专利名称：呼出的粒子的采集和测量的制作方法
技术领域：
本发明涉及在动物，特别是哺乳动物，优选人类呼吸的过程中呼出的粒子。粒子的 性质和数量能够指示某种医学状态。因此，这些粒子能够被采集，按照大小或质量被分类并 且它们可被用于一种或多种医学状态的诊断中。
背景技术：
人类呼吸道每天面对至少7-8立方米的空气，并且有一个先进的生物系统用来解 除吸入粒子和气体的毒性。第一道抵御吸入物质的防线是覆盖在整个呼吸道上的呼吸道内 衬粘液(RTLF)，其中含有几个重要的抗氧化系统。RTLF中另外一个重要成分是表面活性 剂，其含有用于减小表面张力的化合物，但也参与天然的免疫。已经显示在呼吸道炎症条件下RTLF的成分会发生改变。当RTLF中的抗氧化剂和 吸入的氧化剂之间的平衡被打乱时，氧化应激将启动炎症过程。这种炎症过程，虽然形式非 常多样，但是是在从哮喘到肺癌的大多数呼吸道疾病发展过程中的共有的主要早期事件。导致所有呼吸道疾病的病理生理过程目前还不完全清楚。其背后的一个原因是人 体内的那些过程难以监测。为了评估例如不同接触剂量的作用，现行的方法仅限于测量肺 功能、呼出的一氧化氮、诱导的痰或者对支气管肺泡灌洗(BAL)或支气管镜活检进行分析。现有的这些方法要么是过分侵入的，例如支气管镜检，因此不适用于较大规模研 究，而应确保较大规模研究对不同接触剂量的易感性是高度可变的。另外，支气管镜检和诱 导的痰还都与一定的风险相关联，特别是在敏感人群中，例如在具有先前已经存在的心肺 系统疾病或哮喘的人群中。呼出的气体中的一氧化氮似乎在很大程度上只是反映过敏性炎 症，因此当研究其他呼吸道疾病时价值有限。另一方面，宁愿肺功能对患者是无害的，但是 无法提供有关疾病的根本机制方面的信息。其他所用的方法包括体外研究，它们只能对人类呼吸道复杂的环境进行有限的概 括。同样的情况在很大程度上对动物研究也适用，其中虽然与人类基因高度一致，但是各种 基因的表达在实质上不同。最近，引入了一种新的方法，叫做呼出的呼吸气冷凝液(EBC)采集，也就是呼出的 水蒸气通过低温被冷凝，其中可以鉴别挥发性和非挥发性化合物。相信在EBC中发现的非 挥发性物质源于在呼吸道内形成的粒子。这些粒子是在呼吸、说话或咳嗽时在呼吸系统中 产生的，并且已经被人们所观察到，直到目前为止，这些粒子被研究了主要是因为它们可以 充当运输传染性物质的载体。目前还不清楚这些粒子是如何形成的，但一种似是而非的机 制可能是由于中心呼吸道中支气管的横截面积急剧减小，从而其中呼出的气体形成湍流。 第二种假设是当肺周边中的呼吸道打开时，由RTLF形成了粒子。在疾病状态下，粒子的形 成可能会因为湍流的增强和/或RTLF物理特性的改变而得到提高。在WO 02/082977中给 出了一个这样的例子。采集呼出的呼吸气冷凝液(EBC)与许多严重的方法学上的困难相关联，这些困难 例如是用水稀释会使得感兴趣物质的浓度非常低、被来自口腔中的物质高度污染、个体内的高变化系数以及存在于EBC中的挥发性物质的采样效率非常低。因此需要一种更好的非侵入性方法来检测和监控对呼吸系统的有害健康的效果。用来克服与EBC分析相关的方法学上的一些困难的一种到目前为止尚未验证的方法是直 接对呼出的粒子进行采样和分析。确定采集的粒子的数量和大小的能力也将给出有关呼吸 道状态的特定信息。不同大小的粒子级分分布的测量目前只有几篇公开发表的核查呼出的液滴(即粒子)的研究。Papineni 禾口 Rosenthal[J Aerosol Med 10 (2) 105—16]禾口 Edwards 等人[Proc NatlAcad Sci USA 101 (50) :17383_8]测量了若干浓度的人类呼出粒子，并描述了主体间 的差异很大，但是其浓度普遍远低于在典型的室内空气中测得的。也有一些关于呼出的粒 子的大小分布的资料。必须假设液滴的主要成分是水，这样粒子大小将随周围空气的相对 湿度(RH)的变化而快速变化。Papineni和Rosenthal采用的研究RH的影响的方法并不能 让人信服，因为他们用红外灯加热空气来改变RH。Edwards等人并没有在他们的研究中认 真考虑RH。粒子大小可以用间接手段，如镜检干燥的液滴或采用低尺寸分辨率的光散射方 法。因此，在这种情况下有必要对呼出气溶胶的浓度变化和大小分布作更多的研究。最近对于人类气溶胶形成的兴趣与日俱增，主要在用来检测它们的感染的可能性 的可能性范围。US 2005/0073683 和 Anal. Chem. 2005，77，4734-4741 描述了一种用于鉴别 预先形成的气溶胶粒子的实时检测方法和系统。该方法的目的在于通过将正和负质谱与也 将被开发的参考质谱比较来即时检测含有传染性物质或“威胁剂”的气溶胶。该方法并不 是为了诊断或监测人类呼吸道状态而被开发的，而且其显著低的敏感性也阻碍了对非常低 浓度的物质，例如一些呼出粒子中的物质的检测。目前还缺乏容易监测呼吸道的方法。诸如支气管肺泡灌洗和痰诱导这样的侵入性 方法对患者是有害的，并且不允许频繁采样。发明概述由于对呼出的空气中的生物标记物进行测量是非侵入性的并能够实现重复采样， 其可用于对疾病的早期检测并对疾病发展和治疗反应进行监控。这项技术已经成功地用于 挥发性物质，尤其重要地用于作为过敏性哮喘标记物的呼出的NO。非挥发性化合物是由气溶胶粒子运输的，气溶胶粒子被认为源于呼吸道上皮粘 液。这已经被我们的初步数据证实了。这些化合物可以提供有关在呼吸道中病理生理学过 程的基本的原理和特定的信息。很少有关于在呼出的呼吸气中的内源性粒子的研究。在呼 吸道中粒子形成的机制和准确位置是不清楚的，而且还没有关于粒子的化学组成的具体分 析。发展了一种对呼出的呼吸气中的粒子进行采样和分析的新技术。用于确定主体的 医学状态的方法包括下列步骤a.采集由所述主体呼出的粒子；b.依据所述的粒子质量或大小对所述的粒子进行分类，和g.分析所述粒子的化学成分，这样允许确定该主体的医学状态。此外，在该方法中还可包括如下步骤c.依据所述粒子的质量或大小对所述粒子进行分类来获得所述粒子的粒子分布谱；d.比较由所述主体呼出的粒子的粒子分布谱和参考粒子分布谱；e.记录所述主体的粒子分布谱和所述参考粒子分布谱之间的相似性和/或偏差； 并且f.将主体的和参考粒子分布谱之间的相似性和/或偏差归因于所述主体中的一 个或多个医学状态；并且任选地，
