用于诊断、风险评价、和监测孤独症谱系病症的方法

专利名称：：用于诊断、风险评价、和监测孤独症谱系病症的方法
技术领域：
：本发明涉及孤独症谱系病症(AutismSpectrumDisorder)(ASD)的诊断，风险评价，和监测。更具体而言，本发明涉及小分子或代谢物的测量，所述小分子或代谢物被发现在具有ASD临床表现的人和不表现ASD症状的受试者之间具有不同的多度。另外，本发明涉及关于设计用来改善与ASD有关的生物化学异常的推定治疗策略的监测。背景孤独症是未知来源的终身病症。所述病症的特征在于行为的、发育的、神经病理学的、和感觉的异常(美国精神病学协会(AmericanPsychiatricAssociation)1994)并且通常在3和10岁之间被诊断出，在5-8岁的儿童中观察到峰值流行率(Yeargin-Allsopp，Rice等.2003)。在这时，下降的小脑浦肯野细胞密度(Courchesne1997；Palmen,vanEngeland等·2004)，增加的氧化压力(Yorbik，Sayal等·2002；Sogut,Zoroglu等·2003；Chauhan,Chauhan等.2004；James,Cutler等.2004；Zoroglu,Armutcu等.2004；Chauhan和Chauhan2006)，和异常的甲硫氨酸/高半胱氨酸代谢(James，Cutler等.2004)是孤独症的唯一有力的生物学特征。虽然存在关于孤独症是具有出生前来源(Courchesne,Redcay等.2004)还是出生后来源(Kern和Jones2006)的争论，但是一般接受的是，症状和病理贯穿受试者的整个生命过程而持续(Bauman和Kemper2005)。这些发现提示，不管其来源，孤独症中存在基础性和进行性的生物化学异常。然而，尚未报告这样的与ASD的病原学或症候学有关的基础生物化学异常。因而，没有对于孤独症的生物化学测试。因此，存在对于可以在推测患有ASD的受试者中诊断ASD的方法或可以确定处于ASD风险中的受试者的方法的需要，并且还存在对于可以帮助监测ASD治疗的治疗策略的方法的需要。概述已经确定，患有临床诊断的ASD的受试者，相对于非ASD受试者，在他们的血浆中具有不同的小分子或代谢物多度。另外已经确定，一些具有很少或无ASD症状的高风险受试者(即家族史)显示类似于具有完全临床ASD表型的受试者的生物化学表型。因而，提供了诊断ASD和诊断升高的ASD风险的方法。已经确定，临床诊断患有ASD的受试者可以被生物化学地表征为具有一般由下列任一项描述的表型a)升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；b)升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；c)升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；或d)其组合。另外已经确定，实验的ASD治疗剂(乙酰基肉碱)可以改变上述生物化学ASD表型，以使得一些ASD生物化学标记物返回至非ASD水平，并使一些ASD生物化学标记物保持不变。另外已经确定，服用乙酰基肉碱的ASD受试者显示生物化学改变，所述改变使他们区别于未服用肉碱的ASD受试者以及未服用乙酰基肉碱的非ASD受试者。因而，提供了一般用于监测实验ASD治疗剂的方法和用于具体监测乙酰基肉碱治疗的方法。提供了用于区别性生物化学表征呈现ASD的受试者的方法。这个区别性生物化学表征对于呈现ASD症状的受试者的治疗和管理具有一定后果(ramifications)。首先，已经确定，具有类似的临床表型的ASD受试者具有显著不同的生物化学表型。这些发现表明，根据受试者的生物化学表型，可能需要开发不同的治疗策略用于不同的ASD受试者。更重要的是，本发现表明，优选将关于诊断患有ASD的受试者中的ASD治疗剂剂量和治疗效力的监测针对该具体的受试者生物化学特性进行个体化。例如，在显示高饱和VLCFA水平的受试者中，饱和VLCFA水平的监测可以代表有效治疗或剂量的最灵敏决定因素，但是这样的测量对于显示高的多不饱和VLCFA水平和正常的饱和VLCFA水平的ASD受试者可能几乎没有或没有价值。在一个示范性的实施方案中，本发明提供一种用于诊断人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态的改变或确定人类受试者的ASD风险的方法，所述方法包括下列步骤a)分析从患者获得的样品以获得一种或多种精确质量的定量数据；b)将所述一种或多种精确质量的定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；和c)使用所述比较，基于所述定量数据和所述一种或多种精确质量的相应数据之间的差异，来诊断人类受试者关于ASD的健康状态或健康状态的改变；其中所述一种或多种精确质量是在表2至10的任何一个中列出的。在另一个示范性的实施方案中，本发明提供一种用于诊断人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态的改变或确定人类受试者的ASD风险的方法，所述方法包括下列步骤a)分析从患者获得的样品以获得下列一项或多项的定量数据含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；DHA前体(24:5,24:6)；DHAβ-氧化的分解代谢产物(20:6)；含多不饱和VLCFA的磷脂；和其组合；b)将所述定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；和c)使用所述比较，基于在与从一份或多份参考样品获得的相应数据相比时具有下列特性之一，来诊断所述人类受试者关于ASD的健康状态或健康状态的改变升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；升高水平的DHA前体(24:5，24:6)；升高水平的DHAβ-氧化分解代谢产物(20:6)；升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；或其组合。在另一个示范性的实施方案中，本发明提供一种用于诊断人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态的改变或确定人类受试者的ASD风险的方法，所述方法包括下列步骤a)分析从患者获得的样品以获得一种或多种代谢物的定量数据；b)将所述一种或多种代谢物的定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；和c)使用所述比较，基于所述定量数据和所述一种或多种代谢物的相应数据之间的差异，来诊断人类受试者关于ASD的健康状态或健康状态的改变；其中所述一种或多种代谢物是表3至10的任何一个中列出的。在另一个示范性的实施方案中，本发明提供一种用于诊断人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态的改变或确定人类受试者的ASD风险的方法，所述方法包括将来自所述人类受试者的样品的包括表2至10任何一个中列出的一种或多种精确质量的定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；其中所述人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态的改变或ASD的风险基于在来自所述人类受试者的样品和一份或多份参考样品之间的一种或多种精确质量强度上的差异。在另一个示范性的实施方案中，本发明提供一种用于诊断人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态的改变或确定人类受试者的ASD风险的方法，所述方法包括将来自所述人类受试者的样品的包括表3至10任何一个中列出的一种或多种代谢物的定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；其中所述人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态的改变或ASD的风险基于在来自所述人类受试者的样品和一份或多份参考样品之间的一种或多种代谢物强度上的差异。附图简述由以下在其中参考附图的描述，本发明的这些及其它特征将变得更显而易见，其中图1是孤独症受试者血浆中PtdEtn(磷脂酰乙醇胺)改变的概述；图2是说明经过一年过程从诊断患有孤独症的个体受试者收集的跟踪(longitudinal)样品中含关键DHA和花生四烯酸(AA)的PlsEtn(缩醛磷脂酰乙醇胺(plasmenylethanolamine))和PtdEtn的水平对比于对照的图。数值是对照-标准化的并且表示为与PtdEtn16:0/18:0的比的平均值+/-SEM，对于每名儿童η=3，对于对照η=30,*,ρ<0.05对比于对照；图3是说明经过一年过程从诊断患有孤独症的个体受试者收集的跟踪样品中含关键VLCFA的PtdEtn水平对比于对照的图。数值是对照_标准化的并且表示为与PtdEtn16:0/18:0的比的平均值+/-SEM，对于每名儿童η=3，对于对照η=30，*，ρ<0.05对比于对照；图4是说明经过一年过程从诊断患有孤独症的个体受试者收集的跟踪样品中肉碱和邻_乙酰肉碱水平对比于对照的图。数值是对照_标准化的并且表示为平均值+/-SEM，对于每名儿童η=3，对于对照η=30广，ρ<0.05对比于对照；图5是说明经过一年过程从服用肉碱增补剂的孤独症受试者[η=12(4X3)]收集的跟踪样品中含关键DHA和AA的PlsEtn和含VLCFA的PtdEtn的水平对比于未服用肉碱增补剂的受试者[η=33(11X3)]，和对比于对照[η=30(10X3)]的图。