎肠囊的另一端，即成外翻肠囊。具有生 理活性的猪十二指肠可以在猪屠宰后取得，并用生理盐水进行处理，处理的方法可以用本专 业技术领域中常用的方法。
(4) 磷的体外吸收。将外翻肠囊放入己进行饲料样品酶消化的试管中，加入5mLTris-Krebs 缓冲液，覆盖外翻肠囊并摇匀，继续在39。C的水浴中恒温培养40min。
(5) 磷的测定。将肠囊取出，用不含磷的Tris-Krebs缓冲液将肠囊表面冲洗干净后，放 入干净的坩埚中于105'C下烘24小时，烘干后，将坩埚放入马福炉中灼烧8小时，溶解灰分， 采用钼蓝法测定灰分中总磷含量。
图h外翻肠囊在不同培养时间下对饲料磷吸收率的比较； 图2:饲料磷体外吸收率与其表观消化率的比较； 图3:饲粮磷体外吸收率与其真消化率的相关性。
具体实施例方式
实施例1、外翻肠囊培养时间的确定
设培养时间分别为20、 30、 40、 50、和60min的5个处理组。将5头猪共30个肠囊 随机分配到5个处理组，每个处理组6个肠囊，每个肠囊作为外翻肠囊的一个重复。称取30 份样品，每份样品lg，分别放入20mL玻璃试管中，加入4mL胃蛋白酶溶液(内含 750U/mL+0.18mol/LHCl)，振荡摇匀，用palafihn胶密封，在39'C的水浴中恒温培养75min。
将经胃蛋白酶消化后的食糜与lmL胰蛋白酶溶液(浓度为2.4mg/mL，相当于在日粮样品中 的含量为2.4mg/g)混匀，用palafilm胶密封，继续在39。C的水浴中恒温培养270min。将外 翻肠囊放入试管中(消化饲粮)，加入5mLTris-Krebs缓冲液，覆盖外翻肠囊并摇匀，继续 在39。C的水浴中恒温培养40min。将肠囊取出，用缓冲液将肠囊表面冲洗干净后，放入干净 的坩埚中于105t:下烘24小时，烘干后，将坩埚放入马福炉中灼烧8小时，溶解灰分，用钼 蓝法测定灰分中总磷含量。得到饲料磷体外吸收率与外翻肠囊培养时间的关系如图l所示。
词料磷的吸收在20 40min时呈上升趋势(PO.Ol)，其中20 30min时间段吸收率上 升速度缓慢，而在30 40min时间段吸收率上升速度很快，40min后，饲料磷吸收率缓慢下 降，50 60min，吸收率下降非常快，其原因可能是体外培养40min后，因为缺少在体循环血 液供应的氧气和营养物质，肠段的正常组织结构遭到破坏，大量的磷顺着浓度梯度扩散出肠 囊，因此选择40min为外翻肠囊的最佳培养时间。
实施例2、外翻肠囊法评定4种日粮磷体外吸收率
四种日粮分别为小麦型不加植酸酶日粮、小麦型加植酸酶日粮、糙米型不加植酸酶日粮、 糙米型加植酸酶日粮，将4头猪共24个肠囊随机分配到4个处理组，每个处理组6个肠囊， 每个肠囊作为外翻肠囊的一个重复。每种日粮称取6份样品，每份样品lg，分别放入20mL 玻璃试管中，加入4mL胃蛋白酶溶液(内含750U/mL+0.18mol/LHCl)，振荡摇匀，用palafilm 胶密封，在39'C的水浴中恒温培养75min。将经胃蛋白酶消化后的食糜与lmL胰蛋白酶溶液 (浓度为2.4mg/mL，相当于在日粮样品中的含量为2.4mg/g)混匀，用palafilm胶密封，继 续在39'C的水浴中恒温培养270min。将外翻肠囊放入试管中(消化词粮)，加入5mLTris-Krebs 缓冲液，覆盖外翻肠囊并摇匀，继续在39'C的水浴中恒温培养40min。将肠囊取出，用缓冲 磷表观消化率关系见图2。
如图2所示，不加酶情况下，糙米型日粮磷表观消化率有低于小麦型日粮的趋势 (0.05<P<0.10)，外翻肠囊法评定饲料磷体外吸收率也表明小麦型日粮磷吸收率显著高于糙米 型日粮(P0.05)，与表观消化率反映趋势相近，均表明不同日粮类型由于所含植酸酶含量不一 样，从而对饲料磷利用率产生影响。
实施例3、外翻肠囊法评定9种植物性饲料磷体外吸收率
9种植物性饲料分别为玉米、豆粕、次粉、麦麸、小麦、糙米、棉粕、菜粕、米糠，将9 头猪共54个肠囊随机分配到9个处理组，每个处理组6个肠囊，每个肠囊作为外翻肠囊的一
