使用标记粒子测量流体中分子的方法

专利名称：使用标记粒子测量流体中分子的方法
技术领域：
本发明涉及一种使用标记粒子测量流体中分子的浓度的改进方法。
背景技术：
生物感测，即确定待分析物中特异性分子的量，越来越受到关注。通常，待分析物 的量，具体而言，感兴趣分子的量非常少。因此，要使用标记粒子，以便可视化这些分子。例 如，在WO 2005/010543A1和W02005/010542A2中描述了基于对存在于传感器表面的超顺磁 珠的磁检测的生物传感器。可是，如果存在感兴趣的特异性分子，那么标记珠结合到所述传 感器的表面。因此，所结合的标记珠的量与待分析物中特异性分子的量有关。这些标记粒子可以以溶液形式或以干燥形式提供。像免疫测定之类的实验输出强 烈依赖于与不同测定步骤(像抑制和/或结合)相关的标记粒子或磁珠的数目。例如，在 抑制步骤期间，或多或少的磁珠确实会影响测量(或多或少有一些抗体)的敏感度。另一 实例是在结合步骤期间或多或少的磁珠的作用，其理所当然会导致可能的结合的数目的增 加或减少。例如，可以使用具有很好的结合可能性的更少的磁珠实现端点信号(在抑制性 测定的情况下低靶粒子浓度)或使用具有较低结合可能性的(在抑制性测定的情况下 高靶粒子浓度)数目较高的磁珠。这说明当相关的磁珠浓度未知时，可以使用相似的值测 量信号，但依然具有不同的靶(粒子)浓度。然而，很难适当地控制存在的标记粒子的量以进行结合。例如，如果以干燥形式提 供粒子，那么在测定开始时可能并不是所有粒子都再分散。

发明内容
因此，本发明的目的是克服该缺点并提供一种用于测量待分析物或样品液体中分 子浓度的改进方法。本发明是基于这样的思想，即测量样品体积或盒内存在或可获得的标记粒子的实 际数目。这是通过至少两次测量靠近传感器表面的粒子的量来实现的在一次测量中，仅仅 检测结合的粒子(正如通常所做的)。在第二测量中，检测所有的粒子。因此，本发明提供一种用于测量样品液体或待分析物中预定分子的浓度的方法。 所述方法包括向具有标记粒子的盒中添加样品液体的步骤，其中，所述标记粒子适于捕获 所述预定分子并结合到所述盒的传感器表面上。然后，允许标记粒子与传感器表面进行反 应并测量靠近传感器表面的标记粒子的量。随后，未结合到所述表面的标记粒子在“冲洗” 步骤中被去除，并且最终再次测量靠近传感器表面的标记粒子的量。优选地，所述方法还包 括如下步骤处理测量步骤的结果以及计算所述样品液体中预定分子的浓度。使用所述两次测量的结果，人们可以计算结合的标记粒子和未结合的标记粒子的 量(以及标记粒子的总量)。这使得可以获得对于这些实验(例如，免疫测定)正确计算待 测分子浓度所必须的重要参数。所描述的方法可以应用于不同的已知技术以执行生物传感。例如，可以通过受抑全内反射(FTIR)测量靠近传感器表面的标记粒子的量。或者，通过使用磁阻传感器测量标 记粒子的杂散磁场来测量靠近传感器表面的标记粒子的量。然而，根据本发明的方法并不 局限于任意特定的感测技术或传感器。所述传感器可以是基于(磁性)粒子的任意性质检 测在传感器表面上或附件是否存在所述粒子的任意合适的传感器，例如，它可以经由磁方 法(例如磁阻、霍尔、线圈)、光学方法(例如成像、荧光、化学发光、吸收、散射、渐逝场技术、 表面等离子体共振、拉曼等等)、声学检测(例如表面声波、体声波、悬臂、石英晶体、等等)、 电学检测(例如导电性、阻抗、电流、氧化还原循环)，以及这些方法的组合等进行检测。一般而言，标记粒子优选的是超顺磁的。在那种情况下，可以通过磁致动而将标记 粒子朝向传感器表面致动。此外，“冲洗”步骤，即从传感器表面去除未结合的标记粒子也可 以通过使用磁场来实现。当然，通过重复对传感器表面的若干特异性结合点处的粒子的量的测量步骤，本 发明可以普遍适用于大规模或阵列实验。这也可以针对若干结合点同时完成。这些结合点 可以包含不同的结合或捕获分子，以便在同一待分析物中执行大量不同的实验。基于所述测定，如果正在捕获待测分子，那么标记粒子可以仅结合到传感器表面。 反之亦然，在抑制测定中，如果没有正在捕获的分子，那么标记粒子可以仅结合到传感器表 面。一般而言，根据本发明的方法可以用于若干生化测定类型，例如结合/未结合测定、夹 心测定、竞争测定、变位测定、酶测定、等等。本发明的这些和其他方面将从下文描述的实施例中变得明显，并且参考这些实施 例来对其进行阐述。