数值是对照-标准化的并且表示为与PtdEtnl6:0/18:0的的比平均值+/-SEM，ρ<0.05对比于对照，#,P<0.05对比于孤独症，无肉碱；和图6是说明经过一年过程从孤独症受试者和他们的无症状同胞收集的跟踪样品中含关键DHA的PlsEtn和PtdEtn和含AA的PlsEtn的家族内比较的图。数值是对照_标准化的表示为与PtdEtn16:0/18:0的比的平均值+/-SEM，*，ρ<0.05对比于对照。详述已经确定了被发现在临床诊断的ASD，和不表达ASD症状的正常患者之间具有不同多度的小分子或代谢物。基于这些差异，可以确定受试者关于ASD的健康状态或健康状态的改变。提供了用于诊断受试者健康状态，例如用于诊断ASD的存在或缺乏的方法，且提供了用于诊断健康状态的改变，例如用于监测ASD治疗的方法。本发明的用于诊断受试者关于ASD的健康状态或健康状态的改变的示范性方法包括下列步骤a)分析从人类受试者获得的样品以获得一种或多种代谢物标记物或精确质量的定量数据；b)将所述一种或多种代谢物标记物或精确质量的定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；和c)使用所述比较以得出受试者健康状态或健康状态改变的确定。所述示范性方法可以另外包括从用于分析的人类受试者获得一份或多份样品的预备步骤。通过术语“代谢物”，意指特定的小分子，其水平或强度是在样品中测量的，并且可以将其用作标记物以诊断疾病状态。这些小分子还可以在本文中称为“代谢物标记物”，“代谢物成分”，“生物标记物”或“生物化学标记物”。在一个示范性实施方案中，提供用于诊断受试者的生物化学ASD表型的方法，所述方法包括下列步骤将来自一名或多名患有可能的ASD的患者的一份或多份样品引入到高分辨率质谱仪(例如，并且不希望是限制性的，傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FTMS))中；获得一种或多种代谢物标记物的定量数据；任选地，创建所述定量数据的数据库；将来自所述样品的定量数据与从非ASD受试者收集的相应参考数据进行比较；和使用所述比较来确定所述受试者的生物化学ASD表型。可以基于在将来所述自样品的定量数据与相应的参考数据比较时确定的差异来确定受试者的生物化学ASD表型。将ASD和非ASD受试者之间的差异描述在表2，11-18的任何一个中。在另一个示范性实施方案中，提供用于确定处于ASD风险中的受试者的方法，所述方法包括下列步骤将来自一名或多名未知ASD状态的患者的一份或多份样品引入到高分辨率质谱仪(例如，并且不希望是限制性的，傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FTMS))中；获得表2-10的任何一个中列出的一种或多种母体质量的定量数据；任选地，创建所述定量数据的数据库；将来自所述样品的定量数据与从非ASD受试者收集的相应参考数据进行比较；和使用所述比较来确定所述受试者是否具有升高的ASD风险。在另一个示范性实施方案中，提供用于监测ASD治疗的方法，所述方法包括下列步骤将来自一名或多名ASD受试者的多份样品引入到高分辨率质谱仪(例如，并且不希望是限制性的，傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FTMS))中；获得表2-10的任何一个中列出的一种或多种母体质量的定量数据；任选地，创建所述定量数据的数据库；将来自多份样品的定量数据相互比较并且与从非ASD受试者收集的相应参考数据比较，和/或与从受试者的治疗前阶段或早期治疗阶段预先收集的定量数据进行比较，和使用所述比较来确定治疗策略对于所述受试者的基础生物化学表型是否具有正效应、负效应或无效应。在另一个示范性实施方案中，提供用于诊断受试者的生物化学ASD表型的方法，所述方法包括下列步骤将来自一名或多名具有临床诊断的ASD的患者的一份或多份样品引入到多级质谱仪(例如，并且不希望是限制性的，三重四极杆质谱仪(TQ))中；获得表3-10的任何一个中列出的一种或多种代谢物的定量数据；任选地，创建所述定量数据的数据库；将来自所述样品的定量数据与从非ASD受试者收集的相应参考数据进行比较；和使用所述比较来确定所述受试者是否患有ASD。在另一个示范性实施方案中，提供用于确定处在ASD风险中的受试者的方法，所述方法包括下列步骤将来自一名或多名未知ASD状态的受试者的一份或多份样品引入到多级质谱仪(例如，并且不希望是限制性的，三重四极杆质谱仪(TQ))中；获得表3-10的任何一个中列出的一种或多种代谢物的定量数据；任选地，创建所述定量数据的数据库；将来自所述样品的定量数据与从非ASD受试者收集的相应参考数据进行比较；和使用所述比较来确定所述受试者是否具有升高的ASD风险。在另一个示范性实施方案中，提供用于监测ASD治疗的方法，所述方法包括下列步骤将来自一名或多名ASD受试者的多份样品引入到多级质谱仪(例如，并且不希望是限制性的，三重四极杆质谱仪(TQ))中；获得表3-10的任何一个中列出的一种或多种代谢物的定量数据；任选地，创建所述定量数据的数据库；将来自所述多份样品的定量数据相互比较和/或与从非ASD受试者收集的相应参考数据比较，和/或与从所述受试者的治疗前阶段或早期治疗阶段预先收集的定量数据进行比较，和使用所述比较来确定治疗策略对于所述受试者的基础生物化学表型是否具有正效应、负效应或无效应。在另一个示范性实施方案中，提供用于诊断受试者的生物化学ASD表型的方法，所述方法包括下列步骤从一名或多名ASD受试者获得在表2-10的任何一个中列出的一种或多种代谢物的定量数据；任选地，创建所述定量数据的数据库；将来自所述样品的定量数据与从非ASD受试者收集的参考数据进行比较；和使用所述比较来确定所述受试者是否患有ASD。在另一个示范性实施方案中，提供用于确定处在ASD风险中的受试者的方法，所述方法包括下列步骤从一名或多名未知ASD状态的受试者获得在表2-10的任何一个中列出的一种或多种代谢物的定量数据；任选地，创建所述定量数据的数据库；将来自所述样品的定量数据与从非ASD受试者收集的参考数据进行比较；和使用所述比较来确定所述受试者是否具有升高的ASD风险。在另一个示范性实施方案中，提供用于监测ASD治疗的方法，所述方法包括下列步骤从由一名或多名ASD受试者收集的多份样品获得表2-10的任何一个中列出的一种或多种代谢物的定量数据；任选地，创建所述定量数据的数据库；将来自所述多份样品的定量数据相互比较和/或与从非ASD受试者收集的相应参考数据进行比较和/或与从所述受试者的治疗前阶段或早期治疗阶段预先收集的定量数据进行比较；和使用所述比较来确定治疗策略对于所述受试者的基础生物化学表型是否具有正效应、负效应或无效应。如对于本领域技术人员应该明显地，除了以上说明的那些以外的其它分析技术可以用于量化表2-10中列出的代谢物，包括化学显色定量分析(UV，或其它波长)，基于抗体的酶联免疫吸附测定(ELISAs)，关于核酸检测测定的基于芯片的和聚合酶链式反应，基于珠的核酸检测方法，探针(dipstick)化学测定或其它化学反应，图像分析诸如磁共振成像(MRI)，正电子发射体层摄影(PET)扫描，计算机体层摄影(CT)扫描，核磁共振(NMR)，和多种基于质谱法的系统。如上所述，本发明的用于诊断受试者关于ASD的健康状态或健康状态的改变的示范性方法包括下列步骤a)分析从人类受试者获得的样品以获得一种或多种代谢物标记物的定量数据；b)将所述一种或多种代谢物标记物的定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；和c)使用所述比较，来得出所述受试者健康状态或健康状态改变的确定。所述示范性方法可以另外包括从用于分析的人类受试者获得一份或多份样品的预备步骤。分析样品的步骤(步骤a)可以包括使用质谱仪(MS)分析样品。例如，并且不希望是限制性的，这样的质谱仪可以是FTMS，轨道阱(orbitrap)，飞行时间(TOF)，磁式扇形(magneticsector)，线性离子阱(LIT)或四极型。备选地，质谱仪可以装有另外的预检测滤质器。例如，并且不希望是限制性的，这样的仪器通常称为四极-FTMS(Q-FTMS)，四极-TOF(Q-TOF)或三重四极(TQ或QQQ)。另外，质谱仪可以以母离子检测模式(MS)或以MSn模式运行，其中η>=2。MSn指这样的情况，其中母离子(parention)通过碰撞诱导的离解(CID)或其它碎裂步骤分裂以产生碎片离子，并且然后通过质谱仪检测一种或多种所述碎片。然后这样的碎片可以进一步地分裂以产生另外的碎片。备选地，可以使用液相或气相层析系统或通过直接注射，将样品引入到质谱仪中。通过术语“区别性诊断”或“区别地诊断”，它指的是，疾病状态的多个方面可以相互区别。特别是，本文中公开的方法允许ASD的多种生物化学表型的区别性诊断；例如并且不希望是限制性的，本文中公开的方法可以提供关于具有下列生物化学表型的患有ASD或处于ASD风险中的受试者的诊断a)升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；b)升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；c)升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；或d)其组合。根据本文中公开的方法，可以使用源自体内任何部位的任何类型的生物样品，例如但不限于，血液(血清/血浆)，CSF，尿，大便，呼吸，唾液，或任何实体组织包括肿瘤，相邻的正常肌肉、平滑肌和骨骼肌，脂肪组织，肝，皮肤，毛发，脑，肾，胰，肺，结肠，胃，或其它的活组织检查。