g.分析所述粒子的化学成分。所述医学状态可以选自支气管哮喘、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)J^ 质性肺疾病、结节病、在系统性疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)中的肺部负担、肺部感染例 如肺炎、细菌定居或病毒感染。所述参考粒子分布谱可从不具有给定医学状态的主体获得，并且步骤e.涉及记 录所述主体的粒子分布谱和参考粒子分布谱之间的偏差。备选地，该参考粒子分布谱来自 具有给定医学状态的病人，并且步骤e.涉及记录所述主体和所述病人的粒子分布谱之间 的相似性，导致对该主体的所述给定医学状态的诊断。本发明同样提供了一种用于提供呼出的呼吸气粒子的粒子分布谱的方法，该方法 包括下列步骤a.采集由主体呼出的粒子；和b.依据粒子的大小或质量对所述粒子进行分类以获得所述粒子的粒子分布谱。在另一种方法中，可以使用惯性冲击器(inertial impactor)依据粒子的质量对 所述粒子进行分类，或使用粒子计数器依据粒子的大小对所述粒子进行分类。该冲击器应当具有进口和出口，并且包括多个平台，安排这些平台使得包括粒子 (P)的气流(A)通过入口进入冲击器并在通过所述出口离开之前依次通过每个平台；其中通过具有孔的隔离物使每个平台与相邻平台相分隔，该孔引导气流(A)朝向 采集盘，安排每个采集盘的主面使其基本上垂直于该气流(A)的流动方向；从而，呼出的粒子以气流㈧形式穿过所述惯性冲击器；使得引导主要的气流(A) 依次朝向在每个平台中的每个采集盘；使得至少位于第一平台中的第一采集盘采集第一质 量粒子，而至少位于第二平台中的第二采集盘采集第二质量粒子。在依据粒子质量或大小进行分类后，对粒子进行分析。在从采集盘上首先冲洗 或不从采集盘上首先冲洗的情况下，通过至少一种分析技术对粒子进行分析，所述分析技 术选自飞行时间二次离子质谱(T0F-SIMS)、基质辅助的激光解吸电离质谱(MALDI-MS)、 基于标记抗体的生化检测或方案、定量的PCR分析、电子扫描显微镜(SEM)、气相色谱质谱 (GC-MS)、液相色谱质谱(LC-MS)、表面等离子体共振(SPR)、荧光光谱、TOC(总有机物含量) 分析、元素分析以及电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)。本发明同样涉及一种用于对呼出的粒子进行采集和分类的系统，该系统包括a.具有第一和第二开口的容器；b.与容器的第一开口相连接的双向接口 ；c.具有进口和出口的惯性冲击器，该冲击器包括多个平台，安排该平台使得包括 粒子(P)的气流(A)通过入口进入冲击器，并在通过所述出口离开冲击器之前依次穿过每 个平台；
其中通过具有孔的隔离物使每个平台与相邻平台相分隔，该孔引起主要气流(A) 朝向采集盘，安排每个采集盘的主面使其基本上垂直于气流(A)的流动方向；该惯性冲击器的入口被连接到所述容器的第一开口。对呼出粒子的测量和分析应满足如下要求·非侵入性·能够在人体中重复测量·遵循肺部的各种病理生理过程，包括抗氧化系统、蛋白表达、脂质模式的变化以 及粒子大小和浓度的差异的动力学。·用于非侵入性地鉴别用于诊断或监控疾病的新生物标记物的平台，所述疾病包 括a)呼吸道疾病例如ο 哮喘ο慢性阻塞性肺疾病ο间质性肺疾病ο 肺癌ο呼吸道感染ο系统性疾病例如系统性红斑狼疮SLE、硬皮病和风湿性关节炎中的肺部负担。b)系统性疾病例如ο心脉管疾病ο糖尿病ο新陈代谢综合症ο高胆固醇血症 监测插管病人·监测接触·鉴别药理学治疗的新靶标·鉴别对于某种接触或疾病具有增加的遗传易感性的个体附图的简要说明
图1举例说明依据本发明的惯性冲击器；图2举例说明用于采集呼出的粒子的系统；图3显示来自一个对照主体的粒子斑的正(图3A)和负(图3B) TOF-SIMS光谱；图4是具有来自一个对照主体的呼出粒子的一个斑点的TOF-SIMS图；图5显示呼出粒子(0. 5-2. Oym)的浓度和时间的关系图；图6显示在对健康主体和患有哮喘或囊性纤维化主体的先导研究中的比值 (CN+CNO)/POf ；优选实施方案的详细描述在第一实施方案中，本发明涉及一种确定主体的医学状态的方法。词“确定”以其最广的范围来理解；也就是对医学状态的存在(定性)和/或程度(定量)进行评估。此 外，“确定”也指通过对主体可能具有的任何易感性的确定以获得给定医学状态。术语“医学状态”不应当局限地仅仅理解为疾病或障碍。它同样涉及以非诊断方式对健康主体的医学状态的研究，例如下列情形-处于药物治疗或药品影响下(例如麻醉测试)，亦如接触化学物质(例如污染 物、职业危险物)的主体；-参与锻炼或健康项目的主体(例如确定主体的体质或健康)；-健康主体，其具有发展为某种疾病或障碍的易感性；-健康主体，其可能发展成某种疾病或障碍，或者对特定接触具有更少耐受力的遗 传易感性。可以被应用本发明方法的主体为动物，特别是哺乳动物，尤其是人类。主要参考人 类描述本发明。在第二实施方案中，本发明提供了一种用于提供呼出的呼吸气粒子的粒子分布谱 的方法。