不健康细胞的侦测方法及其应用的制作方法

专利名称：不健康细胞的侦测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及有助于确认及侦测不健康细胞的方法及套组。本发明还提供帮助预测 一受试者是否为全身性地不健康以及罹患全身性疾病及症候群之风险的方法与套组，其系 利用脯氨酸导引蛋白激酶Fa/肝醣合成酶激酶3 α (proline-directed protein kinase Fa/ glycogen synthase kinase 3alpha，PDPKFA/GSK_3 α )作为诊断指标。
背景技术：
现在普遍认为骨髓是造血干/源祖细胞及间质干/源祖细胞的主要来源，且其衍 生物会被召募至受伤组织，以确保造血及骨骼肌肉系统的恒定。目前已知骨髓是维持全身 系统性恒定的主要物质，从伤口愈合到末期纤维化疾病及恶性肿瘤都扮演重要角色。骨髓 干细胞及源祖细胞及其衍生物(例如间质及发炎细胞)的内生性缺陷可能是造成伤口愈合 异常、慢性发炎、系统性疾病及症候群(如系统性纤维化、感染、梗塞、栓塞及多重器官衰竭 的)的主要成因。然而，骨髓衍生细胞(BMDCs)在正常愈合伤口、不愈合伤口(例如全身性 溃疡)，特别是在过度愈合伤口(例如全身性纤维化及腺瘤病)的争议性及似是而非的角 色依旧是解决现今骨髓相关系统性疾病、症候群及移植问题的重大挑战(Bingle et al, J Pathol,2002,196 :254_265 ；De Wever andMareel,J Pathol, 2003,200 :429_447 ；Dunsmore and Shapiro, J Clin Invest,2004,113 180-182 ；Condeelis and Pollard, Cell,2006， 124 263-266 ；Yin and Li, J Clin Invest, 2006,116 :1195_1201 ；Karnoub et al,Nature, 2007,449 557-563 ；Biswas et al, J Immunol,2008,180 2011-2017 ；Kisseleva and Brenner, Exp BiolMed,2008, 233 109-122 ；Lin et al, Cells Tissues Organs,2008, 188 178-188 ；Schafer and Werner, Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9 628-638 ；Valtieri andSorrentino，J Cell Physiol,2008, 217 296-300 ；ffynn, J Pathol,2008，214 :199_210 ； Mishra et al, Cancer Res,2009，69 :1255—1258)。起初脯氨酸导引蛋白激酶Fa(PDPK Fa)/肝醣合成酶激酶3alpha(GSK-3 α )被确 认为是一种特定蛋白去磷酸酶活化因子A(Vandenheede et al, J Biol Chem, 1980, 255 11768-11774 ；Yang et al,J Biol Chem，1980，255 :11759_11767 ；ffoodgett,EMBO J，1990， 9 =2431-2438)。本实验室更进一步确认了 PDPK FA/GSK_3 α具有多受质/多功能PDPK的特 征，其对各种癌细胞的抗细胞凋亡、肿瘤生成、入侵及化疗抗药性是必需的(Hsu et al, Br JCancer,2000,82 1480-1484 ；Hsu et al, Cancer,2000,89 :1004_1011 ；Yang et al, Clin Cancer Res,2000,6 1024-1030 ；Hsu et al, Cancer,2001,92 :1753_1758 ；Hsu et al, Int J Cancer, 2001,91 650-653 ；Chung et al, Cancer, 2002,95 1840-1847 ；Hsueh et al, Cancer, 2002,95 775-783 ；Fu and Yang, AnticancerRes, 2004, 24 1489-1494) 然而，此 讯息分子特别在骨髓衍生细胞中的系统性角色大部分依旧未知且需要被确立。无论病入膏肓的病因为何，如果在细胞内单一独特分子的出现及受试者的健康状 态之间存在着可被预测的关系，那将会大受激赏。发展一个在细胞内可广泛用来判断受试 者罹患不可治愈疾病风险的分子表达并未完成。