特别感兴趣的是作为血浆的样品。虽然在本文中使用术语“血浆”，但是本领域技术人员应该承认，还可以使用血清或全血或全血的亚组分。可以通过需要局部麻醉药的腰椎穿刺获得CSF。在一个非限制性实施例中，当从患者抽取血样时，存在可以处理样品的若干方法。处理程度可以小到不进行处理那样(即冷冻的全血)或复杂到像分离特殊的细胞类型那样。最普通的和常规的步骤涉及从全血制备血清或血浆。全血样品处理方法，包括将血样定位(spotting)到固相支持物，诸如滤纸或其它固定材料上，属于本文中所述方法的范围。不希望是限制性的，可以然后进一步处理上述处理的血液或血浆样品，以使其与在检测和测量处理的血样内包含的代谢物中采用的方法分析技术相容。处理的类型可以在少至没有进一步处理到复杂到区别性提取和化学衍生化的范围内。提取方法可以包括在常用溶剂诸如甲醇，乙醇，醇和水的混合物，或有机溶剂诸如乙酸乙酯或己烷中的声波处理，索克利特萃取，微波辅助的提取(MAE)，超临界流体提取(SFE)，加速的溶剂提取(ASE)，加压的液相提取(PLE)，加压的热水提取(PHWE)和/或表面活性剂辅助的提取(PHWE)。提取用于FTMS非靶向分析和用于流动注射LC-MS/MS分析的代谢物的特殊目的方法是进行液相/液相提取，由此使非极性代谢物溶于有机溶剂中并且使极性代谢物溶于水性溶剂中。可以利用任何适合的方法包括本领域已知的那些来分析提取的样品。例如，并且不希望是限制性的，生物样品的提取物可以按照基本上任何质谱法平台上，通过直接注射或者在层析分离之后的分析来分析。典型的质谱仪包括电离样品内分子的源，和用于检测电离的分子或分子碎片的检测器。常用源的非限制性实例包括电子碰撞，电喷射电离(ESI)，大气压化学电离(APCI)，大气压光致电离(APPI)，基质辅助的激光解吸电离(MALDI)，表面增强的激光解吸电离(SELDI)，和其衍生物。常用质量分离和检测系统可以包括四极，四极离子阱，线性离子阱，飞行时间(TOF)，磁式扇形，离子回旋加速器(FTMS)，轨道阱，及其衍生物和组合。FTMS超过其它基于MS的平台的优点是它的高分辨能力，该高分辨能力容许分离仅相差数百道尔顿的代谢物，这些代谢物中的许多会被较低分辨率的仪器遗漏。代谢物一般通过它们的精确质量来表征，如通过质谱法技术测量。精确质量还可以称为“精确的中性质量”或“中性质量”。代谢物的精确质量在本文中以道尔顿(Da)或基本上与其相等的质量给出。通过“基本上与其相等”，意指精确质量中+/_5ppm的差异应该表示相同的代谢物。精确质量作为中性代谢物的质量给出。在样品分析期间发生的电离代谢物的过程中，代谢物将导致一个或多个氢原子的失去或获得和电子的失去或获得。这将精确质量改变成“电离的质量”，其通过电离期间失去或获得的氢原子和电子的质量区别于精确质量。除非另有说明，精确的中性质量将在本文中涉及。类似地，当代谢物通过其分子式描述时，应该给出中性代谢物的分子式将。自然，电离的代谢物的分子式将通过在电离期间失去或获得的氢原子数目或由于添加非氢加合离子而区别于中性分子式。在分析期间收集数据并且获得一种或多种代谢物的定量数据。通过测量存在于样品中的特定代谢物的水平或强度获得“定量数据”。将定量数据和来自一份或多份参考样品的相应数据进行对比。“参考样品”是关于特定疾病状态的任何适合的参考样品。例如，并且不希望是以任何方式限制性的，参考样品可以是来自对照个体的样品，即，有或者没有ASD家族史的没患ASD的人(在本文中也称为“‘正常’副本”)；参考样品也可以是从临床诊断患有ASD的患者获得的样品。如本领域技术人员所理解地，可以使用多于一份参考样品来与定量数据比较。例如并且不希望是限制性的，一份或多份参考样品可以是从非ASD对照个体获得的第一参考样品。一份或多份参考样品还可以包括从患有临床诊断的过氧化物酶体型ASD的患者获得的第二参考样品，从患有临床诊断的线粒体型ASD的患者获得的第三参考样品，从患有临床诊断的未知类型的ASD的患者获得的第四参考样品，或其任何组合。在监测受试者疾病状态改变的情况下，参考样品可以包括治疗前或治疗期间较早时期获得的样品，以比较作为治疗结果的疾病状态的改变。本发明范围内的方法将在下面的非限制性实施例中进一步说明。_9]实施例ι-.W^m^mm^m^mmiASP等i式者样品收集.经过12个月期间(在采样之间间隔六个月)从15位临床诊断的ASD受试者和12位非ASD对照收集三份血浆样品。样品提取.血浆样品储存在-80°C直到解冻用于分析。全部提取在冰上进行。代谢物使用的氢氧化铵和乙酸乙酯(EtOAc)提取三次，其各自的比例为115，接着用0.33%甲酸和EtOAc再提取两次，其各自的比例为115。将样品在提取之间在4°C以3500rpm离心lOmin，并且合并有机层。然后将有机和水性提取物储存在_80°C直到分析。质谱分析.血浆提取物通过直接注入到FTMS中和通过ESI或大气压化学电离(APCI)的采用正和负模式的电离来分析。对于负电离模式，在甲醇0.1%(ν/ν)氢氧化铵(5050,ν/ν)中，或对于正电离模式，在甲醇0.1%(ν/ν)甲酸(5050,ν/ν)中，将样品提取物稀释三或六倍。对于APCI，在不稀释的情况下，直接注射样品提取物。全部分析均在装有7.OT活动屏蔽的超导磁体的BrukerDaltonicsAPEXIII傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(BrukerDaltonics,Billerica,MA)上进行。使用电喷射电离(ESI)和/或APCI以1200μL/小时的流速直接注射样品。使用丝氨酸，四丙氨酸，利血平，Hewlett-Packard调整混合物和促肾上腺皮质激素片段4-10的标准混合物来优化离子传递/检测参数。另夕卜，根据仪器制造商的推荐，在lOO-lOOOamu质量范围内调整仪器条件以优化离子强度和宽带积累。将上述标准物的混合物用于内部校准每个样品谱以获得遍及lOO-lOOOamu范围内的质量准确度。总体上，对于每个样品获得包括提取物和电离模式的组合的六种单独的分析水性提取物1.正ESI(分析模式1101)2.负ESI(分析模式1102)有机提取物3.正ESI(分析模式1201)4.负ESI(分析模式1202)5.正APCI(分析模式1203)6.负APCI(分析模式1204)质谱数据处理.使用线性最小二乘方回归线，校准质量轴的值，以致每个内标质量峰与它的理论质量相比具有<lp.P.m.的质量误差。使用来自BrukerDaltonicsInc.的XMASS软件，获得1兆词的数据文件尺寸并且零填充到2兆词。在傅里叶变换和量级计算之前进行sinm数据变换。将来自每个分析的质谱整合，产生包含每个峰的精确质量和绝对强度的峰列表。分析在100-2000m/z范围内的化合物。为了跨越不同的电离模式和极性来比较和概括数据，将全部检测到的质量峰转变成它们相应的中性质量，假定形成氢加合物。然后使用DISCOVAmetrics软件(PhenomenomeDiscoveriesInc.，Saskatoon，SK，力口拿大)构建自我产生的二维(质量对比样品强度)阵列。将来自多个文件的数据整合，并且然后处理该合并的文件以确定独特的质量。确定每种独特的质量的平均值，代表y_轴。该值表示全部检测到的在统计上确定为相等的精确质量的平均值。考虑到仪器关于校准标准物的质量准确度大约是lppm，本领域技术人员应当公认，这些平均质量可以包括属于该平均质量+/-5ppm之内的单个质量。对于最初选择进行分析的每个文件创建一栏，代表χ-轴。然后将选择的每一个文件中存在的每种质量的强度填入到它的代表性x，y坐标中。将不含有强度值的坐标保留为空白。一旦在阵列中，数据将被进一步处理，可视化和解释，并且赋予假定的化学特征。然后将每一个光谱进行峰选择以获得检出的全部代谢物的质量和强度。然后将这些来自全部模式的数据合并以产生一个数据文件/样品。然后将来自全部样品的数据合并和比对以产生二维代谢物阵列，其中每个样品由一栏表示，且每种独特的代谢物由单行表示。在对应于给定的代谢物样品组合的细胞中，显示所述样品中的代谢物强度。当以这种形式表示数据时，可以确定在样品组之间显示出差异的代谢物。使用该方法，精确质量特征在不服用肉碱增补剂的ASD受试者和非ASD受试者之间不同。通过使用表2中描述的精确质量的全部或子集，本文中公开的方法允许ASD的诊断。实施例2使用LC-MS/MS诊断和个体表征ASD警试者以及ASD治疗剂的评价样品收集.经过12个月的期间(在采样之间间隔六个月)从15位临床诊断的ASD受试者和12位非ASD对照收集三份血浆样品。用肉碱(A09，All,A13，A15)治疗四位受试者。表1描述了受研究的受试者的临床特征。使用本领域已知的方法确定社会认知分数。虽然登记了12位非孤独症对照受试者，但是将两名同胞(C08和C29)从用于总比较的对照群中排除，这归因于他们的PlsEtn18:1/22:6血浆水平显著高于其余对照的事实(分别地，ρ=5.6e-6和4.Oe-4,图6)。样品提取如实施例1中所描述。LC-MS/MS流动注射分析.使用与Agilent1100LC系统连接的线性离子阱质谱仪(4000QTRAP,AppliedBiosystems(应用生物系统))进行分析。通过向每份样品的120μL乙酸乙酯级分添加15μL内标(处于甲醇中的5μg/mL的(24_13C)_胆酸(CambridgeIsotopeLaboratories(剑桥同位素实验室)，Andover,MA)。通过流动注射分析(FIA)注射100μ1样品，并且在负APCI模式下监测。所述方法基于每种代谢物的一个母体/碎片转换和(24-13C)-胆酸的多重反应监测(MRM)。