专利名称：利用蛋白质组学技术分析tel/aml1阳性儿童all预后的方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质组学技术的应用，具体地说，涉及一种利用蛋白质组学技术分析TEL/AML1阳性儿童ALL预后的方法及用途。
背景技术：
蛋白质组学(proteomics)是直接以生命功能的执行者蛋白质为切入点，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律，该技术为解码具有潜在抗肿瘤活性的药物靶位以及恶性肿瘤早期诊断和预后的分子标志等展现了良好的前景。主要采取的方法是比较蛋白质组学中常用的双向凝胶电泳、图像分析、生物质谱和生物信息学方法的研究技术。
急性淋巴细胞白血病占儿童急性白血病的75_85%，是严重危害儿童健康，导致儿童死亡的主要疾病之一，由于各种治疗措施的不断进步，包括联合化疗的应用、支持治疗手段的改善以及庇护白血病的预防性治疗等，儿童急性淋巴细胞白血病的5年无病生存率可达80%左右。目前儿童急性淋巴细胞白血病的预后因素很多，如性别、人种、基因多态性、年龄、发病时白细胞数、早期治疗反应、微小残留病以及化疗药物敏感性等，而TEL/AML1是由12pl3的TEL(ETV6)和21q22的AML1 (RUNX1)基因融合而成，其在B系儿童急性淋巴细胞白血病中的发生率约20-25% ，发病年龄多在2 4岁左右，总体评价临床预后较佳，但仍有部分患儿在治疗过程中会出现早期复发，影响其总体生存率；目前临床上常用的流式细胞术及PCR等方法仍无法细致分型，从而早期诊断，减少治疗毒性，提高疗效；是增加整个群体的治疗强度，还是寻求新的个体化治疗的分子生物学指标，成为我们新的问题和有待解决的不足。
发明内容
TEL/AML1阳性儿童急性淋巴细胞白血病在临床特征及预后上存在异质性，为了解决在治疗此亚型儿童急性淋巴细胞白血中，无法合理有效的进行个体化治疗，以提高治疗效果，减轻治疗相关毒性的不足，本发明利用蛋白质组学技术首先构建了 TEL/AML1阳性儿童急性淋巴细胞白血病系的蛋白表达谱，进而分组进行功能蛋白的比较，以发现差异性蛋白，结合此亚型儿童急性淋巴细胞白血病的临床特征，提出新的治疗靶点和个体化治疗的分子生物学监测指标。本发明提供了一种将蛋白质组学研究方法应用于TEL/AML1阳性儿童急性淋巴细胞白血病群体基础和临床研究中的技术方案。 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种利用蛋白质组学技术分析TEL/AML1阳性儿童ALL预后的方法，包括以下步骤 (1)利用蛋白质组学技术首先构建了 TEL/AML1阳性儿童急性淋巴细胞白血病系的蛋白表达谱； (2)分组进行功能蛋白的比较，发现差异性蛋白； (3)结合此亚型儿童急性淋巴细胞白血病的临床特征，提出新的治疗靶点和个体
3化治疗的分子生物学监测指标。 所述蛋白质组学技术为双向凝胶电泳技术、图像分析、生物质谱和生物信息学方法。 蛋白质组学技术在TEL/AML1阳性儿童ALL预后分析中的应用。 本发明的有益效果是本发明所提供的技术方案达到更加精确的对儿童急性淋巴
细胞白血病进行分组比较的效果，建立儿童急性淋巴细胞性白血病的蛋白质表达谱，从蛋
白质水平提出了儿童急性淋巴细胞性白血病的个体化治疗的监测指标，并提供了可能的治
疗靶标。
具体实施例方式
选取儿童初诊急性淋巴细胞白血病患者，通过FISH或/和PCR方法证实融合基因为TEL/AML1阳性，以CAMS-ALL2005方案进行治疗(地塞米松(8mg/m2)预治疗一周，观察一周时外周血幼稚细胞数，以及VDLP方案诱导缓解治疗两周时患儿骨髓的幼稚细胞数)，根据治疗反应、临床预后进行分组，不同组别之间临床预后存在显著差异，早期复发患儿但在疗程6月时复发，复发时FISH方法检测TEL/AML1仍为阳性，高白细胞组(> 100X 109/L)及标危组观察两年仍为完全缓解状态，融和基因检测为阴性。 蛋白质组学中的双向凝胶电泳技术凭借其高通量、高灵敏度、高分辨率和重复性