个重复。每种日粮称取6份样品，每份样品lg，分别放入20mL玻璃试管中，加入4mL胃蛋 白酶溶液(内含750U/mL+0.18mol/LHCl)，振荡摇匀，用palafilm胶密封，在39'C的水浴中 恒温培养75min。将经胃蛋白酶消化后的食糜与lmL胰蛋白酶溶液(浓度为2.4mg/mL，相当 于在日粮样品中的含量为2.4mg/g)混匀，用palafilm胶密封，继续在39"C的水浴中恒温培养 270min。将外翻肠囊放入试管中(消化饲粮)，加入5mLTris-Krebs缓冲液，覆盖外翻肠囊 并摇匀，继续在39'C的水浴中恒温培养40min。将肠囊取出，用缓冲液将肠囊表面冲洗干净 后，放入干净的坩埚中于105'C下烘24小时，烘干后，将坩埚放入马福炉中灼烧8小时，溶 解，用钼蓝法测定其灰分中总磷含量。得到饲料磷体外吸收率与饲料磷真消化率关系 见图3。
由图3可知，饲粮磷体外吸收率与其表观消化率无显著相关性(P>0.05)，而词粮磷体 外吸收率与其真消化率呈极显著相关性(PO.Ol，见图5)，线性相关方程为Y=0.773X+16.85 (Y:饲粮磷真消化率，X:饲粮磷体外吸收率，PO.Ol， R2=0.688)。
权利要求
1、一种饲料有效磷测定方法，包括如下步骤(1)胃蛋白酶消化准确称取待测饲料样品，放入玻璃试管中，加入适量胃蛋白酶溶液振荡摇匀，用palafilm胶密封，在水浴中恒温培养；(2)胰蛋白酶消化将经胃蛋白酶消化后的食糜与胰蛋白酶溶液混匀，用palafilm胶密封，继续在水浴中恒温培养；(3)外翻肠囊的制作参照Seal和Heaton(1983)的方法，用生理盐水将具有生理活性的猪十二指肠冲洗干净，剪成约5cm的肠段，小心将肠段外翻后，先结扎肠囊的一端，然后向浆膜腔内注入不含磷的Tris-Krebs缓冲液，结扎肠囊的另一端，即成外翻肠囊；(4)磷的体外吸收将外翻肠囊放入已进行(1)、(2)酶饲料样品消化的试管中，加入缓冲液，覆盖外翻肠囊并摇匀，继续在水浴中恒温培养；(5)磷的测定将肠囊取出，用不含磷的Tris-Krebs缓冲液将肠囊表面冲洗干净后，放入干净的坩埚中，于105℃下烘24小时，烘干后，将坩埚放入马福炉中灼烧8小时，溶解灰分，采用钼蓝法测定灰分中的总磷含量。
2、根据权利要求l所述的饲料有效磷测定方法，其特征在于所述的(1) 胃蛋白酶消化准确称取lg待测词料样品，放入20mL玻璃试管中，加入胃蛋白酶溶 液振荡摇匀，用palafilm胶密封，在39。C的水浴中恒温培养75min;(2) 胰蛋白酶消化将经胃蛋白酶消化后的食糜与胰蛋白酶溶液混匀，用palafilm胶密 封，继续在39'C的水浴中恒温培养270min;(3) 外翻肠囊的制作用生理盐水将十二指肠冲洗干净，剪成约5cm的肠段，小心将肠 段外翻后，先结扎肠囊的一端，然后向浆膜腔内注入2mL不含磷的Tris-Krebs缓冲液，注入 2mLTris-Krebs缓冲液后，结扎肠囊的另一端，即成外翻肠囊；(4) 磷的体外吸收将外翻肠囊放入已进行饲粮(1) 、 (2)酶消化的试管中，加入 5mLTris-Krebs缓冲液，覆盖外翻肠囊并摇匀，继续在39i:的水浴中恒温培养40min;(5) 磷的测定将肠囊取出，用缓冲液将肠囊表面冲洗干净后，放入干净的坩埚中于 105'C下烘24小时，烘干后，将坩埚放入马福炉中灼烧8小时，溶解灰分，将所得样品采用 钼蓝法测定其中总磷含量。
3、 根据权利要求l所述的饲料有效磷测定方法，其特征在于所述步骤(1)及(2)进 行饲料磷模拟动物体内消化；所述步骤(3) 、 (4) 、 (5)进行外翻肠囊体外培养。
4、 根据权利要求l所述的饲料有效磷测定方法，其特征在于Tris-Krebs缓冲液的组成 Tris 15.5腿ol/L; NaCl 120.7mmol/L; KCl 5.6mmol/L; CaCl2 2.5mmol/L;水合MgCb 1.2mmol/L;葡萄糖11.5mmol/L。
5、根据权利要求1所述的词料有效磷测定方法，其特征在于胃蛋白酶消化时，胃蛋白 酶溶液为750U/mL+0.18mol/LHCl。
全文摘要
本发明涉及一种饲料有效磷评定的新方法，该方法采用外翻肠囊测定饲料磷体外吸收率，包括如下步骤胃蛋白酶消化、胰蛋白酶消化、进行外翻肠囊磷的体外吸收等。将外翻肠囊放入试管中(消化饲粮)，加入5mLTris-Krebs缓冲液，覆盖外翻肠囊并摇匀，继续在39℃的水浴中恒温培养40min。将肠囊取出，用缓冲液将肠囊表面冲洗干净后，放入干净的坩埚中于105℃下烘24小时，烘干后，将坩埚放入马福炉中灼烧8小时，溶解灰分，采用钼蓝法测定其中总磷含量。
文档编号G01N1/28GK101358927SQ20081014316
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者方热军, 邹秀芸 申请人:湖南农业大学