图1示意性地示出了 FTIR的原理；图2描绘出示出了根据本发明的测量结果的图表。
具体实施例方式图1示意性地示出了 FTIR的功能原理。在盒7中提供标记粒子2。所述盒7具 有传感器表面1，其使用激光或LED 3a进行照射。光在传感器表面1处被反射并通过检测 器4a进行检测，所述检测器4a可以是(例如)光电二极管或CCD相机。选择入射光的光 学路径3，使得可以满足全内反射的条件。在该情况下，生成具有IOOnm到IOOOnm的典型渐 逝衰减长度的渐逝光学场5。因此，只要标记粒子2充分靠近传感器表面1，光在这些粒子 处被散射，如箭头所指示的，并且渐逝场被干扰导致反射光强度的降低。一旦将(样品)液体提供给传感器表面1或提供给临近所述传感器表面1的(盒) 体积，之前已经以干燥形式提供的标记粒子2再分散到溶液中。一旦优选为超顺磁的粒子2 被完全分散，可以利用磁体6使它们朝向传感器表面1进行加速，其中，如果液体样品中存 在待检的特异性分子，那么这些粒子可以结合到所述表面。为此，可以在所述传感器表面上 提供特异性结合部位。在进行结合的足够时间后，在“冲洗”步骤中从传感器表面1上去除 未结合的粒子。优选地，这是通过由第二磁体(未示出)所生成的磁场来实现的。在常规 FTIR测量中，结合到所述传感器表面(或其结合部位)的粒子的量随后在冲洗步骤之后进 行测量。由于传感器表面上存在粒子，因此入射光3的一部分在传感器表面处(具体而言，在结合的粒子处)被散射，从而导致检测器4a处的反射光的强度降低。因而，对所述强度 降低进行测量允许估计结合的粒子的量。然而，根据本发明，执行冲洗之前的测量，并且将参考图2进行描述。图2描绘出示出了根据本发明的FTIR测量的输出的图表。其中，反射光的强度被 示为任意单位随时间的变化。三条曲线对应于未结合(10)、中度结合(11)以及高度结合 (12)。所有的曲线在t = 0时，S卩，在测定开始时以100开始，此时在传感器表面处不存在 粒子。因此，100的信号对应于没有受到粒子的任何抑制的全内反射。随后，通过磁体将粒子朝向传感器表面吸引大约220秒。因此，粒子渐渐靠近传感 器表面并且使得反射光的强度降低。以脉冲方式朝向所述表面吸引粒子，这样通常，它们在 接通磁场期间被拉向所述表面，而在关闭所述磁场时，它们趋向于再次扩散到大的体积中。 因此，未结合的粒子在渐逝场中的平均驻留时间十分低，从而导致相当低的信号贡献。然 而，粒子中的一些在接触到所述表面时能够进行结合，并且这些粒子仍留在所述表面上。这 些结合的粒子被固定在所述表面上，因此，它们持续与渐逝场作用，从而导致比未结合的粒 子有更高的信号贡献。在本文所应用的渐逝波检测的情况下，结合的粒子和未结合的粒子之间的信号差 十分高，这是因为渐逝场的检测深度是如此之小(大约50-150nm)。粒子仅是轻微移入大体 积中已经使得它们对于FTIR传感器不可见。当采用具有更大感测深度的其他传感器原理 时，该效果不再那么明显，并且未结合的粒子的信号贡献将更加相似。在实验的最初阶段期间，在所述表面附近收集更多的粒子。这可以在传感器信号 10中明显地看出，其中没有发生结合。在大约2分钟之后，已经收集到了大多数粒子，并且 信号10保持平缓。对于其他的曲线11和12，粒子的收集过程与结合过程同时进行。信号 10和其他曲线之间的差别是由于结合的粒子的信号贡献而导致的。因为在实验的最初阶段 期间在所述表面附近收集更多的粒子，所以结合过程的速度将开始增加。在大约2分钟之 后，已经收集了所述表面附近的所有粒子，并且结合率相当恒定。可以明显地看出，结合的 粒子的平均信号贡献比来自未结合的粒子的信号贡献高得相当多。在给粒子总够时间以便结合到传感器表面后，使用第二磁体以从传感器表面去除 未结合的超顺磁粒子。