在本发明的两种方法中的第一步骤均涉及采集由主体呼出的粒子。单次呼气就可 提供足够数量粒子，但通常需要从多次重复呼气中采集粒子。比如，在对人类医学状态进行 诊断时，可从持续一段时间的连续的吸气/呼气中采集粒子，这段时间包括至多数十分钟， 例如，1秒到100分钟，如1秒到50分钟，5秒到20分钟或10秒到5分钟的单次呼气。通过改变呼气方式，也可能从呼吸道的不同部位采集代表性的粒子。与其中假设 通过从呼吸道的最远端打开的呼吸道中形成了更多粒子的正常呼吸相对照，在某些较为中 心的呼吸道中，当呼吸道狭窄时受迫的呼气增加了湍流，并因此增加了粒子的产出。在采集后，根据粒子的大小或质量对粒子进行分类。可以使用粒子计数器用来对 个别粒子进行计数，并因而提供了粒子的数量-大小分布。可以通过假定球形粒子和密度 来计算质量分布。随之而来的是对采集到的非挥发性物质的高等化学分析(如下详细描 述)O依据粒子的质量或大小对粒子进行分类可以提供所述粒子的粒子分布谱。粒子分 布谱是在呼出的空气中某一特定质量或数量(或质量或大小范围)的粒子怎样存在的量 度，其同样可以用来确定主体的医学状态。本文中出现的粒子是指经常悬浮在气体中，通常 悬浮在但不必要悬浮在空气中的固体、液体和液体包裹的固体物体。物体大小通常但不必 要大于0. 005微米并通常但不必要小于15微米。而大小应当是指空气动力学直径或电迁 移直径，合适地为空气动力学直径。图1显示了用于采集呼出的粒子(在图1中显示为P)的惯性冲击器10。冲击器 10是具有入口 12和出口 14的容器，气体和呼出的粒子通过该入口进入该冲击器10，并且 气体和呼出的粒子通过该出口离开冲击器10。举例说明的图1中的该冲击器10为圆柱形， 具有在圆柱形的相对圆形表面上的入口 12和出口 14 ；尽管如此，入口和出口 12、14也有可 能为其他的几何形状或设计。冲击器10包括多个平台20、30、40、50。图1举例说明了 4个平台20、30、40、50，
而已知具有从2到15个平台的冲击器。具有粒子(P)的主要气流(A)通过入口 12进入冲击器10并在通过出口 14离开冲击器10之前依次穿过平台20、30、40、50。该主要气流(A) 包括由主体呼出的空气和粒子。流动是由连接到冲击器出口的泵产生的。依据本发明，通 常呼出气体和粒子在离开主体和进入冲击器之间没有被改变过。由隔离物21、31、41、51将每个平台20、30、40、50与相邻平台分隔开。每个隔离物具有至少一个孔22、32、42、52(实践中，在每个隔离物中存在多个孔)，该孔引导所述气流(A)朝向采集盘33、43、53。安排每个采集盘33、43、53的主面使其基本上垂直于所述气流 (A)的流动方向。使用的采集盘33、43、53具有大约Imm的厚度并且是具有10_12mm边长的正方形。 通过双面带将所述盘固定在位于通过管嘴的气流出口处的基质固定器上。该盘由天然硅制 成，因为这对于此后的分析是有利的。所述盘必须非常的干净，因为微量杂质会干扰后面的 粒子分析。可以通过多种方式清洁硅盘，优选地在有机溶剂中通过超声清洗，然后通过紫外 线臭氧处理，或通过浸入1-10%的硝酸或过氧化氢中进行。在清洁后，可针对采集和此后的化学分析进一步优化采集盘表面的准备。通过变 化采集盘的亲水性或其他表面化学性质，以友好的方式控制了粒子和表面之间的相互作 用。优选地，该采集盘的整个表面被修饰。疏水性的采集表面，相比较于亲水性表面，将会 更强烈地结合疏水性部分例如脂质分子的烃链。正常的亲水性硅表面可通过表面覆盖一薄 层疏水性物质例如甲基硅烷或在硅基底上覆盖一层金，然后在金上施加一单层甲基封端的 硫醇衍生物而实现疏水化。相似地，可使采集表面特异性地结合某种分子。通过在采集盘 表面覆盖一层针对上述相关蛋白的抗体，可使特异性的蛋白与采集板表面结合。通过采用 适合的试剂，该被分析物质的结合可引起颜色变化或发出荧光，而这些能够在原位实时地 探测。通过电测量由被分析物结合到采集盘表面而引起的电流或电容的变化也能够实现原 位检测。在该情况下，采集盘还要具有必要的能实现这种测量的电连接。所述冲击器可包 括必要的电连接，该电连接与采集盘表面上适宜的连接器接触。粒子具有惯性，因此当在第一采集盘33处偏转后不再跟随空气流，将会冲撞采集 盘33，而具有更小惯性的粒子将会继续到下个平台40。粒子的惯性依赖于它的质量，而质 量反过来取决于它的大小。通过这种方式，得以实现粒子质量或大小的分离。这样通过在每个阶段选择每个平台中孔的数量、孔的直径和从孔到采集盘的距 离，可能实现气溶胶中粒子的大小或尺寸的分离。具有高惯性即大质量/尺寸的粒子被分 离在前部平台上，而具有小惯性即小质量/尺寸的粒子将撞击在后面的平台上。通过选择 孔的形状，可能以适合于此后化学分析的形式浓缩采集的物质。与呼出的空气或呼吸气浓 缩物相比，采集盘上物质浓度的增加是可观的。在本案中，使用修饰的3平台Dekati PM10。修饰由下列组成以系数2减小第三 平台管嘴的数量，以系数1. 5增大冲击器的设计流速。原始冲击器是每分钟10公升的形式的，其是在15公升每分钟的流动速下运行的。 最后一个平台的20个孔被减少为10个，由此以系数2增大了每个管嘴中的气流速度。对 于这3个平台50%截止的尺寸[即，该尺寸的粒子数的一半被采集而另一半仍继续。这不 会显示出阶梯形采集特征，而是“S-样”特征]分别为7、1. 5和0. 5 μ m。如上文中描述的采集盘的表面功能块，可被小型化，以实现在每个管嘴处不同的 功能化，从而方便地优化平行采集不同的被分析物。相似地，通过其中给在管嘴出口处的采 集盘提供了恰当的表面功能块和/或电连接的采集盘芯片，实现了对特定物质的平行的原 位光或电探测。