专利名称：化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的高效液相色谱检测方法
技术领域：
本发明是一项利用高效液相色谱仪检测化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的新技术，尤 其适用于染发剂中微量间苯二胺的定性及定量分析。
背景技术：
染发剂可分为氧化型(永久性)染发剂，直接型(暂时性或半永久性)染发剂,金属盐类染发 剂,天然植物型染发剂等。染发时，色素或色素中间体通过碱性物质和过氧化物使毛小皮F 一层上的二十一碳脂肪酸硫代酯键断裂，直接进人毛皮质中的粗原纤维和微原纤雍，从中进 行氧化聚合形成新的化合物的染发剂称为氧化型发剂。其中氧化型染发剂以其染色效果好、 色调变化宽、维持时间长等诸多优点而成为最受欢迎的染发剂，在欧洲和美国约占市场分额 的80%。与其它类型的染发剂不同,氧化型染发剂由两剂组成,使用前混匀，在头发中发生化学 反应而产生颜色。氧化型染发剂主要由氧化型染料、氧化剂和辅加剂等组成。氧化型染料由 染料前体和偶合剂组成。染料前体主要包括对苯二胺(PPD )、对氨基酚、甲苯二胺(PTD)
等及它们的异构体及衍生物。偶合剂主要指间位的芳香胺类衍生物,如间苯二酚、间苯二胺、 间氨基酚等及其同系物和衍生物。染料前体先和氧化剂反应然后又在偶合剂的作用下发生偶 合反应而生成大分子的喷哚等各种色泽的染料。这些不溶于水的染料一方面覆盖在头发表面,
另一方面渗入毛髓内部,达到永久染发的效果。不同结构的染料成分可使头发染成不同的颜 色。而其中间苯二胺属于毒性较大的物品，吸入其蒸汽或粉尘会引起气喘和其他呼吸道疾病。
皮肤吸收导致血液障碍，影响肾脏、肝脏功能。它对皮肤的反应各不相同，急性湿疹可扩散 到背部、面部和腹部，并有类似丹毒的痂皮。间苯二胺最主要的危害是正铁血红蛋白血症和 致癌作用。当暴露在含芳胺的气氛或接触芳胺时，主要是皮肤接触或是呼吸进入体内。结果
导致血液的输氧系统损坏而引起缺氧症。间苯二胺对小白鼠的口服半数致死量为300mg/Kg， 影响剂量为18mg/Kg。因此为了保护化妆品消费者的健康安全，建立灵敏、准确、高效、 快速的化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的检测方法是十分紧迫和必要的
发明内容
:本发明的目的是提供一种检测化妆品氧化型染发剂中的间苯二胺的分析方法，该项技 术利用高效液相色谱仪不仅可以对化妆品氧化型染发剂中的间苯二胺进行准确的定性分析， 而且还可以进行微量的定量分析。 —
本发明是用乙腈和三乙醇胺配置的混合溶液提取化妆品氧化型染发剂中的间苯二胺， 经超声萃取、离心、过滤等一系列操作，滤除固体杂质，直到滤液澄清，取制备好的样液上 机，用乙腈一三乙醇胺缓冲溶液进行洗脱分离，在190-380nm波长下采集数据进行分析。 所用高效液相色谱仪的主要配置包括十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相C18色谱柱、 紫外检测器或二极管阵列检测器。
本样品方法的主要分析步骤如下"
1样品预处理
称取一定量的化妆品(氧化型染发剂)置于己加入l^亚硫酸钠溶液的25mL具塞比色 管中，涡旋至基质分散，用流动相定容至刻度，再超声10-20min,将提取液转移至离心管 中，5000rpm/min离心5min，经0.45pm滤膜过滤，滤液作为待测样液。
2色谱条件
(1) 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相C18色谱柱；
(2) 检测器紫外检测器或二极管阵列检测器；
(3) 检测波长选用190-380nm波长作为检测波长；
(4) 流动相 有机相乙腈
水相三乙醇胺水=0.5~2%: 99.5%~98% (用磷酸调节pH=6.0-9.0) 有机相水相=5~10%: 95~90%作为流动相，平衡色谱柱约20min， 使基线平稳，该条件下保留时间适合，峰形对称，分离度好(R>1.5)。
(5) 流速0.5~1.5mL/min;
(6) 柱温15~35°C。 3浓度计算方法
用间苯二胺标准物质配制成一定浓度的标准液，5UL体积进样，按外标法，以峰面积 一浓度作线性回归，得出线性回归方程，利用该方程和样品中间苯二胺的峰面积计算样品中 的间苯二胺含量。
4样品检测
(D按显l中的方法进行样品预处理，取处理好的—样B^5wLl私..然后再^it当浓度的间苯二胺标准溶液5 U L进样。