将每个转换扫描70ms。将流速为360μ1/min的MeOH中的10%EtOAc用作流动相。源参数设置如下CUR10.0，CAD:8，NC-4.0，TEM:400，GSl:30，GS2:50，界面加热器开启。化合物参数设置如下=DP-120.0，EP:_10，NC-4.0，CE-40,CXP:_15。表3-10列出了代谢物和用于每种代谢物的MS/MS转换。通过用恒定浓度的(24-13C)_胆酸连续稀释健康正常血清提取物，对于全部分析物形成标准曲线以验证仪器线性。以随机盲方式分析全部样品并且通过已知的血清标准稀释物分类。全部标准曲线均具有r2值>0.98。血浆PtdEtn，PlsEtn，和孤独症总计，测量了136个PtdEtn和15个PlsEtn种类的血浆水平。这些分析结果概括在表11-18和图1中。不服用肉碱的孤独症受试者的关键观察是1.几乎全部饱和VLCFA(SVLCFA)的水平显著升高；2.18:1的水平降低，但是单不饱和VLCFA(MUVLCFA)的水平升高；3.含有三个双键的LCFA和VLCFA水平显著降低；4.DHA(226)，DHA前体(245，246)，和DHAβ-氧化的分解代谢产物(206)的水平全部升高；5.含有DHA的PlsEtn水平升高。没有观察到含有26:0的PtdEtn的血浆水平相对于含有22:0的PtdEtn增加。这些结果与由患有过氧化物酶体病症的受试者观察的那些相反，在所述患有过氧化物酶体病症的受试者中26:0比22:0升高至大得多的程度(Moser和Moser1996)。因此，本申请中描述的方法提供将ASD与过氧化物酶体病症相区别的方法。这些结果表明，全部患有ASD的儿童显示普遍的代谢表型。收集流程的非受控天性是这样的，即这些发现表示ASD受试者真正的二次采样(sub-sampling)。每名受试者在经过一年的期间在三个不同时刻取样并且不强制实行膳食限制。在这些设置下，11/11名未经治疗的ASD儿童显示相同的生物化学表型，即，统计上升高的含VLCFA和/或DHA的磷脂的水平(图2-3)。另外，在8/8个这样的家族中，即其中非ASD同胞可用于比较分析，ASD儿童具有比非ASD同胞更显著的生物化学表型(图6)。这些代谢异常最好适合减弱的线粒体脂肪酸β氧化的模型，导致棕榈酸酯的过量线粒体外处理。实施例3个体警试者分析因为关于全部参与者收集跟踪(longitudinal)样品，所以单独地评价每位参与者是可能的。该分析揭示显著的受试者-对-受试者的变异性，但是在受试者变异性内部相对适度，鉴于三份样品是历经一整年的过程收集的。如上所述，全部ASD受试者显示相同的基础代谢异常_棕榈酸酯的过量的线粒体外的处理。然而，该异常的实际生物化学表现和诊断被观察到具有多种受试者-对-受试者的变异性。为了说明该现象，表2和3显示八种原型生物标记物的个体特性，所述原型生物标记物代表实施例2中描述的5种代谢物改变(注意，最后4位受试者服用乙酰基-肉碱并且不是该讨论的一部分)。表2集中在含有DHA和AA的PlsEtn和PtdEtn上。可以观察到，仅受试者A22和A05不显示显著升高水平的含有DHA的PlsEtn或PtdEtn。然而，通过看图3可以看出，这2位受试者具有升高水平的多不饱和VLCFA26:3。未服用肉碱增补剂的所有孤独症儿童(11/11)被观察到具有显著更高水平(ρ<0.05)的DHA-PlsEtn或VLCFA-PtdEtn(图2禾口3)。实施例4监测实验的ASD治疗的生物化学功效已经提出，线粒体缺陷与ASD有关(Lombard1998；Clark-Taylor禾口Clark-Taylor2004)。因为已知乙酰基肉碱具有线粒体增强的性质(Pettegrew，Levine等.2000)所以它已经被提出作为可能的ASD治疗剂。乙酰基肉碱没有被批准，并且也没有证明它在ASD中是有效的。为了说明本文中所公开的监测ASD治疗的方法的实用性，在服用乙酰基肉碱增补剂的受试者中量化上述诊断ASD生物标记物。图4图解全部受试者中肉碱和乙酰基肉碱水平。未服用肉碱的ASD受试者没有显示肉碱或乙酰基肉碱的缺乏或上升。服用乙酰基肉碱的全部受试者具有升高水平的肉碱和乙酰基肉碱。在肉碱+/_孤独症受试者和对照之间的八种最具说明性的代谢物的血浆水平比较确定，肉碱对于孤独症生物标记物的作用是惊人的(图5)。观察到DHA-PlsEtn，DHA-PtdEtn，DHA前体(24:6)和饱和的VLCFA(280)的完全标准化。肉碱增补剂对于28:1和263的PdtEtn没有显著作用，这提示肉碱仅在调制棕榈酸酯来源的延长产物上有效。然而，服用肉碱的受试者具有显著升高水平的AA-PtdEtn(20:4)。这些数据提示，肉碱通过在线粒体中恢复棕榈酸酯氧化，有效防止VLCFA、DHA、和DHA-PlsEtn累积。然而，单-和二-不饱和脂肪酸前体的延长和去饱和率似乎不受影响，并且似乎发生AA的补偿性上升。t施彻丨5确定n有升高的ASPmmmt^对于八位登记的孤独症儿童(不包括服用肉碱的那些)，同时追踪无症状的或轻微症状的同胞(表1)。由于同胞中增加的ASD流行性，这些受试者被认为是高风险的(Newschaffer,Fallin等·2002)。当图2的PlsEtn代谢物按照家族绘图时(图6)，受影响的同胞总是具有比没有受影响的同胞更高水平的这些代谢物之一。该差异在8名受试者中的5名中是统计上显著的(ρ<0.05)。在三种情况的两种中，其中受影响的同胞对比没有受影响的同胞没有观察到具有显著更高的水平，没有受影响的同胞相对于对照具有显著升高的水平。这些受试者应该被生物化学地诊断为处于ASD风险中。当使用社会认知测试更精密地评价这两位对照儿童(C29和C08)的ASD症状时(Skuse2000)，可以看出男性受试者(C29)显示社会认知缺陷，而女性(C08)是完全无症状的(表1)。在女性受试者中缺乏作用不出乎意料，因为女性被认为具有社会认知储备(reserve)。基于这些发现，本申请中描述的方法可以有效确定处于ASD风险中的受试者。表1:临床信息概述。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2在孤独症受试者对比对照之间不同的精确质量特征。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表4具有含一个不饱和的sn-2位脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物的分子式，精确质量，和LC-MS/MS参数。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表6具有含三个不饱和的Sn一2位脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物的分子式，精确质量，和LC—MS／MS参数。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表7具有含四个不饱和的sn-2位脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物的分子式，精确质量，和LC-MS/MS参数。_Z.cooog\g__ε8ζ-(ζοοεΗ8το)τΗ__9OOCLOurjg__Td8SNg8HLOK>二ΖΖ/0:8upMmd_ζ,COOO^LOdg__ε8ζ-(ζοοεΗ8το)τΗ__Lo,gc--Lo豸Lo卜Qv卜__Td8SN8ZHcoK>_οζ/ο:8τupMmdζ.LOLOg\oo,ss__LOLOg-(gscoHso)TH8·8τοτΖ8ζ8·βτ0τ__τ1χ80τΝΗτΗτ8二0寸/ο:9τupMmd_Z■gLOg/sββ__LOgg-(gscoHso)TH__Oo.Qgg69βζ·τββ__Td8CHNOnHgo^8ε/0:9τupMmd_Z.LOLOg\oo__LOgg-(gscoHso)TH__00ojgggcog__Td8SN9SHZS^9ε/0:9τsMmd_ζ._pyg__LOgg-(gscoHso)TH__^写coc--Log__Td8CHNg3HLOLOoε/0:9τUdnd_Z._pdg__LOgg-(gscoHso)TH__^■①gocog__Td8SN86HSo^ζε/0:9τupMmd_Z._p061^-00__LOgg-(gscoHso)TH___59___Td8SN寸βΗτ^0ε/0:9τupMmd_Z.LOLOg\gdLOoo__LOgg-(gscoHso)TH__9OLOOO艺艺dLOoo__^feogols^8ζ/0:9τupMmd_Z.LOLOg\g■习Oo__LOgg-(gscoHso)TH__g.ggg〗gQ9.cogg__Td80Ν98ΗΖΚ3^9ζ/0:9τsMmd_Z.LOLOg\g__LOgg-(gscoHso)TH__9OOCLOurjg__τd80τΝΖ8Ηοκ>ζ/0:9τupMmd_Z,LOLO^LO.99C--__99ζ-(ζοτεΗ9το)τΗ__Lo,gc--Lo豸Lo卜Qv卜__Td8SN8ZHcoK>^ζζ/0:9τupMmd_Z,LOLO^LO.gcoc--__LOgg-(gscoHso)TH__Looococ--S二^^__Td80Ν寸ΖΗΚ>^0ζ/0:9τupMmd_謹sw/sw_诰靈漤敢_<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表8具有含五个不饱和的sn-2位脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物的分子式，精确质量，和LC-MS/MS参数。