冲击器被设计以尽可能高效的方式采集呼出的粒子。这意味着实质上所有在给定 质量/大小区间内的呼出的空气中的粒子，都被采集用于分析。这些粒子以适于高等化学分析的浓缩的形式被回收。本发明同样提供了一种对呼出的粒子进行采集和分类的系统100，该系统包括a.具有第一开口 112和第二开口 113的容器114 ；b.连接到容器114的第一开口 112的双向接口 110 ；c.具有进口 12和出口 14的惯性冲击器10，所述冲击器10包括多个平台20、30、 40,50...，这些平台被布置为使得包括粒子(P)的气流(A)通过入口 12进入冲击器10，并 在从该出口 14离开冲击器10之前依次穿过每个平台20、30、40、50...；其中通过具有孔22、32、42、52...的隔离物21、31、41、51...使每个平台20、30、 40,50. · ·与相邻平台相分隔，该孔引导主要的气流(A)朝向每个采集盘33、43、53...，安排 每个采集盘33、43、53...的主面使其基本上垂直于气流(A)的流动方向；该惯性冲击器的 入口 12被连接到上述容器114的第一开口 112。可以如图2中举例说明的那样设立采集系统。系统的较大部分位于恒温室120中。 需要呼出粒子的个体通过双向接口(110)吸入室内空气。吸气后，吸入的空气(A)穿过位 于所述接口之前的高效粒子过滤器(125)。将接口(110)保持在一定温度，使得呼出的气溶胶的大小分布不会因为水蒸汽的 蒸发或冷凝而改变。呼出的空气㈧通过接口(Iio)进入位于恒温室(120)中的系统，这同 样也是为了保持气溶胶的大小分布的目的。在室内放置了用于呼出气体的容器(114)。此 夕卜，将粒子计数器(116)连接到容器(114)的第一开口(112)以计算和测量粒子大小。用 于采集粒子(P)的惯性冲击器(10)也被连到容器的第一开口(112)。穿过冲击器(10)的流动典型地是通过泵(115)保持的，所述泵位于恒温室的外 面。图2同样显示了气体排放(130)并且加入了潮湿的不含粒子的气体(135)。能够测量数量-大小分布的粒子计数器(116)提供了额外的重要信息。这里 使用的粒子计数器是Gri_ 1.108光学粒子计数器(Gri_ AerosolTechnik, Ainring, Germany)，能够计数以及对从0. 3到20微米之间的15个尺寸区间的粒子的大小进行测量。 该仪器可提供所测量的气溶胶的数量大小分布或从所测量的数量大小分布计算所得的质 量分布。在该仪器中，充满粒子的空气以一种方式从小的、精确限定的、高强度照射的体积 中穿过，使得每次只有一个粒子被照射。被照射的粒子产生散射光脉冲，其强度被测量。由 于散射光的强度取决于粒子大小，因此可以在气流中来对粒子计数并测量其大小。当呼出气流穿过相连的冲击器(10)和粒子计数器(116)而流动时，所述容器 (114)作为缓冲器，呼出的空气体被存储在其中。当没有呼气发生时，该容器(114)给冲击 器(10)和粒子计数器(116)提供空气。潮湿的不具有粒子的空气从容器(114)的第二开口 (113)加入，使得总是存在正排放流动。该流动通过位于容器(114)排放端的流量计(119) 来测量。通过以图像方式呈现实时流动，主体可以根据指示控制自己的呼吸频率和强度。通过下述方式进行采样。假定冲击器装有干净采集盘，而系统，尤其是冲击器已经 达到了所需要的温度。首先流量计被归零以允许正确测量流动，然后潮湿的干净空气流量 被设定在一定值，使得在测量期间保持正的来自系统的流量。然后该冲击器流量被设定在 低于该干净空气流量的值，在该过程期间，在盘上将不会收集到沉淀，因为给该系统供给了 干净的不含粒子的空气。然后，启用光学粒子计数器并检查没有假的粒子存在，例如，指示 泄漏进入系统中。然后开始呼气到该系统中，粒子计数器连续不断地每6秒就抽取样本并产生大小分布，同时冲击器采集样本以用于之后的分析。当已经获得了所需数量的样本时，就终止采集，记录采样时间和呼出的体积。关闭通过冲击器的流体，将冲击器从测量系统上 移开，并回收装载的盘。在系统的两个组件是“相连的”的表述中，应当将其理解为空气和呼出的粒子可在 两个组件之间流动。连接通常是采用管和合适的接头、阀或密封件形成的，以引导气体/粒 子流。该系统能够实现的一种可能性是在不同的呼出速率下对不同级分中的粒子形成 进行量化。这是一种非常简单的用来探测湍流，例如哮喘中的湍流的方法，而且可被用作疾 病的标记物。分析所述采集盘23、33、43、53以及它们相关的粒子P可以被从冲击器10中取出，并且 可以分析上述粒子的化学成分。粒子P的化学成分提供对主体的医学状态的洞察(如下文 中医学状态部分描述的)。在一种分析策略中，对仍然位于采集盘上的粒子进行分析。这种方法是通过如下 的化学分析技术完成的，这种技术提供了有关在粒子中出现的特定物质的互补信息。飞行 时间二次离子质谱仪(T0F-SIMS)对于分析质量至多在IOOOu的物质尤其有用，尤其是各种 不同类型的脂质，其谱可随各种医学状态而改变。基质辅助激光解吸电离质谱(MALDE-MS) 对于分析与炎症反应相关的肽和更大的大分子(各种蛋白)是合适的方法。通过应用将 会把蛋白质解离为能够被测定的片段的蛋白水解酶、优选胰蛋白酶，可进一步方便对蛋白 进行MALDI-MS鉴定，并且通过与公开的可用数据库进行比较，其可用于结论性的蛋白质鉴 定。对特定蛋白或其他生物分子(例如DNA)的分析可同样通过将基于标记抗体的不同生 物化学分析或实验方案直接应用在采集盘上来完成。扫描电镜(SEM)可以被用于对采集的 粒子聚集物的形态进行分析。这样的分析能够揭示非生物来源的粒子，例如由于主体接触 而产生的粒子。