(2) 依照2中的检测条件进行检测，分别得到样品的色谱图和间苯二胺标准品的色谱 图；将样品的色谱图和标准品的色谱图进行比较，样品色谱图中与标准品保留时间相近(误 差范围标准品保留时间土0.5min)的色谱峰即为相应的间苯二胺成分，为了确保检测结果 的准确性，可对初步确定的色谱峰进行光谱分析(光谱分析仅适用于二极管阵列检测器)， 若与标准品的最大吸收波长及光谱图特征相似，可进一步确定样品中的间苯二胺成分。
(3) 将样品中间苯二胺的色谱峰面积带入3中的线性回归方程中，计算样品中间苯二 胺的浓度。 '
由于化妆品种类繁多、基质复杂，不能完全排除干扰成分与间苯二胺在同一时间出峰 的可能。采用二极管阵列检测器可获得间苯二胺的紫外吸收光谱图，与标准品的光谱图对照， 通过分析二者的最大吸收波长及光谱图特征，可进一步进行确认。
本发明的分析方法准确、简便、快捷，灵敏度高，选择性、重复性好，适用于各种剂 型的氧化性染发剂。
图1样品色谱图
图2间苯二胺标准品色谱图
图3样品光谱图
图4间苯二胺标准品光谱图
图5间苯二胺标准曲线图
具体实施例方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明 1材料 1.1仪器
岛津自动进样高效液相色谱系统Ultimate AQ-C18 (50mmx4.6mm， 5um，柱号 220801527)色谱柱，SPD-20A紫外可见光检测器，SPD-M20A 二极管阵列，LC-20AB 二元 高压梯度泵，SIL-20A自动进样系统，CTO-20A柱温箱及LCsolution色谱工作站。
1.2试剂和样品
乙腈(色谱纯)为Merck公司产品；95%乙醇(优级纯)为天津科密欧化学试剂开发中心 产品；磷酸(分析纯)为天津津沽工商实业公司产品；三乙醇胺(分析纯)为天津福晨化学试剂厂产品；亚硫酸钠(分析纯)为天津大茂化学试剂厂产品；超纯水由Milli-Q system制取。 间苯二胺标准品购于CHEM SERVICE,批号为395-55B,纯度为99.5%。 供试品为一洗黑。 1.3标准品储备液
精密称取53.52mg间苯二胺标准品(纯度为99.5%)置于50mL容量瓶中，加入O.Olg 亚硫酸钠，加少许95%乙醇溶解，并用95。/。乙醇定容至刻度，摇匀，ffi制成浓度为1.065mg/mL 的标准溶液作为储备液，于4'C冰箱中存放备用。
2方法
2.1色谱条件
色谱柱Ultimate AQ-C 18(150mmx4.6mm, 5um)
流动相采用乙腈(水三乙醇胺=98: 1) =5: 95 (水相用磷酸调pH=7.7),该流
动相基线噪音小，且在pH值为7.70时峰形对称，分离度好 检测波长280nm。经190~400nm波长扫描，间苯二胺在290nm附近有最大吸收，
但为了扩大方法的适用范围，故选择280nm作为检测波长。 流速1.0mL/min 柱温25 °C 2.2样品预处理
称取l.OOg的化妆品(一洗黑)置于已加入1%亚硫酸钠溶液l.OmL的25mL具塞比色 管中，涡旋至基质分散，用流动相定容至刻度，再超声15min，将提取液转移至离心管中， 5000rpm/min离心5min,经0.45nm滤膜过滤，滤液作为待测样液。
2.3样品检测
取5pL供试液进样，利用2.1中的色谱条件进行检测，获得样品的色谱图(图1)和光 谱图(图3);再取1.3中的间苯二胺标准品储备液稀释为106.50mg/L浓度，5pL进样，同 样检测条件下，得到间苯二胺标准品的色谱图(图2)和光谱图(图4)。
2.4标准曲线
用流动相将间苯二胺储备液稀释成如下梯度浓度的标准系列26.63mg/L、 53.25mg/L、 106.50mg/L0、 266.25mg/L、 532.50mg/L,取各浓度的标准溶液5pL进样，得到各浓度的峰 面积(见表l),作峰面积一浓度标准曲线(见图5),得到其线性回归方程(由高效液相色 谱工作站完成计算工作)。
回归方程A(Area)=3688.02*C-1078.3 R2=0.9998表1间苯二胺标准曲线各点浓度及峰面积
标曲各点浓度
峰面积 标准曲线公式
(mg/L)
26.63 93047
53.25 189208
106.50 386149 A(Area)=3688.02*C-l078.3 (R2=0.9998)
266.25 951744 _
532.50 1962624
3结果分析
由间苯二胺标准品的色谱图(图2)可以看出，利用2.1中的色谱检测条件得到间苯二 胺标准品的保留时间为5.335min，将样品的色谱图(图l)和标准品的色谱图(图2)进行 比较，可见样品色谱图中5.315min处有一色谱峰与间苯二胺标准品色谱峰的保留时间 5.335min相近，误差在±0.5分钟范围之内，因此可以初步确定样品色谱图中5.315min处的 色谱峰为间苯二胺，该峰面积为377722。将样品色谱图中5.315min处峰的光谱图(图3) 与间苯二胺标准品的光谱图(图4)进行对比，可以发现样品的光谱图与标准品的光谱图的 最大吸收波长相近，可进一步确定样品中保留时间为5.315min的组分为间苯二胺。