_Z.cooog\gojg__ε8ζ-(ζοοεΗ8το)τΗ__9gh.cog__Td8SN08HLOK>ο:ζζ/0:8τupMmd_Z,COOO^LO■艺C--__ε8ζ-(ζοοεΗ8το)τΗ__Lo)汔OOOCOLO-S卜__Td8SN9ZHcoK>οοζ/ο:8τupMmdζ.LOLOg\oo,S3__LOLOg-(gscoHso)TH8·9τοτοζ8·ζτοτ__τ1χ80τΝζπΗτ8Loo寸/ο:9τupMmd_ζ.LOLOg\oo06g__LOgg-(gscoHso)TH__g.ggg^οοΖ8β__Td8SN8SHgoο:8ε/0:9τUdnd_ζ._pdg__LOgg-(gscoHso)TH__^,ogg艺__TcmhNMHHZSο:9ε/0:9τsMmd_Z._p㈠g__LOgg-(gscoHso)TH__^ojgcoooccog__tcmhnoshlolooLo:寸ε/Ο:9upMmd_Z._pyg__LOgg-(gscoHso)TH__^PSLog__Td8SN96HSoο:ζε/0:9τupMmd_Z.LOLOg\g■汔Oo__LOgg-(gscoHso)TH__9gooogLOgcoo__Td8CHNganLOoοοε/ο:9τupMmd_Z.LOLOg\gοο__LOgg-(gscoHso)TH__9οο■浮Oo__Td8SN88H6K>ο:8ζ/0:9τupMmd_Z.LOLOg\g■宕Oo__LOgg-(gscoHso)TH__9.Qggigg.口g__Td8SN寸8HZK3ο:9ζ/0:9τsMmd_Z.LOgg\gojg__LOgg-(gscoHso)TH__9gh.cog__Td8SN08HLOK>Lo:艺/ο:9τupMmd_Z,LOLO^LO^92,__LOgg-(gscoHso)TH__Lo)汔OOOCOLO-S卜__Td80τΝ9ΖΗε5Lo:gg/O:supMmd_Z,LOLO^LO.9COC--__LOgg-(gscoHso)TH__Locococ---β__Td80ΝΖΖΗK>Loog/O9upMmd_謹sw/sw_诰靈漤敢_<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表11在Sn一2位置具有饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物在非孤独症儿童、未服用肉碱增补剂的孤独症儿童，和服用肉碱增补剂的孤独症儿童中的血浆水平(全部值表示为与PtdEtn16o／18o的比)。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表12具有含一个不饱和的sn-2位脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物在非孤独症儿童、未服用肉碱增补剂的孤独症儿童，和服用肉碱增补剂的孤独症儿童中的血浆水平(全部值表示为与PtdEtn16:0/18:0的比)。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表13具有含两个不饱和的sn-2位脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物在非孤独症儿童、未服用肉碱增补剂的孤独症儿童，和服用肉碱增补剂的孤独症儿童中的血浆水平(全部值表示为与PtdEtn16:0/18:0的比)。____孤独症ι孤独症对比对照ι_kΓ~代谢物MS/MS对照__-肉滅__+肉碱__-肉碱__+肉碱+Camvs.-Camj名称转换AvgSEMAvg_SEMAvgSEM比率ρ啦率ρ比率ρPtdEtn16:0/18:2714.5/255.20.6120.041)0.5230.0420.9130.145(0.851.4Ε-011.499.9Ε-031.751.1Ε-03PtdEtn16:0/20:2742.5/255.210.8160.27010.9630.48710.6790.6541.018.0Ε-010.998.2Ε-010,977.5Ε-01RdEtn18:0/22:2770.6/255.20.3550.0130.3240.0150.3980.0280.911.2Ε-011.12.1Ε-011.231.7Ε-02PtdEtn16:0/24:2798.6/255.20.0220.0010.0220.0010.0260.0021.009.7Ε-011.229.1Ε-031.229.1Ε-03PtdEtn16:0/26:2826.6/255.20.0410.0020.0400.0020.0410.0020.987.3Ε-010.988.5Ε-011.019.5Ε-01PtdEin16:0/28:2854.7/255.20.0150.0010.0150.0010.0190.0021.02&.0Ε-011.252.6Ε-021.236.3Ε-02PtdEtn16:0/30:2882.7/255.20.0030.0000.0030.0000.0040.0000.934.8Ε-011.373.1Ε-031.472.8Ε-03PldEtn16:0/32:2910.7/255.20.0030.0000.0030.0000.0040.0011.075.5Ε-011.328.9Ε-021.241.6Ε-01PtdEtn16:0/342938.8/255.20.0050.0000.0040.0000.0060.0000.976.0Ε-011.241.6Ε-021.289.8Ε-03PtdEtn16:0/36:2966.8/255.20.0050.0000.0050.0000.0060.0001.102.1Ε-011.235.7Ε-021.122.2Ε-01PtdEtn16:0/38:2994.8/255.20.0030.0000.0030.0000.0040.0010.892.8Ε-011.279.2Ε-021.422.7Ε-02PtdEtn16:0/40:21022.9/255.20.0040.0000.0060.000Q.Q050.0011.248.1Ε-031.197.0Ε-020.967.3E-Q1PtdHtn16:0/18:2742.5/283.21.2160.0921.0920.0981.9770.4300.903.6Ε-011.621.7Ε-021.S1~5-4Ε-03PtdEtn18:0/20:2770.6/283.26.8610.2107.1070.2577.2370.6091.044.7Ε-011.054.6Ε-011.028.2Ε-01PtdEtn18:0/22:2798.6/283.20.2030.0080.1930.0090.2670.0280.953.8Ε-011.314.8Ε-031.391.7Ε-03PtdEtn18:0/24:2826.6/283.20.0120.0010.0130.0010.0160.0021.046.3Ε-011.301.7Ε-021.2&1.9Ε-02PtdEtn18:0/26:2854.7/283.20.0210.0010.0230.0010.0230.0021.082.4Ε-011.103.4Ε-011.018.9Ε-01RdEtn18:0/28:2882.7/283.20.0060.0000.0080.0000.0080.0011.219.5Ε-031.273.7Ε-021.056.6Ε-01PtdEtn18:0/30:2910.7/283.20.0020.0000.0030.0000.0030.0001.423.2Ε-031.502.1Ε-021.057.4Ε-01PtdEtn18:0/32:2938.8/283.20.0020.0000.0020.0000.0020.0001.241.5Ε-011.077.4Ε-010.874.2Ε-01PtdEtn18:0/34:2966.8/283.20.0020.0000.0020.0000.0030.0001.133.0Ε-011.452.6Ε-021.281.3Ε-01PtdEtn18:0/36:2994.8/283.20.0020.0000.0020.0000.0020.0001.172.3Ε-011.193.4Ε-011.029.1Ε-01PtdEtn18:0/38:21022.9/283.20.0010.0000.0020.0000.0030.0001.172.1E-011.722.3Ε-031.472.4Ε-02PtdEtn18:0/40:2|1050.9；283.210.0010.000)0.D020.0ΡΡ|0.0020.00111.303.6E-D111.423.7Ε-0111.098,1E-01表14具有含三个不饱和的sn-2位脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物在非孤独症儿童、未服用肉碱增补剂的孤独症儿童，和服用肉碱增补剂的孤独症儿童中的血浆水平(全部值表示为与PtdEtn16:0/18:0的比)。___孤独症j孤独症对4对照j_代谢物MS/MS对照__-肉碱+肉碱'肉碱__+肉碱+Camvs.