在另一分析策略中，将采集的物质从采集盘上除去(冲洗)。可进一步加工包括采 集粒子的冲洗溶液以用于不同的化学或生物化学分析技术。在最简单的分析中，可以采用 TOC (总有机成分)分析器来分析采集的粒子中有机物质的总量。使用不同元素分析器以获 得采集物质中碳、氮、氧和硫的含量，其本身又反映了不同类生物分子(脂质、碳水化合物、 蛋白)的相对量。通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)可以测定痕量的无机元素，尤其 是金属的量。这样的分析将不仅提供关于非生物来源的物质的信息，而且也可用来检测在 特定疾病状态下重要的含有金属的生物分子(蛋白)例如铁-反应蛋白(IRP)。已经显示 在肺肿瘤组织中Cu和Zn增加了，并均在气路中显示出调控炎症反应的重要性。对于更多 生物分子的特异性分析，三种技术气相色谱质谱(GC-MS)、液相色谱质谱(LC-MS)和直接的 MALDI-MS将会提供互补的信息。GC-MS将会提供关于在至多约500u的质量范围内的半挥 发性物质的信息。LC-MS将会提供有关不同生物分子，例如脂质、肽和蛋白以及其修饰的定 量和定性信息。最后，直接的MALDI-MS可以被用于至多为几个IOOOOu的生物分子的模式 检测，允许你对脂质和蛋白谱两者进行检测和鉴定。也可对采集和冲洗的物质进行生物化 学分析，特别是对于特定感兴趣蛋白的标记抗体，或者进行定量PCR分析，用于分析遗传物 质。
有几种技术用来方便样本处理并提高方法的灵敏性。在该方法中已经呈现出的一个优势是使用表面解吸质谱技术来直接分析取自冲击器的采集盘的可能性。另一优点是直 接在采集盘上净化并修饰样本，例如上述提到的酶，这被称为盘上消解。也可在采集盘上创 造不同类型的表面，为了直接结合或修饰粒子样本中的特定被分析物，所述采集盘已经被 受体分子或酶共价修饰。这些方法是公知的并能够被容易地使用在有机实验室中。这将可 观地加速分析过程，并使得对大的病人组的研究变得切实可行。在通过质谱方法鉴定新的生物标记物后，可以引入新的分析仪器，例如表面等离 子体共振(SPR)和荧光光谱以便更容易地将所述分析放大到更大的群体组。这两种方法更 容易被非专业人员使用，其使得在医院或健康看护中心实施粒子采集方法变得更加可行， 并使得对大的病人组的研究更有时间效率。能够使用直接来自冲击器的采集盘是非常有利 的。上述提到的不同的质谱(MS)技术具有不同的优点，它们提供了有关采集的粒子 的组成的总括的信息。这意味着通过组合不同的MS技术，以非预定的方式可以检测绝大部 分的生物分子。这与那些只能检测预先选择的或标记的物质的许多其它生化分析技术形成 对照。因此本发明的方法和MS技术的相容性是鉴别不同疾病的新的特异性生物标记物的 一个重要优点。将粒子的分析与对照化学分析进行比较，可以鉴别与对照化学分析的偏差和/或 相似性。这可以被用于确定主体的一个或多个医学状态。对照化学分析可以来自具有某种 医学状态(在这种情况下寻找化学分析中的相似点)或不具有某种医学状态(在这种情况 下寻找化学分析中的偏差)的主体，或者来自主体本身，不定期在不同的环境下取得(例 如，在另一时间点，或在某个治疗或练习过程后)。通过在每个采集盘上对粒子分类来确定粒子分布谱。获得的粒子分布谱可以被用 来确定主体中的一个或多个医学状态。如果将要作出诊断，则将由该主体呼出的粒子的粒 子分布谱与参考粒子分布谱进行对比。记录主体的粒子分布谱与参考粒子分布谱的相似性 和/或偏差，并将主体的粒子分布谱和参考粒子分布谱之间的相似性和/或偏差归因于主 体的一个或多个医学状态。该参考粒子分布谱可以是来自不具有给定医学状态的主体的粒子分布谱。在该案 例中，可以记录主体的粒子分布谱与参考粒子分布谱之间的偏差，提供了有关某种医学状 态的指征。该参考粒子分布谱备选地来自具有给定医学状态的主体。可以记录主体与病人的 粒子分布谱之间的相似性，导致对在主体中所述给定医学状态的诊断。该参考粒子分布谱同样可来自主体本身，但在不同情形下获取(例如，在另一时 间点，或在某个治疗或练习过程后)。这将允许通过本发明的方法监测医学状态。医学状态可 以通过本发明确定或监测的医学状态包括-支气管哮喘-囊性纤维化-慢性阻塞性肺疾病(COPD)-肺癌_间质性肺疾病
_结节病_在系统性疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)中的肺部负担。-肺部感染ο 肺炎ο细菌定居ο病毒感染似乎其他系统性医学状态也可以被监控例如-心力衰竭(例如内皮素-1)
_高胆固醇血症(在呼出粒子中发现胆固醇)_糖尿病(在粒子中发现胰岛素)-新陈代谢综合症-对疾病或接触增加的遗传易感性所述粒子可以包括或由指示特定医学状态的生物标记物组成。依据本发明的方法 允许检测这样的生物标记物。人们认为呼出的粒子源自于覆盖整个呼吸道上皮细胞的呼吸道上皮粘液(RTLF) [Pediatr Allergy Immunol 15(1) :4_19]，其含有大量的抗氧化剂和表面活性剂。人们也 应当谨记从气管的近端到末端RTLF的组分发生变化。丰富地存在于RTLF中的一种物质是克拉拉细胞蛋白16(CC16)，也作为一种由克 拉拉细胞产生的抗炎症蛋白而发挥作用。到现在为止，已经只在BAL和血液中测量了 CC16。 迄今为止赢得关注的其他物质是表面活性蛋白A-D，其同样仅在支气管肺泡灌洗BAL中被 检测。受到特别关注的是探测和监测粒子中的抗氧化剂的浓度。一种可能的生物标记物 是在呼吸道中以高丰度存在的谷胱甘肽。其他在呼出液滴中作为可能的生物标记物的抗氧 化剂是结合金属的蛋白血浆铜蓝蛋白和铁传递蛋白，这些有可能采用基质辅助激光解吸电 离质谱(MALDI MS)测量。