在图2中，这发生在大约tA = 220秒时，从而导致反射光强度的陡 增，这是因为从传感器表面去除了一些引起受抑全内反射的粒子。当去除所有未结合的粒 子后，曲线在时刻tB饱和。在没有发生结合的情况下，如曲线10所示，所述信号明显在初始值100处饱和 (10b)，这是因为所有通过磁场吸引到所述表面的粒子再次被磁场去除。然而，如果发生了 结合，如通过曲线11和12所指示的，那么初始值再次不能被满足，这是因为在这种情况下， 吸引到所述表面的一些粒子结合、因而驻留在那里。结合的越多，tB时的最终信号越小。从tA和tB时的反射强度的信号中，人们分别获得关于传感器表面处的粒子x+y 的总数目以及结合的粒子y的数目的信息。必须考虑到，未结合粒子的信号贡献比结合粒 子的信号贡献低得多，这是因为相对于结合粒子而言，在所述传感器的敏感区域中的未结 合粒子的平均驻留时间相当低。因此，必须考虑到校正因子，以补偿该效果。因此，人们可以获得在某一传感器上的结合过程中参与的粒子的通常未知的数 目。一般而言，该数目依赖于溶解干燥粒子中的变化以及溶解的速度。对于变化的进一步原因是关于传感器芯片的致动磁体的没有对准和/或不均勻的磁场梯度。在抑制过程的情况下，人们对参与抑制过程的数目感兴趣，即对样品体积中粒子 的总数目感兴趣。如果存在若干传感器n，人们可以为每个传感器i计算每个传感器的粒子 数目Xi+yi，如以所述，然后加和这些数目，以便获得在样品体积中粒子的总数目X+Y :X+Y = XjyjXjyA-JXjy1^传感器数目η越大，对粒子的总数目的估计将越精确。在不同传感器上的粒子的数目的变化也可以产生对于每个传感器的抑制的额外 校正因子。此时，我们假设小靶分子的扩散快到足以忽略该现象，但将来的实验将显示对该 假设的确认。即使当不需要额外的校正因子时，该空间粒子数目变化可以用作一种用于测 试的可靠性检查。所有的测量可以用作一种用于测试的可靠性检查。如果在某一传感器上 的粒子总数目非常低，那么它将使得测试非常不可靠。当然，尽管本发明所描述的方法是参考FTIR传感器描述的，其并不限于FTIR。所 述传感器可以是基于粒子的任意性质检测在传感器表面上或附近是否存在磁性粒子的任 意合适的传感器，例如，它可以经由磁方法(例如磁阻、霍尔、线圈)、光学方法(例如成像、 荧光、化学荧光、吸收、散射、渐逝场技术、表面等离子体共振、拉曼、等等)、声学检测(例如 表面声波、体声波、悬臂、石英晶体等等)、电学检测(例如导电性、阻抗、电流、氧化还原循 环)，以及这些方法的组合等进行检测。如果使用其他传感器，那么可以针对特定实现执行某一测量。例如，在磁阻传感器 的情况下，通常使用载流导线以便产生磁场，所述磁场在超顺磁粒子中感生出双极，这些双 极场可以随后使用磁阻传感器进行测量。这些载流导线产生粒子的横向高浓度。高浓度的 发生仅仅对于未结合的粒子而言的，这意味着所测量的未结合粒子的数目相对于结合粒子 而言太高。因此，将高浓度因子A添加到所述方法中，在没有高浓度时所述高浓度因子A为 1。除分子测定之外，也可以检测更大的分子，例如细胞、病毒、或细胞或病毒的片段、 组织提取物，等等。所述检测可以在有或没有关于传感器表面扫描传感器元件的情况下发 生。测量数据被导出作为端点测量，以及通过动力学地或间歇地记录信号来导出。标记粒 子可以直接通过感测方法来进行检测。以及，粒子可以在检测之前进行进一步处理。进一 步处理的实例是添加材料或修改标记粒子的(生物)化学或物理性质以便有利于检测。根 据本发明的方法可以用于若干生化测定类型，例如结合/未结合测定、夹心测定、竞争性测 定、变位测定、酶测定、等等。本发明的方法适于传感器复用(即不同传感器和传感器表面 的并行使用)、标记复用(即不同类型标记的并行使用)以及室复用(即不同反应室的并行 使用)。本发明中所描述的方法可以用于针对小样品体积的快速、鲁棒、易于使用的床旁生 物传感器。反应室可以是在紧凑型读取器中使用的一次性部件，所述紧凑型读取器包含一 个或多个磁场产生装置以及一个或多个检测装置。