-Cam名称转换AvgSEMAvgSEMAvgSEM比率β比率ρ比率ρPtdEtn16:0/18:3712.5/255.20.3390.01510.2900.0150.3480.0240.862.6Ε-021.037.4Ε-011.20~5.1Ε-02PldEtn16:0/20:3740.5/255.20.3090.0150.2510.0100.3390.0390.812.1Ε-031.103.7Ε-011.353.5Ε-03PtdEtn16:0/22:3768.6/255.22.3270.0991.9860.1012.5060.1660.851.9Ε-021.083.5Ε-011.261.1￡-02PldEtn16:0/24:3796.6/255.20.0500.0020.0430.0020.0640.0030.851.6Ε-021.2&1ΛΕ31.515.0Ε-06PtdEtn16:0/26:3824.6/25520.0230.0010.0300.0040,0310.0051.331.1Ε-011.372.7Ε-021.039.1Ε-01PtdEtn16:0/28:3852.6/255.20.0090.0000,0090.0010.0130.0021.056.3Ε-011.399.5Ε-031.334.4Ε-02RdEtn16:0/30:3880.7f255.20.0090.0000.0100.0010.0130,0021.143.5E-011.411.4E-021.243.0E-01PldEtn16:0/32:3908.7/255.20.0040.0000.0040.0000.0050.0011.185.3E-021.415.5E-031.191.5E-01PtdEtn16:0/34:3936.7/255.20.0030.0000.0040.0000.0050.0001.142.0E-011,387.5E-031.211.4E-01PtdEtn16:0/36:3964.8/255.20.0060.0000.0060.0000.0060.0001.137.9E-021.161.4E-011.037.3E-01PtdEtn16:0/38:3992.8/255.20.0050.0000.0050.0000.0060.0010.891.6E-011.152.1E-011.291.1E-02PtdEtn16:ΟΜΟ:31020.8/255.20.0050.0000.0050.0000.0050.0011,214.0E-021.192.3E-010.999.4E-01PtdEtn18:0/18:3740.5/283.20.1850.0080.1690.0090.2180.0190.911.6E-011.177.0E-021.291.2E-02PtdEtn18:0/20:3768.6/2B3.20.3480.0200.2980.0180.4350.0650.866.4E-021.259.6E-021.467.7E-03PtdEtn18:0/22:3796.6/283.21.5740.0711.4610.07-41.8540.1290.932.8E-011.185.1E-021,271.0E-02PtdEtn18:0/24:3824.6/283.20.0290.0020.0260.0010.0420.0030.877.2E-021.442.3E-041.656.9E-07PtdEtn18:0/26:3852.6/283.20.0120.0010.0140.0030.0130.0021.204.9H-011.105.7E-010.928.3E-01PtdEtn18:0/28:3880.7/283.20.0060.0000.0060.0000.0060.0011.019.6E-011.103.9E-011.104.7E-01RdEtn18:0/30:3908.7/283.20.0040.0000.0050.0000.0060.0011.152.2E-011.431.4E-021.241.8E-01PtdEtn18:0/32:3936.7/283.20.0020.0000.0020.0000.0010.0001.123.3E-010.771.3E-010.693.8E-02PtdEtn18:0/34:3954.B/283.20.0020.0000.0020.0000.0030.0011.135.5H-011.611.1E-011.431.7E-01PldEtn18:0/36.3992.8/283.20.0030.0000,0030.0000.0040.0010.957.0E-011.322.1￡-011.389.4E-02PldEtn18:0/38:31020.8/283.20.0020.0000.0020.0000.0020.0001.105.2E-011.301.4E-011.183.1E-01PldEtn18:0/40:3|1048.9/283.2|0.0020.000|0.QQ20.00C·!Q.Q040.001[1.085.9E-01|1.802.3E-Q211.673.0E-02表15具有含四个不饱和的sn-2位脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物在非孤独症儿童、未服用肉碱增补剂的孤独症儿童，和服用肉碱增补剂的孤独症儿童中的血浆水平(全部值表示为与PtdEtn16:0/18:0的比)。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表16具有含五个不饱和的sn-2位脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物在非孤独症儿童、未服用肉碱增补剂的孤独症儿童，和服用肉碱增补剂的孤独症儿童中的血浆水平(全部值表示为与PtdEtn16:0/18:0的比)。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表17具有含六个不饱和的sn-2位脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)代谢物在非孤独症儿童、未服用肉碱增补剂的孤独症儿童，和服用肉碱增补剂的孤独症儿童中的血浆水平(全部值表示为与PtdEtn16:0/18:0的比)。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表18具有选择的sn-2位脂肪酸的乙醇胺缩醛磷脂(PlsEtn)代谢物在非孤独症儿童、未服用肉碱增补剂的孤独症儿童，和服用肉碱增补剂的孤独症儿童中的血浆水平(全部值表示为与PtdEtn16:0/18:0的比)。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>将本文中确定的全部参考通过参考结合于此。已经关于多个示范性的实施方案，描述了本发明。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离权利要求中限定的本发明范围的情况下，可以进行许多变化和修改。参考文献美国精神病学协会(AmericanPsychiatricAssociation)(1994).精神疾病的诊断和统计手册-第四版(DiagnosticandStatisticalManualofMentalDisorders-FourthEdition).Bauman,M.L.禾口Τ·L.Kemper(2005)."Neuroanatomicobservationsofthebraininautism:areviewandfuturedirections(孤独症中脑的神经解剖学观察回顾和未来方向)."IntJDevNeurosci(国际发育神经科学杂志)23(2-3)183-7.Chauhan,A.和V.Chauhan(2006).“Oxidativestressinautism(孤独症中的氧化压力)·“Pathophysiology(病理生理学)13(3):171_81·Chauhan,Α.,V.Chauhan,等.(2004)."Oxidativestressinautismincreasedlipidperoxidationandreducedserumlevelsofceruloplasminandtransferrin—theantioxidantproteins(孤独症中的氧化压力增加的脂质过氧化和减小的血浆铜蓝蛋白和转铁蛋白一抗氧化蛋白质的血清水平).“LifeSci(牛命科学)75(21)2539-49.Clark-Taylor,Τ.禾口B.Ε·Clark—Taylor(2004)·〃Isautismadisorderoffattyacidmetabolism？Possibledysfunctionofmitochondrialbeta-oxidationbylongchainacyl-CoAdehydrogenase(孤独症是月旨肪酸代病症吗？由长链酰基-辅酶A脱氢酶引起的可能的线粒体β-氧化功能障碍).“MedHypotheses(^学假说)62(6)970-5.Courchesne,Ε.(1997).“Brainstem,cerebellarandlimbicneuroanatomicalabnormalitiesinautism(孤独症中脑干，小脑和脑边缘的神经解剖学异常).〃CurrQpinNeurobiol(神经牛物学的现代观点)7(2)=269-78.Courchesne,Ε.,E.Redcay,等.(2004).“Theautisticbrain:birththroughadulthood(孤独症患者的脑出生至成年期).“CurrOpinNeurol(神经学的现代观点)17(4)=489-96.James,S.J.,P.Cutler,^.(2004).‘‘Metabolicbiomarkersofincreasedoxidativestressandimpairedmethylationcapacityinchildrenwithautism(患有孤独症的儿童中具有增加的氧化压力和削弱的甲基化能力的代谢生物标记物。)·“AmIClinNutr(美国临床营养学杂志)80(6)1611-7.Kern,J.K.禾口A.