专利名称：：一种塑料瓶装饮用水急性生物毒性的检测方法一种塑料瓶装饮用水急性生物毒性的检测方法本发明涉及饮用水检测
技术领域：
，尤其涉及一种塑料瓶装饮用水急性生物毒性的检测方法。[
背景技术：
]人们每天都需饮水，饮用水的安全是不能忽视的。目前瓶装饮用水的销量很大，品种也繁多，既有纯水、蒸馏水，也有天然矿泉水或人工矿化水，它们多数均用塑料瓶作为容器，对于这些商品饮用水，国家有《瓶(桶)装饮用水卫生标准》GB19298-2003确定的标准，其中规定了一些主要的检测指标，包括感官、理化和微生物指标，此类检测指标基本上不涉及生物毒性的评估。就现有的情况可知，缺乏生物毒性的检测是安全保障的一个重大缺失，例如人为投毒，非法食品添加剂的出现，或是重金属离子的存在，均会严重威胁饮用者的健康。就现有的检测手段监管是无能为力的，因为物理或化学的检测方法往往比较滞后，只针对已知的化学物质进行检测，而目前大量的化学合成物的出现，令常规检测方法防不胜防，若用目前的国家标准的检测法检测，往往要几天才会有结果，不能在上市前就作出判断；另外，除了能得知检测物的浓度外，缺乏生物毒性的判断能力，例如可以查出汞之类的重金属的含量，但无法判断在该种含量状况时，该饮用水对食用者是否安全，尤其是国标中采用的某一方法只能是针对某种物质的，而对于未规定检测的物质则根本不会检测出来，所以往往会有漏检，导致急性中毒事件的发生。为防止饮用水出现威胁健康的事件，有必要推行一种全新的安全检测方法。目前，发光细菌毒性检测法已被广泛用于水质的污染及生物毒性判断，以其简便易行、检测成本低廉等优点而受到关注，可参见水质急性毒性的测定——发光细菌法，GB/T15441-1995;但若用海洋发光菌检测，则需在样品中添加氯化钠达到3%的终浓度，如此高浓度的氯化钠添加之后有可能改变样品的理化特性，影响测试的正确性。但尚未见有用于饮用瓶装水的快速安全检测。本发明的目的在于克服现有技术的不足，采用青海弧菌Q67培养基制成新鲜菌液或采用青海弧菌冻干粉制成测试用菌液，而设计出的一种快速的检测瓶装饮用水安全性的方法。为实现上述目的，本发明提出一种塑料瓶装饮用水急性生物毒性的检测方法，其特征在于步骤如下(l)制备测试用菌液采用新鲜菌液或冻干粉剂菌液，所述的新鲜菌液是将青海弧菌Q67菌株的斜面菌种，移接到新鲜斜面上，15-25t:培养12h-18h，此时细菌发光明亮，用10ml0.85%生理盐水将菌苔从斜面上轻柔冲刷下来，摇匀，用少量生理盐水调整菌液浓度，取O.lml调整后的菌液，加入置有2ml0.85%生理盐水的样品测试管中，用测光仪检测发光，选用发光强度在200-500万光子/秒的菌液作为新鲜菌液；所述的冻干粉剂菌液是在青海弧菌Q67冻干粉剂中加入5mL复苏液，充分混合，室温下下放置8_15分钟，使细菌恢复发光，即可作为测试用菌液；(2)制备样品取待检测瓶装饮用水，加入NaCl至终浓度为0.8%作为饮用水样品液；采用二次重蒸的亚沸点蒸馏水，加入NaCl至终浓度为0.8%作为对照样品液；剪取塑料瓶2g放入三角瓶内，加入15ml0.8%的NaCl溶液，以10『C灭菌30min，所得溶液即为塑料瓶浸渍液，制成抽提液，作为塑料瓶的检测样品液，备用；(3)对样品的发光检测取六个测试小杯，其中三个测试小杯分别加入2ml饮用水样品液或塑料瓶的检测样品液作为一组样品平行样，另三个测试小杯分别放入2ml对照样品液也作为一组对照平行样；在每组平行样中的三个测试小杯中每隔15s依次加入0.lml新鲜菌液或0.05ml冻干粉剂菌液，分别放置15min后，这样每组平行样之间隔15s就采用发光检测仪测定各测试小杯内样品的发光强度，然后计算相对发光强度。所述的用少量生理盐水调整菌液浓度为0D66。为0.20.5。所述的复苏液是摩尔浓度为0.05-0.2M，ffl值为6.0_9.0的磷酸缓冲液，或质量_体积百分比浓度为0.5-8.0%的葡萄糖液。