其他具有低分子量的潜在的抗氧化剂，例如抗坏血酸盐、α-生 育酚、尿酸盐以及L-半胱氨酸，同样有可能采用质谱方法来检测，这些分子同样是氧化应 激的生物标记物。作为抗氧化剂直接参与氧化应激的潜在的生物标记物是谷胱甘肽、血浆铜蓝蛋 白、铁传递蛋白、抗坏血酸盐、α-生育酚、尿酸盐以及L-半胱氨酸。谷胱甘肽尤其令人关 注，因为，其在呼吸道中高度丰富地存在。用于探测这些抗氧化剂的分析方法是质谱。a.脂质RTLF中的磷脂谱可作为疾病的生物标记物。已经在大多数呼吸道疾病中看到了 磷脂成分(PC)的改变，例如在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、囊性纤维化以及哮喘中。 在哮喘中，在BAL中PC减少了，并且已经显示在过敏原刺激后PC/磷脂酰甘油(PG)之间的 关系发生改变。在呼吸道疾病中新的正在形成的研究领域还有脂质的硝化和氧化，这可以改变它 们的功能。RTLF中的表面活性剂，包括磷脂和蛋白，被认为在天然免疫系统中起重要作用。磷 脂是在天然免疫中活性的多种细胞因子例如前列腺素、凝血氧烷、嗜酸细胞活化趋化因子(extaxins)、脂氧素、溶解素(resolvins)等的前体。同样也显示表面活性蛋白在天然免疫、以及其他作为抗原呈递细胞发挥作用的事情中和控制细胞死亡中扮演重要角色。关于 表面活性剂的新陈代谢的知识到现在为止都非常有限，但对于理解呼吸道疾病的发病机理
非常重要。使用TOF-SIMS对硅采集盘的表面分析已经揭示了在呼出粒子中广泛的磷脂。在 粒子中检测到的磷脂与在BAL研究中在RTLF中发现的磷脂一致。磷脂的相对量同样和BAL 一致。磷脂的相对量同样和BAL—致。在患有哮喘和囊性纤维化的病人中CN-+CN0-(假定 主要来自蛋白和肽的片段)与P03-的比值升高了。该比值可以反映由于呼吸道疾病，血浆 蛋白渗漏到气室中。b.蛋白质和肽对支气管灌洗样本的蛋白质组学分析发现了在样本中存在多种蛋白质。这项分析 是使用二维凝胶和质谱进行的。蛋白参与了其中的免疫应激过程、细胞生长、氧化剂-抗氧 化剂以及蛋白酶-抗蛋白酶系统以及具有未知功能的蛋白质。例如，已经针对过敏性哮喘 病人进行了 BAL的蛋白质组学研究。在该项研究中，在病人中鉴别出1592种蛋白，其中有 160种蛋白的表达与对照组有差异。最丰富的蛋白是血浆蛋白，其可能源于来自气血屏障的 扩散。血浆蛋白的增多可能由于渗出或损伤。很可能的是在BAL中检测出的几种肽和蛋白 也存在于呼出的粒子中。在呼吸道中作为疾病的生物标记物的肽和蛋白包括内皮素-1、白细胞介素_4、干 扰素-g、表面活性蛋白A-D和克拉拉细胞蛋白16等。能够采用电喷雾质谱ESI-MS和电离 质谱方法MALDI-MS或通过免疫检验检测这些分子。在本发明中有很高的概率将会检测出 更多类型的生物标记物，因为收集粒子比使用呼出的呼吸气冷凝液效率更高，在后者中收 集了较小数量的粒子。使用诸如胰岛素这样的蛋白水解酶对采集的样本进行处理，将产生 几个肽片段，这些片段将形成一个模式，其对于某个特定的蛋白组是独特的。对蛋白的翻译后修饰例如磷酸化和糖基化的研究也可是生物标记物的潜在目标。 已知错误的磷酸化模式是几种疾病的一部分。在呼吸道中的另一类重要生物标记物是粘蛋白糖蛋白，其有助于粘膜纤毛保护呼 吸道免受病原体和环境毒素侵害的防御。对于患有哮喘、慢性阻塞性肺病COPD和囊性纤维 化的患者，存在着粘蛋白糖蛋白的过表达。尽管由于糖蛋白的多样化的糖基化模式，对糖蛋 白的分析有一些困难，但是追踪这组化合物还是很有价值的，因为它们与不同的呼吸道疾 病有关。在分析糖蛋白时的一个优点是它们很容易用亲和色谱法进行提纯。而且可能在观 测的蛋白糖基化模式中的变化将和疾病有关，因此应考虑将其作为潜在的生物标记物。c.细胞物质和基因表达很可能呼出的粒子含有细胞或者细胞结构，这些细胞或细胞结构含有携带遗传信 息的物质，特别是DNA和RNA。这些细胞物质可能来自细菌、病毒或呼吸道的细胞。对该物 质的遗传表达的分析可以提供有关诊断特定疾病的病理学的新信息，或者被用作为诊断某 些疾病的高度特异性的并且高敏感的工具。因此该方法能够被用于鉴别在诸如肺炎和慢性 阻塞性肺病COPD的恶化等疾病中的病原体，还能被用于对例如在经常是临床问题的囊性 纤维化的定居的铜绿假单胞菌早期检测中。d.金属
在EBC中跟踪对金属例如铁、镉、铅、铝、铜的接触也已经是可能的。金属最有可能被运输到与呼出的粒子结合的EBC上。这暗示这种方法同样具有监测接触空气污染的各种 成分，例如铁、锌、镉或铝的可能性。与周围纳米粒子中的金属接触也已经被与呼吸道疾病 的发展相关联。
实施例将来自四个健康主体的呼出的粒子采集在硅晶片上。利用光学粒子计数器(Grimm 1. 108)记录了粒子的浓度。为了获得高粒子产量，进行了受迫的呼气(使用鼻夹)。训练 主体以进行重复的不间断呼气，其对应于在1秒内主体个体最大受迫呼气容量(FEVl)的 80%。可以接受距离目标流量10%的偏差。在第1天早晨在15分钟内进行采样，并在第2 天以相似的方式重复采样。通过飞行时间二次离子质谱(TOF-SIMS IV IONTOF GmbH)分析在硅晶片上呼出的 粒子的化学组成。使25keV Bi3+ —次离子在围绕粒子的斑为中心的面积为500 X 500 μ m2的 区域上进行光栅化。采用针对最大分辨率优化的仪器来记录正负二次离子的质谱。来自全 部的分析区域或来自选定感兴趣区域的光谱以及所选离子的图像都是采用仪器软件从记 录的原始数据文件中提取的。通过与来自纯物质和来自其他质谱方法的公开数据的对照光 谱相比较来确定光谱中峰的归属，也可通过与理论同位素模式相比较来控制该归属。