Μ·Jones(2006)·"Evidenceoftoxicity,oxidativestress,andneuronalinsultinautism(孤独症中的毒性，氧化压力，和神经元损伤的证据).‘‘JToxicolEnvironHealthBCritRev(毒物学环境健康B标准评述杂志)9(6):485_99·Lombard,J.(1998).“Autism:amitochondrialdisorder症)？"MedHypotheses(医学假说)50(6):497_500·Newschaffer,C.J.,D.Fallin,等·(2002)·“Heritableandnonheritableriskfactorsforautismspectrumdisorders(孤独症谱系病症的可遗传的和不可遗传的风险因子).“EpidemiolRev(流行病学评述)24(2)137-53.Palmen,S.J.,H.vanEngeland,等·(2004).“Neuropathologicalfindingsinautism(孤独症中的神经病理学发现)·〃Brain(脑)127(Pt12):2572_83.Pettegrew,J.W.,J.Levine,等·(2000).“Acetyl-L-carnitinephysical-chemical,metabolic,andtherapeuticproperties:relevanceforitsmodeofactioninAlzheimer'sdiseaseandgeriatricdepression(乙酉先基-L-肉碱物理-化学的，代谢的，和治疗的性质关于其在阿尔茨海默病和老年抑郁中的作用方式的关联性).“MolPsychiatry(分子精神病学)5(6):616_32.Skuse,D.H.(2000).“Imprinting,theX-chromosome,andthemalebrainexplainingsexdifferencesintheliabilitytoautism(胚教，X-染色体，男性脑解释对于孤独症倾向中的性别差异).〃PediatrRes(儿科研究)47(1):9_16.Sogut,S.,S.S.Zoroglu,等.(2003).“Changesinnitricoxidelevelsandantioxidantenzymeactivitiesmayhavearoleinthepathophysiologicalmechanismsinvolvedinautism(一^iUftlTK5F禾口舌t生白勺改变可以在孤独症涉及的病理生理机制中具有作用。)."ClinChimActa(临床化学学报)331(1-2)111-7.Yeargin-Allsopp,M.，C.Rice，等.(2003).‘‘美国大城市区域中的孤独症流行(PrevalenceofautisminaUSmetropolitanarea)."Jama289(1):49_55.Yorbik,0.,A.Sayal,^.(2002)."Investigationofantioxidantenzymesmchildrenwithautisticdisorder(患有孤独症病症的儿童中的抗氧化酶类研究)·“ProstaglmdinsLeukotEssentFattyAcids(前列腺素类脂化合物和必需脂肪酸)67(5)341-3.Zoroglu,S.S.，F.Armutcu,等.(2004).〃Increasedoxidativestressandalteredactivitiesoferythrocytefreeradicalscavengingenzymesinautism(孤独症中的红血球游离基清除酶的增加的氧化压力和改变的活性).“EurArchPsychiatryClinNeurosci(欧洲精神病学和临床神经科学文献)254(3)143-7.权利要求一种用于诊断人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态改变或确定人类受试者的ASD风险的方法，所述方法包括下列步骤a)分析从患者获得的样品以获得一种或多种精确质量的定量数据；b)将所述一种或多种精确质量的数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据比较；和c)使用所述比较，基于所述定量数据和所述一种或多种精确质量的相应数据之间的差异，诊断人类受试者关于ASD的健康状态或健康状态的改变；其中所述一种或多种精确质量在表2至10的任何一个中列出。2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种精确质量在表3至10的任何一个中列出。3.权利要求1的方法，其中所述一种或多种精确质量在表2中列出。4.权利要求1的方法，其中确定所述健康状态或健康状态改变包括确定ASD的存在或缺乏，所述受试者的生物化学ASD表型，升高的ASD风险，或ASD治疗策略对于所述受试者的基础生物化学表型的正效应、负效应、或无效应。5.权利要求4的方法，其中所述确定的受试者表型被表征为下列的任何一项a)升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；b)升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；c)升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；d)降低水平的18:IVLCFAe)降低水平的含双键的LCFA(长链脂肪酸)和VLCFA和f)其组合。6.权利要求1的方法，其中所述样品是全血，血浆，血清，或全血的亚组分。7.权利要求1的方法，其中步骤a)包括将精确质量提取到有机溶剂中。8.权利要求1的方法，其中步骤a)包括将精确质量提取到水性溶剂中。9.权利要求1的方法，其中步骤a)包括用质谱法分析所述样品。10.权利要求9的方法，其中所述质谱仪选自由下列组成的组傅里叶变换离子回旋共振，飞行时间，轨道阱(orbitrap)，四极杆质谱仪和三重四极杆质谱仪。11.权利要求10的方法，其中所述质谱仪是三重四极杆质谱仪。12.权利要求1的方法，其中所述参考样品取自非ASD受试者。13.权利要求1的方法，其中所述参考样品取自不在治疗计划上的一名或多名ASD受试者ο14.权利要求1的方法，其中所述参考样品是取自处于治疗前阶段或处于早期治疗阶段的人的一份或多份样品。15.权利要求1的方法，其中所述人类受试者基于具有下列的任何一项而诊断患有ASD升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；升高水平的DHA前体(24:5，24:6)，升高水平的DHAβ-氧化的分解代谢产物(20:6)，升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；或其组合。16.权利要求15的方法，其中，基于具有表11-18任何一个中列出的一种或多种代谢物所描述的代谢异常，其相对于来自非ASD受试者的参考样品的相应数据具有统计上显著的(P<0.05)改变，来诊断所述人类受试者患有ASD。17.一种用于诊断人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态改变或确定人类受试者的ASD风险的方法，所述方法包括下列步骤a)分析从患者获得的样品以获得下列一项以上的定量数据含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；DHA前体(24:5,24:6)；DHAβ-氧化的分解代谢产物(20:6)；含多不饱和VLCFA的磷脂；和其组合；b)将所述定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；和c)使用所述比较，基于在与从一份或多份参考样品获得的相应数据相比时具有下列特性之一，来诊断所述人类受试者关于ASD的健康状态或健康状态改变升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；升高水平的DHA前体(24:5，24:6)；升高水平的DHAβ-氧化的分解代谢产物(20:6)；升高水平的含多不饱和极长链脂肪酸的磷脂；或其组合。18.权利要求1的方法，其中所述方法用于监测ASD治疗，其中步骤b)包括将所述一种或多种精确质量的定量数据与获自从非ASD受试者收集的一份或多份参考样品的相应数据和/或与从所述患者的治疗前阶段或早期治疗阶段预先收集的定量数据进行比较；并且步骤c)包括c)使用所述比较来确定所述治疗对于所述人类受试者的生物化学效应；其中所述一种或多种精确质量在表2至10的任何一个中列出。19.权利要求18的方法，其中所述治疗是肉碱治疗。20.一种用于诊断人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态改变或确定人类受试者的ASD风险的方法，所述方法包括下列步骤a)分析从患者获得的样品以获得关于一种或多种代谢物的定量数据；b)将所述一种或多种代谢物的定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；和c)使用所述比较，基于所述定量数据和所述一种或多种代谢物的相应数据之间的差异，来诊断人类受试者关于ASD的健康状态或健康状态改变；其中所述一种或多种代谢物在表3至10的任何一个中列出。21.权利要求20的方法，其中确定所述健康状态或健康状态改变包括确定ASD的存在或缺乏，所述受试者的生物化学ASD表型，升高的ASD风险，或ASD治疗策略对于所述受试者的基础生物化学表型的正效应、负效应、或无效应。