饮用水的相对发光强度为95%150%安全，>150%或8095%可疑，<80%不安全。饮用水塑料瓶的相对发光强度为95%120%安全，>120%或8095%可疑，<80%不安全。本发明同现有技术相比，利用发光细菌对外界毒物有灵敏反应的特点，采用我国独有的一种淡水发光细菌——青海弧菌作为检测用菌种，采用我国独有的一种淡水发光细菌青海弧菌Q67菌株对各类毒物均有灵敏的反应，且所用的青海弧菌是淡水型发光菌，无需氯化钠就可生长和发光，因此测试样品中无需添加高浓度氯化钠，不会改变样品的理化特性，保证测试的正确性，用于瓶装水的安全检测，首先是检测速度快在1小时内可以得出结果，一般可以在出售前作检测，评估其食用安全与否；其次，是对食用安全性的判断是否有急性生物毒性物质存在于样品中，可对样品作出安全、不安全或可疑的判断。本发明中采用我国特有的淡水发光细菌_青海弧菌Q67菌株VibrioqinghaiensisQ67，是对存在于被测样品中所有毒物的综合毒性的反映，即使从未出现过的新的化学合成物，只要对生物体有毒，会对发光细菌发生影响，而灵敏地从发光细菌的发光强弱上反映出来，现代光子检测技术非常灵敏，极微弱的光强度发生了变化也可检测出来，所以用发光细菌的发光检测对毒物的反应极其灵敏，要比一般生物细胞反应灵敏几个数量级。发光检测用仪器采用北京滨松光子技术有限公司出品的BHP95114型水质毒性分析仪为测试用仪器。本发明中采用的青海弧菌Q67菌株VibrioqinghaiensisQ67，是由朱文杰，汪杰，陈晓耘等发现的一种发光细菌的新种，发表于文献海洋与湖沼，25(3):273-278，这种青海弧菌Q67培养基成分如下MgS042.47g、MgC030.79g、MgBr20.09g、MgCl20.109g、CaC030.103g、KC10.122g、NaCl8.29g、Mg(HC03)20.50g、酵母膏5g、胰胨5g、甘油3g、琼脂20g，溶于1000mL4蒸馏水中，将它制成斜面，于12rC灭菌20min，贮于4t:冰箱备用。发光菌冻干粉剂，采用由上述菌种制作成的冻干粉剂，这种冻干粉剂的专利号97106203.X，可以由市场购买，保存于-201:冰箱之中，使用前打开，用适量复苏液使之溶解，10分钟左右，恢复发光活力，就可以用于检测，这种复苏液参考华东师范大学学报(自然科学版，2008，4，58-65发表的，由米琴等撰文的《青海湖发光细菌的分离鉴定及电镜观发光检测数据的计算采用如下公式样品液三个平行样的平均发光值相对发光强度:对照样品液三个平行样的平均发光值xlOO%饮用水结果评价作用毒性分级相对发光强度安全95%150%可疑>150%或8095%不安全<80%饮用水塑料瓶结果评价作用类别相对发光强度安全95%120%可疑>120%或8095%不安全<80%实施例1—、测试用菌液准备1、新鲜菌液的准备用上述青海弧菌Q67菌株的斜面菌种，移接到新鲜斜面上，15-25t:培养12h_18h，此时细菌发光明亮，用10ml0.85%NaCl溶液，将菌苔从斜面上轻柔冲刷下来，摇匀，用少量生理盐水调整菌液浓度，使菌液浓度0D66。"0.3左右，取0.lml菌液，加入置有2ml生理盐水的样品测试管中，用测光仪检测发光，发光强度在200-500万光子/秒时，这种新鲜菌液就可作为测试用的菌液。2、冻干粉剂菌液的准备在青海弧菌Q67菌株冻干粉剂中加入5ml复苏液，充分混合，室温下下放置10分钟左右，使细菌恢复发光，得到冻干粉剂菌液，也可作为测试用菌液。实施例1瓶装纯净水水质毒性检测—、取样(1)瓶装水样品液用瓶装纯净水适量，加入NaCl至终浓度为0.8%。(2)对照水样品液用二次重蒸的亚沸点蒸馏水，加入NaCl至终浓度为0.8%。