好，便于计算机进行图像分析处理，可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点，已成为蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术。通过2-DE凝胶图像分析，发现不同组间TEL/AML1(+)儿童急性淋巴细胞性白血病蛋白表达谱存在显著性差异，不同组间TEL/AML1(+)儿童ALL蛋白表达谱存在显著差异(大于2倍或小于0. 5倍)，早期复发病例与标危者和初诊时高白细胞(> 100X107U者相比，有71个蛋白点表达消失，93个新蛋白点出现，37个蛋白点表达上调，23个蛋白点表达下调；标危病例和初诊时高白细胞者比较，有6个蛋白点表达消失，56个新蛋白点出现，7个蛋白点表达上调，19个蛋白点表达下调。早期复发组与其他分组之间组别差异明显，从蛋白水平证实组别差异性的存在，组别蛋白的差异提示部分TEL/AML1(+)ALL可能在肿瘤细胞的迁移或信号转导等途径中出现不一致性，新蛋白点的出现提示某些功能蛋白可能具有谱系差异性，或和化疗药物的敏感性相关，成为新的治疗靶标和分子生物学监测指标。 选择组别差异明显、表达良好的蛋白进行质谱鉴定，结果显示甲状腺激素结合蛋白、HSP90/HSP86/HSP89 、原肌球蛋白、膜联蛋白6 、 GTP酶活化蛋白、钙联接蛋白、过氧化氢酶、乳酸脱氢酶A、酮糖移转酶仅在早期复发组高表达。其中HSP90/HSP86/HSP89通过MALDI-TOF/MS及ESI-MS/MS鉴定显示为同一蛋白，热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是生物体中普遍存在的高度保守的蛋白质，根据分子量大可分为HSPIOO、 HSP90、 HSP70、HSP60和小HSP五大家族，尤以HSP90和HSP70与信号分子(如v-Src、 Raf-l、 AKT、类固醇激素受体)关系密切，在细胞恶性转化和转移过程中发挥重要作用，研究显示HSP90是GC-GR效应通路中重要的分子伴侣，在难治复发ALL中表达相对较高，可能和糖皮质激素的耐药性相关。Diakos等利用RNAi技术同样证实TEL-AML1及HSP90之间的功能相关性，并提出HSP90作为新型抗癌治疗靶位的理论依据。本发明通过质谱分析显示HSP90在早期复发TEL-AML1 (+)ALL中高表达，从蛋白质水平再次证实TEL-AML1融合基因与HSP90的相关性，因此推测HSP90是否可以在TEL-AML1 (+)ALL中作为一个新的分子生物学指标，对某些临床预后较差的患儿进行早期强化治疗，从而实现此临床亚型儿童ALL的个体化治疗。
此外还有涉及到细胞代谢、细胞形态维持和信号传导等功能的其它差异蛋白，如G22P1是DNA双链修复途径的重要成员，作为可修复DNA链断裂损伤的基因，G22P1在早期复发组表达下调，可能和白血病的发生相关。膜联蛋白(a皿exins)是一类钙依赖的磷脂结合蛋白超家族，具有多种重要的生物学功能，除参与膜转运和钙依赖信号传道外，还具有调控细胞分裂，增殖和分化的作用，是一类潜在的抑瘤基因，ANXA6是肿瘤生长和转移的抑制因素，但本研究中ANXA6在早期复发组高表达。 目前蛋白质组学已经广泛的应用于临床研究领域，本发明首次将蛋白质组学研究方法应用于儿童TEL-AML1(+)ALL，从蛋白质水平阐述了 TEL-AML1 (+)儿童急性淋巴细胞白血病的临床异质性，同时发现HSP90等的部分蛋白可能在儿童急性淋巴细胞白血病的发生发展中起到重要地位，为该病的个体化治疗提供新的分子指标和新的药物靶点。
实验步骤
1.胞样品处理 (1)加入5倍体积裂解液，混匀，加入50ug/ml Rnase和200ug/ml Dnase 1，4。C放置15min。 (2) 14000rpm，4。C离心90min，上清用Bradford法测蛋白浓度。
2.第一向等点聚焦 (1)从冰箱中取出IPG预制胶条，用溶胀缓冲液将胶条泡胀12小时。 溶胀缓冲液8M尿素，2M硫脲，0. 5 % CHAPS， 0. 52 %两性电解质，0. 02 %溴酚蓝，
1% DTT (2)将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，上样量为0. 5mg，并用溶胀buffer稀释至170ul。 (3)对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序
步骤电压(V)时间(vh)
Sl0-500500
S25002500
S3500-350010000
S4350050000
S53500-5008000 (4)聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。 3.第二向SDS-PAGE电泳 (1)配制丙烯酰胺凝胶。 (2)待凝胶凝固后，从-2(TC冰箱中取出的胶条，先于室温放置IO分钟，使其溶解。 (3)配制胶条平衡缓冲液I，平衡缓冲液II。 平衡缓冲液I:50mM Tris-HCl 6. 8， 6M尿素，30%甘油，2% SDS， 2% DTT， 0. 02%溴酚蓝。
5