本案发明人鉴于现有技术中的不足，经过悉心试验与研究，并一本锲而不舍之精 神，终构思出本案“不健康细胞的侦测方法及其利用”，能够克服已有技术的不足，提供一种 利用细胞内PDPK FA/GSK-3a的表达测试受试者的不健康细胞存在的方法及其利用。另一 方面，本发明提供一种用以预测受试者是否为全身性地不健康以及处于罹患全身性疾病及 症候群的风险中的方法。以下为本案之简要说明。

发明内容
本发明所提供的不健康细胞是一可广泛应用的预测因子，用来早期侦测系统性失 调及骨髓中内生性缺陷所造成之全身性纤维化、免疫抑制、感染、梗塞、栓塞及多重器官衰 竭相关的造血、凝血、恒定及免疫系统的失衡。更有甚者，不健康细胞是一可靠的预测因子， 用以测定受试者是否为全身性不健康及不论其病因的起源，罹患不可治愈全身性疾病的风险。因此，本发明一方面提供一种侦测细胞(优选为骨髓衍生细胞)表达的方法，用来 做为具有不健康细胞的指标。本发明方法包括由所述受试者获得一生物样本；测定该样本 的细胞内的脯氨酸导引蛋白激酶Fa/肝醣合成酶激酶3a (PDPK Fa/GSK-3 α )表达，其中在 该受试者细胞内的PDPKFA/GSK-3a表达程度的增加表示不健康细胞的存在。在一实施例 中，PDPKFA/GSK-3a的表达由分析PDPK FA/GSK_3 α蛋白含量而决定，例如使用对PDPK Fa/ GSK-3 α专一的抗体的免疫试验法。在另一实施例中，该表达由试验活性、蛋白、mRNA、DNA 含量来确定。生物样本选择为骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、腹水、胸膜积水或体液。本发明另一方面提供鉴定生物样本中不健康的细胞用来预测一受试者是否为全 身性地不健康及罹患全身性疾病、症候群的风险。本发明又一方面提供一种用以测定生物样本中出现不健康细胞的诊断套组，该诊 断套组至少包括用来测定所述样本中PDPK Fa/GSK-3 α表达的试剂，以及用来试验不健康 细胞存在，共同包装于一容器内的印刷操作说明。进一步的侦测试剂也可被涵盖。本发明再一方面提供一种预测一受试者是否为全身性地不健康及罹患全身性疾 病、症候群风险的方法。该方法包括从所述受试者获得一生物样本；测定在该样本中的PDPK Fa/GSK-3 α的表达，其中将PDPK FA/GSK-3 α表达程度的增加与所述受试者的正常细胞进 行比较，预测受试者是否为全身性地不健康以及罹患全身性疾病及症候群的风险。在一实 施例中，PDPKFA/GSK-3a的表达由分析PDPK FA/GSK_3 α蛋白含量而决定，例如使用对PDPK Fa/GSK-3 α专一的抗体的免疫试验法。在另一实施例中，该表达由试验活性、蛋白、mRNA、 DNA含量来确定。生物样本选择为骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、腹水、胸膜积水或体 液。如有必要，如同Moioli等人(PLoS ONE, 3 :e3922，2008)所述，这些细胞可以由特 殊磁珠或流式细胞分选仪分离出来，用以侦测不健康细胞中高度表达的PDPK FA/GSK_3a。当了解了以下的详细说明、附图以及实例后，本发明的这些及其它目的及特征将 全然显而易见。


图IA 骨髓衍生细胞(BMDC)中PDPK FA/GSK_3 α的异常表达，PDPKFA/GSK_3 α以