二、发光检测准备好三个测试小杯，每个小杯各加2ml瓶装水样品液，设为三个平行样；对照样品液也取三个测试小杯，各加入2ml，同样设置三个平行样，依次加入新鲜菌液0.lml或冻干粉菌液O.05ml作为测试用菌液，每个测试小杯加菌液的时间间隔为15s，放置15min后，用发光检测仪依次相隔15s测定各测量杯的发光强度，计算相对发光强度。三、发光检测数据的计算四、测试结果评价瓶装水样品液(采用新鲜菌液测试)批次数发光强度区间作用毒性分级H1120%150%2100%120%安全I3100%120%瓶装水样品液(采用冻干粉菌液测试)批次数发光强度区间作用毒性分级H2100%120%安全1120%150%1120%150%安全I2150%200%可疑2100%120%安全实施例2瓶装蒸馏水水质毒性检测—、取样(1)直接取蒸馏水样品取瓶装蒸馏水适量，加入NaCl至终浓度为0.8%。6(2)空白水样对照，用二次重蒸的亚沸点蒸馏水，加入NaCl至终浓度为0.8%。二、发光检测采用北京滨松光子技术有限公司出品的BHP95114型水质毒性分析仪为测试用仪器。可以使用冻干粉菌液，也可以使用新鲜菌液。准备好三个测试小杯，每个小杯各加2ml蒸馏水样品，设为三个平行样，空白水样对照也取三个测试小杯，各加入2ml，同样设置三个平行样，每个测试小杯间隔15s依次加入新鲜菌液O.lml或冻干粉剂菌液O.05ml，作为测试用菌液，每个测试小杯放置15min后，用发光检测仪依次相隔15s测定各测试小杯的发光强度，计算相对发光强度。三、发光检测数据的计算四、测试结果评价样品液(采用新鲜菌液测试)批次数发光强度区间作用毒性分级A1100%120%安全B2100%120%样品液(采用冻干粉剂菌液测试)批次数发光强度区间作用毒性分级A1100%120%安全B1150%200%可疑3100%120%安全实施例3瓶装天然矿泉水的检测—、取样(1)直接取矿泉水做样品液的准备用瓶装天然矿泉水适量，加入NaCl至终浓度为0.8%。(2)空白对照样品液的准备用二次重蒸的亚沸点蒸馏水，加入NaCl至终浓度为0.8%。二、发光检测准备好三个测试小杯，每个小杯各加2ml矿泉水样品液，设为三个平行样；对照样品液也取三个测试小杯，各加入2ml，同样设置三个平行样，依次加入新鲜菌液0.lml或冻干粉菌液O.05ml作为测试用菌液，每个测试小杯加菌液的时间间隔为15s，放置15min后，用发光检测仪依次相隔15s测定各测量杯的发光强度，计算相对发光强度。三、发光检测数据的计算测试结果评价7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>安全实施例4瓶装人工矿泉水的检测—、取样(1)直接取人工矿泉水样品液的准备用瓶装天然矿泉水适量，加入NaCl至终浓度为0.8%。(2)空白对照样品液的准备用二次重蒸的亚沸点蒸馏水，加入NaCl至终浓度为0.8%。二、发光检测准备好三个测试小杯，每个小杯各加2ml人工矿泉水样品液，设为三个平行样；对照样品液也取三个测试小杯，各加入2ml，同样设置三个平行样，依次加入新鲜菌液0.1ml或冻干粉菌液O.05ml作为测试用菌液，每个测试小杯加菌液的时间间隔为15s，放置15min后，用发光检测仪依次相隔15s测定各测量杯的发光强度，计算相对发光强度。三、发光检测数据的计算四、测试结果评价<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(1)空白对照样品液用二次重蒸的亚沸点蒸馏水，加入NaCl至终浓度为0.8%。(2)塑料瓶样品浸渍液的制备将塑料瓶样品剪成lcmXlcm的正方形，称取2g放入三角瓶里，加入15ml0.8%NaCl溶液，以108t:灭菌30min，所得溶液即为塑料瓶样品抽提液，作为塑料瓶待检测样品液，待用。