22.权利要求20的方法，其中所述确定的受试者表型被表征为下列的任何一项a)升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；b)升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；C)升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；和d)其组合。23.权利要求20的方法，其中所述样品是全血，血浆，血清，或全血的亚组分。24.权利要求20的方法，其中步骤a)包括将所述代谢物提取到有机溶剂中。25.权利要求20的方法，其中步骤a)包括将所述代谢物提取到水性溶剂中。26.权利要求20的方法，其中步骤a)包括用质谱法分析样品。27.权利要求26的方法，其中所述质谱仪选自由下列组成的组傅里叶变换离子回旋共振，飞行时间，轨道阱(orbitrap)，四极杆质谱仪和三重四极杆质谱仪。28.权利要求27的方法，其中所述质谱仪是三重四极杆质谱仪。29.权利要求20的方法，其中所述参考样品取自非ASD受试者。30.权利要求20的方法，其中所述参考样品取自不在治疗计划上的一名或多名ASD受试者。31.权利要求20的方法，其中所述参考样品是取自处于治疗前阶段或处于早期治疗阶段的人的一份或多份样品。32.权利要求10的方法，其中所述人受试者基于具有下列的任何一项而诊断患有ASD升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；升高水平的DHA前体(24:5，24:6)，升高水平的DHAβ-氧化的分解代谢产物(20:6)，升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；或其组合。33.权利要求32的方法，其中，基于具有表11-18中列出的一种或多种代谢物所描述的代谢异常，其相对于来自非ASD受试者的参考样品的相应数据具有统计上显著的(ρ<0.05)改变，来诊断所述人类受试者患有ASD。34.权利要求20的方法，其中所述方法用于监测ASD治疗，其中步骤b)包括b)将所述一种或多种代谢物的定量数据与获自从非ASD受试者收集的一份或多份参考样品的相应数据和/或与从所述患者的治疗前阶段或早期治疗阶段预先收集的定量数据进行比较；并且步骤c)包括c)使用所述比较来确定所述治疗对于所述人类受试者的生物化学效应；其中所述一种或多种代谢物在表3至10的任何一个中列出。35.权利要求34的方法，其中所述治疗是肉碱治疗。36.一种用于诊断人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态改变或确定人类受试者的ASD风险的方法，所述方法包括将来自人类受试者的样品的包括表2至10任何一个中列出的一种或多种精确质量的定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；其中所述人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态改变或ASD的风险基于在来自所述人类受试者的样品和一份或多份参考样品之间的一种或多种精确质量强度上的差异。37.权利要求36的方法，其中所述一种或多种精确质量在表3-8的任何一个中列出。38.权利要求36的方法，其中所述一种或多种精确质量在表2中列出。39.权利要求36的方法，其中所述ASD的健康状态或健康状态改变或风险的诊断包括确定ASD的存在或缺乏，所述受试者的生物化学ASD表型，升高的ASD风险，或ASD治疗策略对于所述受试者的基础生物化学表型的正效应、负效应、或无效应。40.权利要求37的方法，其中所述确定的受试者表型被表征为下列的任何一种a)升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；b)升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；c)升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；和d)其组合。41.权利要求36的方法，其中来自所述人类受试者的样品是全血，血浆，血清，或全血的亚组分。42.权利要求36的方法，其中来自所述人类受试者的样品用质谱法分析。43.权利要求42的方法，其中所述质谱仪选自由下列组成的组傅里叶变换离子回旋共振，飞行时间，轨道阱(orbitrap)，四极杆质谱仪和三重四极杆质谱仪。44.权利要求43的方法，其中所述质谱仪是三重四极杆质谱仪。45.权利要求36的方法，其中所述参考样品取自非ASD受试者。46.权利要求36的方法，其中所述参考样品取自不在治疗计划上的一名或多名ASD受试者。47.权利要求36的方法，其中所述参考样品是取自处于治疗前阶段或处于早期治疗阶段的人的一份或多份样品。48.权利要求36的方法，其中所述人类受试者基于具有下列的任何一项而诊断为患有ASD升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；升高水平的DHA前体(24:5，24:6)；升高水平的DHAβ-氧化的分解代谢产物(20:6)；升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；或其组合。49.权利要求48的方法，其中，基于具有表11-18中列出的一种或多种代谢物所描述的代谢异常，其相对于来自非ASD受试者的参考样品的相应数据具有统计上显著的(ρ<0.05)改变，来诊断所述人类受试者患有ASD。50.权利要求36的方法，其中所述方法用于监测ASD治疗并且其中一份或多份参考样品是从非ASD受试者收集的，和/或具有从所述人类受试者的治疗前阶段或早期治疗阶段预先收集的定量数据并且其中所述比较用于确定所述治疗对于所述人类受试者的生物化学效应。51.权利要求50的方法，其中所述治疗是肉碱治疗。52.一种用于诊断人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态改变或确定人类受试者的ASD风险的方法，所述方法包括将来自人类受试者的样品的包括表3至10任何一个中列出的一种或多种代谢物的定量数据与从一份或多份参考样品获得的相应数据进行比较；其中所述人类受试者关于孤独症谱系病症(ASD)的健康状态或健康状态改变或ASD的风险是基于在来自所述人类受试者样品和一份或多份参考样品之间的一种或多种代谢物强度上的差异。53.权利要求52的方法，其中所述ASD的健康状态或健康状态改变或风险的诊断包括确定ASD的存在或缺乏，所述受试者的生物化学ASD表型，升高的ASD风险，或ASD治疗策略对于所述受试者的基础生物化学表型的正效应、负效应、或无效应。54.权利要求52的方法，其中所述确定的受试者表型被表征为下列的任何一种a)升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；b)升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；c)升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；和d)其组合。55.权利要求52的方法，其中来自所述人类受试者的样品是全血，血浆，血清，或全血的亚组分。56.权利要求52的方法，其中来自所述人类受试者的样品用质谱法分析。57.权利要求56的方法，其中所述质谱仪选自由下列组成的组傅里叶变换离子回旋共振，飞行时间，轨道阱(orbitrap)，四极杆质谱仪和三重四极杆质谱仪。58.权利要求57的方法，其中所述质谱仪是三重四极杆质谱仪。59.权利要求52的方法，其中所述参考样品取自非ASD受试者。60.权利要求52的方法，其中所述参考样品取自不在治疗计划上的一名或多名ASD受试者。61.权利要求52的方法，其中所述参考样品是取自处于治疗前阶段或处于早期治疗阶段的人的一份或多份样品。62.权利要求52的方法，其中所述人类受试者基于具有下列的任何一项而诊断患有ASD升高水平的含饱和或单不饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的磷脂；升高水平的含二十二碳六烯酸(22:6，DHA)的磷脂；升高水平的DHA前体(24:5，24:6)；升高水平的DHAβ-氧化的分解代谢产物(20:6)；升高水平的含多不饱和VLCFA的磷脂；或其组合。63.权利要求62的方法，其中，基于具有表11-18中列出的一种或多种代谢物所描述的代谢异常，其相对于来自非ASD受试者的参考样品的相应数据具有统计上显著的(ρ<0.05)改变，来诊断所述人类受试者患有ASD。64.权利要求52的方法，其中所述方法用于监测ASD治疗并且其中一份或多份参考样品是从非ASD受试者收集的，和/或具有从所述人类受试者的治疗前阶段或早期治疗阶段预先收集的定量数据并且其中所述比较用于确定所述治疗对于所述人类受试者的生物化学效应。65.权利要求64的方法，其中所述治疗是肉碱治疗。全文摘要公开了用于诊断，风险评价，和监测孤独症谱系病症(ASD)的方法。更具体而言，本发明涉及人血浆中小分子(代谢物)的测量，所述小分子(代谢物)被发现在具有ASD临床表现的人和不表现ASD症状的受试者之间具有不同的多度。另外，本发明涉及关于设计用来改善与ASD有关的生物化学异常的推定治疗策略的监测。文档编号G01N33/483GK101802607SQ200880107178公开日2010年8月11日申请日期2008年7月25日优先权日2007年7月26日发明者达扬·古德诺申请人:菲诺梅诺米发现公司