4CD34共同染色的阳性型态；图IB 骨髓衍生细胞(BMDC)中PDPK FA/GSK_3 α的异常表达，PDPKFA/GSK_3 α以 CD34共同染色的阴性型态；图1Α、1Β表示骨髓衍生细胞(BMDC)中PDPK FA/GSK_3 α的异常表达，其系在具有 愈益严重疾病的血癌病人骨髓中，与PDPK Fa/GSK-3 α极高度表达(> 3+)相关的⑶34+及 ⑶34-干/源祖细胞的稀少数量以及具有PDPKFA/GSK-3a中度-高度表达(2+至3+)的该 可能衍生物的共同免疫组织化学染色。PDPK Fa/GSK-3 α免疫染色以DAB (3_3，diaminoben zidinetetrahydrochloride)呈色为红棕色。BCIP/NBT溶液被使用以显现该共同染色抗体 而呈现蓝色。每一切片以甲基绿溶液对比染色而在细胞核呈现绿色。以PDPK Fa/GSK-3 α 及⑶34共同染色的细胞呈紫黑色。图2Α 不同种类的可治愈第I期肿瘤基质的PDPK FA/GSK_3 α异常表达的各种病 患之Kaplan-Meier不发病存活(DFS)曲线；图2B 不同种类的可治愈第I期肿瘤基质的PDPK FA/GSK_3 α异常表达的各种病 患之Kaplan-Meier整体存活(OS)曲线；图2A、2B表示如表1所示的具有极早期第I期肿瘤的各种病患之Kaplan-Meier 不发病存活(DFS)及整体存活(OS)曲线，包含有乳房、胆管、结肠、子宫颈、食道、胃、肝脏、 肺脏、口腔、卵巢、胰脏、前列腺及肾脏的基质组织内被召募的BMDC，PDPK Fa/GSK-3 α是否 异常表达。图3Α在第期肿秀直基质中PDPKFa/GSK--3 α以CD34共同染色的阳性型态；
图3Β在第期肿秀直基质中PDPKFA/GSK--3 α以CD34共同染色的阴性型态；
图3C在第期肿秀直基质中PDPKFA/GSK--3 α以vimentin共同染色的阳性型态
图3D在第期肿秀直基质中PDPKFA/GSK--3 α以vimentin共同染色的阴性型态
图3Ε在第期肿秀直基质中PDPKFA/GSK--3 α以CD68共同染色的阳性型态；
图3F在第期肿秀直基质中PDPKFA/GSK--3 α以CD68共同染色的阴性型态；
图3G在第期肿秀直基质中PDPKFA/GSK--3 α以α-SMA共同染色的阳性型态；
图3Η在第期肿秀直基质中PDPKFA/GSK--3 α以α-SMA共同染色的阴性型态。图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H 描述在第 I 期肿瘤基质中 PDPKFA/GSK_3 α 显示的 异常表达型态，其系为与PDPK Fa/GSK-3 α极高度表达(> 3+)相关的CD347vimentirT、 CD34+/vimentin+及 CD347vimentin+细胞的稀少数量，及与 PDPK FA/GSK_3 α 中度-高 度表达(2+至3+)相关的其衍生物vimentin+纤维母细胞/间质细胞、⑶68+巨噬细胞及 α-SMA+肌纤维母细胞的相对大数量的共同免疫组织化学染色。PDPK FA/GSK-3 α免疫染色 以 DAB(3-3，diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色为红棕色。BCIP/NBT 溶液被使 用以显现该共同染色抗体而呈现蓝色。每一切片以甲基绿溶液对比染色而在细胞核呈现绿 色。以PDPK Fa/GSK-3 α及其它标帜物共同染色的细胞呈紫黑色。图4Α 来自癌症家族或罹患重复发炎循环的孩童周边血液中PDPKFa/GSK_3 α阳 性型态；图4Β 来自癌症家族或罹患重复发炎循环的孩童周边血液中PDPKFa/GSK_3 α阴 性型态。图4Α、4Β证实以PDPK FA/GSK-3 α作为早期不健康讯号，其为来自癌症家族或
5罹患重复发炎循环的孩童周边血液中，与PDPK Fa/GSK-3 α高度表达的⑶34+类纤维球 的共同免疫细胞化学染色。PDPK Fa/GSK-3 α免疫染色系以DAB(3-3，diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色为红棕色。BCIP/NBT溶液被使用以显现该共同染色抗体而呈现 蓝色。每一切片以甲基绿溶液对比染色而在细胞核呈现绿色。以PDPK Fa/GSK-3 α及其它 标帜物共同染色的细胞呈紫黑色。图5证实PDPK Fa/GSK-3 α作为极早期不健康讯号，其是在罹患川崎症候群的免疫 系统疾病特征的全身性不健康孩童的脐带血中，与PDPKFa/GSK-3 α高度表达相关的CD34+ 造血干/源祖细胞的共同免疫细胞化学染色。PDPK Fa/GSK-3 α免疫染色以DAB (3_3’diam inobenzidinetetrahydrochloride)呈色为红棕色。BCIP/NBT溶液被使用以显现该共同染 色抗体而呈现蓝色。以PDPK Fa/GSK-3 α及其它标帜物共同染色的细胞为紫黑色。