确定 的峰的相对强度是通过在各自的光谱上对总粒子强度进行归一化来计算出。图3显示来自一个对照主体的粒子斑的正(图3A)和负(图3B) TOF-SIMS光谱。图4是来自一个对照主体的呼出粒子的一个斑的TOF-SIMS图。图5显示呼出的粒子(0. 5-2. Oym)的浓度和时间的关系图。图6显示在对健康主体和患有哮喘或囊性纤维化病人的先导研究中的比值 (CN+CNO)/PO3^表1.呼出的粒子的TOF-SIMS光谱峰的m/z比例值的归属。磷脂分子种类被称为 x:a，其中χ代表碳原子数，a代表双键的数目。正离子负离子归属m/z 归属 m/z磷酸胆碱离子 184 C16:l 253胆固醇-OH369 C16:0 255PC 片段476 C18:l 281PC 片段478 C18:0 283PC 片段494 PA32 1 645PC 片段522 PA32 0 647PC 片段524 PG 28:1 663PC 片段650 PG 28:0 665PC 28 0+H 678 PG34:2 671PC 片段680 PA34:1 673PC 30:0+H 706 PG32:0 721PC 32:1+H 732 PG34:1 747
PC 32:0+H 734 PG36:2 773PC 34:1+H 760 PG36:1 775PC 34:0+H 762 PI34:2 833PI34:1 835PI36:2 861PI36:1 863表2. 15分钟采样期内的总呼出体积和平均呼出粒子(0. 5-2. Oym)浓度主体1主体2主体3主体4FEV14. 1 FEV12.8 FEV13. 2 FEV13. 2第1天第2天第1天第2天第1天第2天第1天第2天体积(公升)153128 176 181 142 144 201 166粒子/ 公升 210 123 149 55 956 343 239 180所有的粒子样本均给出来自磷脂的强烈信号(图2和4以及表1)。以正离子模式 的不同种的磷脂酰胆碱(PC) 了呈质子化或碱金属阳离子化的分子离子形式的不同种的磷 脂酰担碱(PC)，而以阴离子模式检测了呈去质子化离子形式的磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌 醇(PI)和磷脂酸(PA)，表1。磷脂的组成与先前在支气管肺泡灌洗(BAL)液中发现的相一 致，这指示呼出的粒子最有可能源自于下呼吸道。实施例2.培训主体使其进行重复的连续呼吸，该呼吸对应于在1秒内主体个体最 大受迫呼出容量(FEVl)的80%。让四名健康的志愿者、四名哮喘病人和四名患有囊性纤维 化的病人分别进行10次受迫呼气。将大小在0.5-2. Oym的呼出粒子采集在硅晶片上。光 学计数器实时地测量粒子的浓度。在取样前施加3分钟的不含粒子气体的呼吸气的冲洗阶 段。使用飞行时间二次离子质谱(T0F-SIMS)来分析硅晶片。在粒子中检测到几个类别的 磷脂磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)。在组之间观察 到一些差别。与对照组相比，在哮喘病人以及患有囊性纤维化的病人中PC信号总量和PG 信号总量的比例倾向于升高了。同样，与对照组相比，与哮喘病人和患有囊性纤维化的病人 样品中的磷脂相比，已知特征性的蛋白和肽(CN0_)的信号升高了(图6)。实施例3.主体在20分钟内进行受迫呼气。将大小在0.5-2. Ομπι的呼出粒子收集在硅晶片上。使用荧光试剂DAPI (4，6- 二脒基2-苯基吲哚对硅晶片染色)，该试剂强烈 地结合到DNA和RNA上。在粒子斑中获得了强烈的信号，指示呼出的粒子含有核酸。实施例4.两个主体呼出150L空气两次；一次用于采集粒子，另一次用于呼吸气冷 凝液采集。从硅晶片上解收呼出的粒子，并且将呼吸气冷凝液浓缩，然后通过ELIZA分析表 面活性蛋白Α。在呼出的粒子中表面活性蛋白A(SpA)的总量比在呼出的呼吸气冷凝液中测 得的要高6倍，并且比在100 μ L血清中的要高4倍。在检测(对两个主体在三种不同情况 下测试CV 5.4)时，对Sp A的分析显示了高的个体内的重复再现性。开发的采样方法对于在呼出的气体中检测新的生物标志物以及监测呼吸道疾病 具有高的潜力。
权利要求
一种用于确定主体的医学状态的方法，所述方法包括下列步骤a.采集由所述主体呼出的粒子；b.依据所述粒子的质量或大小对所述粒子进行分类，g.分析所述粒子的化学成分，这样允许确定该主体的医学状态。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括下列步骤a.依据所述粒子的质量或大小对所述粒子进行分类来获得所述粒子的粒子分布谱；b.比较由所述主体呼出的粒子的粒子分布谱和参考粒子分布谱；c.记录所述主体的粒子分布谱和所述参考粒子分布谱之间的相似性和/或偏差；d.将主体的粒子分布谱和参考粒子分布谱之间的相似性和/或偏差归因于所述主体 中的一个或多个医学状态；并任选地，e.分析所述粒子的化学成分。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的医学状态选自支气管哮喘、囊性纤维化、慢性阻 塞性肺疾病(C0PD)、间质性肺疾病、结节病、在系统性疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)中的 肺部负担、肺部感染例如肺炎、细菌定居或病毒感染、心力衰竭(例如内皮素-1)、高胆固醇 血症(在呼出粒子中发现胆固醇)、糖尿病(在粒子中发现胰岛素)、新陈代谢综合症、对疾 病或接触增加的遗传易感性。