同时，本发明的方法能够用于自动高吞 吐量测试。在这种情况下，反应室例如是填充到自动仪器中的孔盘或小管。虽然在附图和说明书中已经详细举例说明和描述了本发明，但是此举例说明和描 述应当被理解为是举例说明性和示例性的，而不应是限制性的；本发明并不限于所公开的 实施例。本领域技术人员在根据对附图、说明书和权利要求书的研究来实践所要求的发明 时能够想到并实现所公开的实施例的其他变型。在权利要求书中，词语“包括”并不排除其 他元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”并不排除多个。单一处理器可以实现权利要求书中记载的若干项的功能。起码的事实是，在相互不同的权利要求中记载的特定手段并 不代表使用这些手段的组合不能带来益处。权利要求中的任何附图标记不能解释为是对范 围的限制。
权利要求
一种用于测量样品液体中预定分子的浓度的方法，包括如下步骤a)向存在标记粒子的盒中添加所述样品液体，使得所述标记粒子能够与液体反应，其中，所述标记粒子适于捕获所述预定分子并且适于结合到所述盒的传感器表面上；b)允许所述标记粒子与所述传感器表面进行反应；c)测量靠近所述传感器表面的标记粒子的量；d)去除未结合到所述传感器表面上的标记粒子；以及e)测量靠近所述传感器表面的标记粒子的量。
2.如权利要求1所述的方法，还包括如下步骤处理步骤c)和e)的结果以及计算所 述样品液体中所述预定分子的浓度。
3.如权利要求1或2所述的方法，还包括计算结合的标记粒子和未结合的标记粒子的 量的步骤。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，靠近所述传感器表面的标记粒子的量是通过 FTIR测量的。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述标记粒子是超顺磁性的。
6.如权利要求5所述的方法，其中，步骤b)是通过所述标记粒子朝向所述传感器表面 的磁致动进行加速的。
7.如权利要求5所述的方法，其中，靠近所述传感器表面的标记粒子的量是通过使用 磁阻传感器测量所述标记粒子的杂散磁场来测量的。
8.如权利要求5所述的方法，其中，未结合到所述表面的标记粒子是通过磁场来去除的。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤c)是在所述传感器表面的若干特异性结 合点处执行的，并且随后，步骤e)是在所述传感器表面的若干特异性结合点处执行的。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤c)和e)分别在所述传感器表面的若干 特异性结合点处同步进行。
11.如权利要求9或10所述的方法，还包括计算每个结合点的结合的标记粒子和未结 合的标记粒子的量的步骤。
12.如权利要求1或2所述的方法，其中，如果正在捕获所述分子，那么所述标记粒子仅 结合到所述传感器表面。
13.如权利要求1或2所述的方法，其中，如果没有正在捕获的分子，那么所述标记粒子 仅结合到所述传感器表面。
全文摘要
本发明提供了一种用于测量样品液体或待分析物中分子浓度的方法。所述方法包括在盒内用标记粒子混合所述液体的步骤，其中，所述标记粒子适于捕获所述分子并且适于结合到所述盒的传感器表面。然后，所述标记粒子沉积到所述传感器表面上，并且测量靠近所述传感器表面的标记粒子的量。随后，在“冲洗”步骤中去除未结合到所述表面上的标记粒子，最后，再次测量靠近所述传感器表面的标记粒子的量。
文档编号G01N33/543GK101932937SQ200880118968
公开日2010年12月29日 申请日期2008年11月28日 优先权日2007年12月4日
发明者J·H·尼乌文赫伊斯, P·J·W·范兰卡威尔特 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司