具体实施例方式本案所提出的“不健康细胞的侦测方法及其应用，，通过以下具体实施例得到充分 说明，使得熟知本领域的技术人员可以据以完成，然而本案的实施仅是实施例性的，并不对 本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范 围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发 明的保护范围内，皆当属于本发明之范围。为清楚揭露，而不是限定，本发明的详细描述被细分为如下的次段落。Α.定义除非有其它定义，所有在此所用的技术及科学词汇，如同作为本发明所属技术领 域中具有一般技术人员一般性地了解具有相同意义。在此指称的所有专利、申请案、公开申 请案及其它应用，以及基因库登录号皆完整以参考文献被整合起来。如果本发明中的定义 与其它专利、申请案、公开申请案及其它在此引用的参考文献所提出的定义相反或不一致， 以本发明提出的定义为主。本发明使用的“一”是指“至少一个”或“一个或多个”。本发明所使用的术语“PDPK Fa/GSK-3 α ”指多受质/多功能的脯氨酸导引蛋白激 酶 FA，亦为已知的肝醣合成酶激酶 3 α (ffoodgett, EMBO J, 1990,9 =2431-2438 ；Yang, Curr Cancer Drug Targets，2004，4 :591_596)。此蛋白的基因库登录号为 AAD11986 (SEQ ID NO. 1)及 AAH27984(SEQ ID NO. 2)。本发明所使用的术语“生物样本”指来自于一生物来源的任何样本，包括但并未限 制于骨髓、血液、组织样本、腹水、胸膜积水或体液。本发明所使用的术语“抗体“指包括必要的变异区序列，以专一性地键结一抗原决 定位的分离或重组结合试剂。因此，抗体是展现预期生物活性的任何型式的抗体或抗体片 段，例如，结合特定的目标抗原。因此，只要抗体展现所要求的生物活性，例如专一性地结合 PDPK Fa/GSK-3 α时，其用于最被广泛认知及特定地涵盖单株抗体(包括全长单株抗体)、 多株抗体、人类抗体、拟人化抗体、嵌合抗体、奈米抗体、双价抗体、多重专一抗体(例如双 特异抗体)及包括但不限定于scFv、Fab及Fab2的抗体片段。本发明所使用的术语“受试者“指任何活体，受试者优选为哺乳类。示范性的受试 者包括但不限定于人类。
本发明所使用的术语“不健康细胞”指一与PDPK Fa/GSK-3 α异常表达相关的细 胞，优选为骨髓衍生细胞。除非特别说明，对熟悉所属技术领域、本发明所使用的实例、生化及临床病理学技 术的常用技术，所有在此使用的术语具有与一般技术人员的知识相同的意义。B.用以侦测不健康细胞的方法及套组与PDPK Fa/GSK-3 α异常表达相关的细胞，优选为骨髓衍生细胞，称为不健康细 胞，提供一工具用以鉴定受试者是否为全身性地不健康以及罹患全身性疾病及症候群的风 险。一方面鉴定一生物样本中不健康细胞可用来预测全身性疾病及症候群的形成。因此，本发明一方面提供一种侦测受试者具有不健康细胞表达的方法，该方法包 括由所述受试者获得一生物样本，测定在该样本中的细胞内PDPKFA/GSK_3 α表达程度，如 果该受试者的细胞内PDPK Fa/GSK-3 α表达程度增加，则指示不健康细胞的存在。在一实施 例中，PDPK Fa/GSK-3 α的表达由分析PDPK FA/GSK_3 α蛋白含量而测定，例如使用对PDPK Fa/GSK-3 α专一的抗体的免疫试验法。在另一实施例中，该表达由评估活性、蛋白质、RNA 或DNA含量而测定。生物样本选择为骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、腹水、胸膜积水或 体液。