将样品中间苯二胺的色谱峰面积377722代入线性回归方程中，即可得到样品处理液中 间苯二胺的含量为105.15 mg/L (由高效液相色谱工作站完成计算工程)，经计算可得一洗黑 中间苯二胺为5258mg/kg。
该发明具有高分辨率、高灵敏度、重现性、选择性好且样品预处理方法简单等特点， 适宜化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的定性、定量分析。
本发明以大量实验和理论分析为依据，找到了一种利用高效液相色谱分析仪检测化妆 品氧化型染发剂中间苯二胺的分析方法，填补了化妆品氧化型染发剂中间苯二胺液相色谱分 析方面的研究空白。
权利要求
1.一种化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二极管阵列检测器，以外标法定量，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱，用乙腈和三乙醇胺配置的混合溶液提取化妆品氧化型染发剂中的间苯二胺，经超声萃取、离心、过滤等一系列操作，滤除固体杂质，直到滤液澄清，取制备好的样液上机，用乙腈-三乙醇胺缓冲溶液进行洗脱分离，在190-380nm波长下采集数据进行分析。
2. 根据权利要求1所述的化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的高效液相色谱 检测方法，其特征在于采用紫外检测器或二极管阵列检测器。
3. 根据权利要求1所述的的化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的高效液相色 谱检测方法，其特征在于采用十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱。
4. 根据权利要求1所述的化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的高效液相色谱 检测方法，其特征在于流动相有机相乙腈；水相三乙醇胺水=0.5~2%:99.5%~98% (用磷酸调节pH:6.0-9. 0);有机相水相=5~10%: 95~90%作为流动相。
5. 根据权利要求1所述的化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的高效液相色谱 检测方法，其特征在于采用190-380nm波长下采集数据进行分析，最佳波长为 280亂
6. 根据权利要求1所述的化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的高效液相色谱 检测方法，其特征在于流速0.5 1.5mL/min;柱温15~35°C。其中最佳流速为 1.0mL/min，最佳柱温为25'C。
7. 根据权利要求1所述的化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的高效液相色谱 检测方法，其特征在于样品预处理采用称取1. OOg的化妆品(一洗黑)置于己加 入lX亚硫酸钠溶液1.0mL的25mL具塞比色管中，涡旋至基质分散，用流动相 定容至刻度，再超声15min，将提取液转移至离心管中，5000rpm/min离心5min， 经0.45ixm滤膜过滤，滤液作为待测样液。
8. 根据权利要求1所述的化妆品氧化型染发剂中间苯二胺的高效液相色谱 检测方法，其特征在于样品分析后根据其保留时间和光谱图定性分析，利用外标 法根据其峰面积进行定量分析。
全文摘要
本发明的目的是提供一种检测化妆品氧化型染发剂中的间苯二胺的分析方法，该项技术利用高效液相色谱仪不仅可以对化妆品氧化型染发剂中的间苯二胺进行准确的定性分析，而且还可以进行微量的定量分析。本发明是用乙腈和三乙醇胺配置的混合溶液提取化妆品氧化型染发剂中的间苯二胺，经超声萃取、离心、过滤等一系列操作，滤除固体杂质，直到滤液澄清，取制备好的样液上机，用乙腈-三乙醇胺缓冲溶液进行洗脱分离，在190-380nm波长下采集数据进行分析。所用高效液相色谱仪的主要配置包括十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相C18色谱柱、紫外检测器或二极管阵列检测器。
文档编号G01N30/02GK101625340SQ20091004056
公开日2010年1月13日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者郑伟东 申请人:郑伟东