4.根据权利要求2的方法，其中所述的医学状态选自支气管哮喘、囊性纤维化、慢性阻 塞性肺疾病(C0PD)、间质性肺疾病、结节病、在系统性疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)中的 肺部负担、肺部感染例如肺炎、细菌定居或病毒感染。
5.根据权利要求2或4中任一项的方法，其中所述参考粒子分布谱是从不具有给定的 医学状态的主体获得的，并且步骤e.涉及记录主体的粒子分布谱和参考粒子分布谱之间 的偏差。
6.根据权利要求2或4-5中任一项的方法，其中所述参考粒子分布谱来自具有给定医 学状态的病人，并且步骤e.涉及记录所述主体和所述病人的粒子分布之间的相似性，导致 确定所述主体中的所述给定的医学状态。
7.一种用于提供呼出的呼吸气粒子的粒子分布谱的方法，该方法包括下列步骤a.采集由主体呼出的粒子；并且b.依据所述粒子质量或大小对所述粒子进行分类以获得所述粒子的粒子分布谱。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中使用惯性冲击器(10)根据粒子的质量 对粒子进行分类。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述冲击器(10)具有入口(12)和出口(14)，该 冲击器(10)包括多个平台(20、30、40、50…)，安排所述平台使得包括粒子(P)的气流(A) 通过入口(12)进入冲击器(10)并在通过所述出口(14)离开冲击器(10)之前依次穿过每 个平台(20、30、40、50…)；其中通过隔离物(21、31、41、51…)使每个平台(20、30、40、50…)与相邻平台相分隔， 该隔离物具有孔(22、32、42、52…)，所述孔引导所述气流(A)朝向采集盘(33、43、53…)，安 排每个采集盘(33、43、53"0的主面使其基本上垂直于所述气流(A)的流动方向；从而，呼出的粒子以气流(A)形式穿过所述惯性冲击器(10)；使得引导主要的气流(A)依次朝向每个平台(20、30、40、50…)中的每个采集盘(23、33、43、53…)；使得至少位于第 一平台(30)中的第一采集盘(33)采集第一质量的粒子，而至少位于第二平台(40)中的第 二采集盘(43)采集第二质量的粒子。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中使用粒子计数器(116)根据粒子大小 对粒子进行分类。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，在依据粒子质量或大小进行分类后， 在从采集盘上首先冲洗或不从采集盘上首先冲洗的情况下，通过至少一种分析技术对粒子 进行分析，所述分析技术选自飞行时间二次离子质谱(TOF-SIMS)、基质辅助的激光解吸 电离质谱(MALDI-MS)、基于标记抗体的生化检测或方案、定量的PCR分析、扫描电子显微镜 (SEM)、气相色谱质谱(GC-MS)、液相色谱质谱(LC-MS)、表面等离子体共振(SPR)、荧光光 谱、TOC(总有机物含量)分析、元素分析以及电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)。
12.一种用于对呼出的粒子进行采集和分类的系统(100)，该系统包括a.具有第一开口(112)和第二开口 (113)的容器(114)；b.连接到所述容器(114)的第一开口(112)的双向接口(110)；c.具有进口(12)和出口 (14)的惯性冲击器(10)，该冲击器(10)包括多个平台(20、 30、40、50…)，安排所述平台使得包括粒子⑵的气流㈧通过入口(12)进入冲击器(10)， 并在通过所述出口(14)离开冲击器(10)之前依次穿过每个平台(20、30、40、50…)；其中通过具有孔(22、32、42、52…)的隔离物(21、31、41、51…)使每个平台(20、30、 40,50···)与相邻平台相分隔，该孔引导主要气流(A)朝向采集盘(33、43、53…)，安排每个 采集盘(33、43、53···)的主面使其基本上垂直于气流(A)的流动方向；该惯性冲击器的入口 (12)被连接到所述容器(114)的第一开口(112)。
13.根据权利要求12所述的系统(100)，其中每个平台(20、30、40、50…)包括适用于 探测被分析物的采集盘(33、43、53…)，其与其它平台(20、30、40、50…)中的采集盘(33、 43、53…)不同。
14.一种适用于权利要求12或13的系统(100)中的采集盘(33、43、53…)。
15.根据权利要求14所述的采集盘(33、43、53…)，其中通过涂覆一种物质例如疏水性 物质或抗体对其至少一个表面进行修饰。
16.根据权利要求14或15所述的采集盘(33、43、53…)，其包括电连接，该电连接使得 能够探测到响应于粒子结合到该采集盘而发生的采集盘(33、43、53···)的电流或电容的改 变。
全文摘要
动物体在呼吸时呼出粒子。粒子的性质和数量能够指示某种医学状态。因此可以采集粒子，依据大小或质量对其进行分类并它们可被用于对一种或多种医学状态的诊断中。本发明提供了一种用于对呼出的粒子进行采集和分类的方法和系统以及使用所述呼出粒子进行诊断的方法。
文档编号G01N33/497GK101827558SQ200880110004
公开日2010年9月8日 申请日期2008年10月1日 优先权日2007年10月2日
发明者埃弗特·扬斯特罗姆, 安娜-卡林·奥林, 安娜-夏洛特·阿尔姆斯特兰德, 朱卡·劳斯马 申请人:安娜-卡林·奥林;安娜-夏洛特·阿尔姆斯特兰德;朱卡·劳斯马;埃弗特·扬斯特罗姆