平衡缓冲液II :50mM Tris-HCl 6. 8，6M尿素，30 %甘油，2 % SDS， 2. 5 % IAA，0. 02%溴酚蓝。 (4)平衡胶条先将胶条放入平衡缓冲液I水平振荡15min，再将胶条转入平衡缓冲液II水平振荡15min。 (5)第二次平衡结束后，将IPG胶条从样品水化盘中移出，放到已配好的SDS-PAGE凝胶上端，并将marker放到凝胶的一端，再用0.5X的琼脂糖将胶条和marker封严，切忌不能产生气泡。并将胶板固定于电泳槽内。 (6)在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
(7)电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，进行染色。
4.染色
考染 ①染色将凝胶放入装有染色液的水平盘内，并将水平盘置水平摇床上水平振荡过夜。 染色液10%硫酸铵，10%磷酸，0. 12% G250，20X甲醇。 ②脱色将收集染色液，将凝胶浸于脱色液中，水平摇床振荡。最后换成MQ再洗涤30min 脱色液3 %冰醋酸溶液。
5.胶图比对 用BioRad公司的PDQuest 7. 3. 0软件进行胶图比对，找出差异点。
6.质谱 考马斯亮蓝染色样品凝胶胶内原位酶解方法 (1)将胶块切成lmm3左右的小块，装入E卯endorf管中，水洗三次。 (2)用50% ACN/25mM碳酸氢铵(100 y 1，K18. 0)脱色15分钟。反复3次，直至将
颜色脱尽。 (3)将胶块浸入100 % ACN (30 iU ， ACN中不能有酸性物)中5分钟，脱水，胶块变
白。然后室温抽干。 (4)力口 10-15 li 1Trypsin酶 液(Promega Sequencing Grade ModifiedTrypsinl0-15ii g/ml，在25mM NH4HC03pH8. 0)。覆盖胶块，等待30min，吸胀后，适当补入酶液，37。C过夜16-20h左右。 (5)吸出反应液，加入50 % ACN/5 % TFA 30 50ul ，轻微振荡萃取约时间30-60min，共两次。萃取液抽干约一小时。加入3 yl 0. 5% TFA/50% ACN溶解。点样、质谱检测和检索 (1)将0. 3uL样品加0. 3uL的基质(CHCA)点到样品板上，室温晾干，然后将样品板放入质谱仪检测。 (2)打开校正仪器的采集方法和处理模式，校正仪器 (3)打开测试未知样品的采集方法和处理模式，进行样品分析。选用线性反射模式进行质谱分析，激光强度5400，检测分子量范围700-4000。
(4)打开GPS软件，选择数据库检索。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可 以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发 明的范围之内。
权利要求
一种利用蛋白质组学技术分析TEL/AML1阳性儿童ALL预后的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)利用蛋白质组学技术首先构建了TEL/AML1阳性儿童急性淋巴细胞白血病系的蛋白表达谱；(2)分组进行功能蛋白的比较，发现差异性蛋白；(3)结合此亚型儿童急性淋巴细胞白血病的临床特征，提出新的治疗靶点和个体化治疗的分子生物学监测指标。
2. 根据权利要求1所述的利用蛋白质组学技术分析TEL/AML1阳性儿童ALL预后的方 法，其特征在于，所述蛋白质组学技术为双向凝胶电泳技术、图像分析、生物质谱和生物信 息学方法。
3. 权利要求1的蛋白质组学技术在TEL/AML1阳性儿童ALL预后分析中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用蛋白质组学技术分析TEL/AML1阳性儿童ALL预后的方法及用途，包括以下步骤利用蛋白质组学技术首先构建了TEL/AML1阳性儿童急性淋巴细胞白血病系的蛋白表达谱；分组进行功能蛋白的比较，发现差异性蛋白；结合此亚型儿童急性淋巴细胞白血病的临床特征，提出新的治疗靶点和个体化治疗的分子生物学监测指标。本发明的技术方案达到更加精确的对儿童急性淋巴细胞白血病进行分组比较的效果，建立儿童急性淋巴细胞性白血病的蛋白质表达谱，从蛋白质水平提出了儿童急性淋巴细胞性白血病的个体化治疗的监测指标，并提供了可能的治疗靶标。
文档编号G01N33/48GK101788555SQ20091006778
公开日2010年7月28日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者张丽, 竺晓凡, 胡莹, 范宝丽, 邹尧, 郭晔, 陈晓娟, 陈玉梅 申请人:中国医学科学院血液学研究所