二、发光检测准备好三个测试小杯，每个小杯各加2ml塑料瓶的待检测样品液，设为三个平行样；对照样品液也取三个测试小杯，各加入2ml，同样设置三个平行样，依次加入新鲜菌液0.lml或冻干粉菌液O.05ml作为测试用菌液，每个测试小杯加菌液的时间间隔为15s，放置15min后，用发光检测仪依次相隔15s测定各测量杯的发光强度，计算相对发光强度。三、发光检测数据的计算四、测试结果评价<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求一种塑料瓶装饮用水急性生物毒性的检测方法，其特征在于步骤如下(1)制备测试用菌液采用新鲜菌液或冻干粉剂菌液，所述的新鲜菌液是将青海弧菌Q67菌株的斜面菌种，移接到新鲜斜面上，15-25℃培养12h-18h，此时细菌发光明亮，用10ml0.85％生理盐水将菌苔从斜面上轻柔冲刷下来，摇匀，用少量生理盐水调整菌液浓度，取0.1ml调整后的菌液，加入置有2ml0.85％生理盐水的样品测试管中，用测光仪检测发光，选用发光强度在200-500万光子/秒的菌液作为新鲜菌液；所述的冻干粉剂菌液是在青海弧菌Q67冻干粉剂中加入5mL复苏液，充分混合，室温下下放置8-15分钟，使细菌恢复发光，即可作为测试用菌液；(2)制备样品取待检测瓶装饮用水，加入NaCl至终浓度为0.8％作为饮用水样品液；采用二次重蒸的亚沸点蒸馏水，加入NaCl至终浓度为0.8％作为对照样品液；剪取塑料瓶2g放入三角瓶内，加入15ml0.8％的NaCl溶液，以108℃灭菌30min，所得溶液即为塑料瓶浸渍液，制成抽提液，作为塑料瓶的检测样品液，备用；(3)对样品的发光检测取六个测试小杯，其中三个测试小杯分别加入2ml饮用水样品液或塑料瓶的检测样品液作为一组样品平行样，另三个测试小杯分别放入2ml对照样品液也作为一组对照平行样；在每组平行样中的三个测试小杯中每隔15s依次加入0.1ml新鲜菌液或0.05ml冻干粉剂菌液，分别放置15min后，这样每组平行样之间隔15s就采用发光检测仪测定各测试小杯内样品的发光强度，然后计算相对发光强度。2.如权利要求1所述的一种塑料瓶装饮用水急性生物毒性的检测方法，其特征在于所述的用少量生理盐水调整菌液浓度为0D66。为0.20.5。3.如权利要求1所述的一种塑料瓶装饮用水急性生物毒性的检测方法，其特征在于所述的复苏液是摩尔浓度为0.05-0.2M，ra值为6.0-9.0的磷酸缓冲液，或质量_体积百分比浓度为0.5-8.0%的葡萄糖液。4.如权利要求1所述的一种塑料瓶装饮用水急性生物毒性的检测方法，其特征在于饮用水的相对发光强度为95%150%安全，>150%或8095%可疑，<80%不安全。5.如权利要求1所述的一种塑料瓶装饮用水急性生物毒性的检测方法，其特征在于饮用水塑料瓶的相对发光强度为95%120%安全，>120%或8095%可疑，<80%不安全。全文摘要本发明涉及饮用水检测
技术领域：
，尤其涉及一种塑料瓶装饮用水急性生物毒性的检测方法，步骤如下采用新鲜菌液或冻干粉剂菌液，制备测试用菌液；制备饮用水样品液、对照样品液，及塑料瓶的检测样品液；然后制备饮用水样品液或塑料瓶的检测样品液作为一组样品平行样，再制备一组对照平行样；在每组平行样中加入0.1ml新鲜菌液或0.05ml冻干粉剂菌液，分别放置15min后，采用发光检测仪测定各测试小杯内样品的发光强度，然后计算相对发光强度。本发明同现有技术相比，采用我国独有的一种淡水发光细菌——青海弧菌作为检测用菌种，无需氯化钠就可生长和发光，不会改变样品的理化特性，保证测试的正确性，且检测速度快。文档编号G01N21/76GK101698862SQ20091019692公开日2010年4月28日申请日期2009年10月9日优先权日2009年10月9日发明者张亚旦,徐亚同,朱文杰申请人:华东师范大学