本发明另一方面提供一种用以测定一生物样本中不健康细胞之存在的套组，其中 至少包括用以测定所述样本的细胞中PDPK Fa/GSK-3 α表达的一试剂，以及共同包装于一 容器、用以评估PDPK Fa/GSK-3 α相对量的印刷操作说明。任何侦测PDPK Fa/GSK-3 α表达的适当装置可能被使用。该表达可由评估生物样 本中细胞的活性、蛋白、RNA或DNA含量而测定。例如，使用对PDPK FA/GSK_3 α专一的抗体 的免疫试验法可被使用。适当方法包括但不限定于免疫组织化学分析、免疫细胞化学分析、 流式细胞分析、西方点渍分析、北方点渍分析、反转录-聚合酶链反应及针对特定受质的磷 酸化试验。利用免疫组织化学染色技术，一般利用脱水及固定方式来制备一细胞样本，再与 耦合基因产物专一的标帜抗体进行反应，该标帜物通常是视觉上可侦测的，例如酵素标帜 物、荧光标帜物、冷光标帜物及其类似物。根据一实施例，由受试者取得组织样本，并且根据传统组织表装技术，包埋该样本 再切片为例如3-5 μ m、表装及干燥。固定液可包括福尔马林。用以表装切片的包埋液可包 括，例如石蜡。样本可储存于此条件下。去石蜡及水合后，样本与包含对PDPK Fa/GSK-3 α 专一的抗体的免疫试剂接触。抗体包含多株或单株抗体。抗体包括完整抗体或能专一性地 结合PDPKFa/GSK_3 α蛋白的抗体片段。适当的多株抗血清或其它抗体由以PDPKFA/GSK_3 α 蛋白或该蛋白的合适片段免疫合适的寄主动物而进行制备，并依据本技术领域的一般技术 人员所知的通常技术收集及纯化抗血清。专一性地与PDPK Fa/GSK-3 α反应的单株或多株 抗体，优选为单株抗体，可由本领域所熟知的方法制作。参阅例如=Harlow及Lane (1988) 《抗体实验室操作手册》，冷泉港实验室，及G0ding(1986)《单株抗体原理及应用》，第二 版，学术出版社，纽约。而且，重组蛋白可由本领域所知的方法制作，包括但不限定于美国专 利号4，816，567描述的方法，或由商业上获得。具有IO8M4亲和力的单株抗体是较佳的，更 佳地为IO9至IOkT1或更高。抗体不是直接地就是间接地带有一合适的侦测标帜物。或者，侦测标帜物可结合 至一次级抗体，例如可与初级抗体结合的羊抗兔免疫球蛋白G。多胜肽及抗体以共价或非
7共价的方式结合一提供侦测信号的物质来被标帜。合适的标帜物包括但不限定于放射性核 酸、酵素、受质、辅助因子、抑制剂、荧光试剂、冷光试剂、磁性粒子及类似物。任何合适的方法可被用以由一受试者获得一生物样本。生物样本选择为周边血 液、脐带血、骨髓、组织样本、腹水、胸膜积水或体液。用以测定一受试者是否为全身性地不健康或处于罹患全身性疾病及症候群的套 组将包括至少一容器，其至少包含一用以测定在此定义的细胞中PDPK Fa/GSK-3 α表达试 剂，及用以评估一生物样本中的细胞是否含有一或多个不健康细胞的印刷操作说明。如本 发明所使用的术语“试剂”是指任何用于完成本发明所提供的任何方法的化合物、组合物或 生物试剂(即样本、液体、或细胞“剂量”、抗体等)，包括但不限定于用于PDPK Fa/GSK-3 α 的抗体，缓冲液及用于分离及制备细胞的载体、及/或用以分析及处理的膜，用于完成饱和 及竞争结合试验的缓冲液及载体，及放射性及非放射性标帜化合物。印刷操作说明也将包 括试验结果与不健康细胞表达型对照的操作说明。C.实施例除了其它在特定实施例所指出，所有免疫组织化学分析、免疫表达型分析、免疫细 胞化学分析及统计分析以下列方法进行。专一的杭PDPK F /GSK-3 α杭体的牛产、鉴定及特ffi对应于PDPK Fa/GSK-3 α氨基酸序列471-483的羧基终端区域的胜肽 QSTDATPTLTNSS由胜肽合成仪合成(型号9050，Milligen, Bedford,马里兰州)。根据 Reichlin(1980)描述的过程，为了便于将胜肽耦合到牛血清蛋白，利用戊二醛作为交互连 接器，将半胱胺酸残基加至NH2端。经过亲和管柱纯化，并且产物可被PDPK Fa/GSK-3 α的 氨基酸471-483的C端胜肽中和，实验的结果均证明此抗PDPK FA/GSK_3 α抗体具有免疫 的专一性。免疫组织化学分析以福尔马林固定、石蜡包埋、含有最多肿瘤细胞之肿瘤的组织切片(5μπι)于 二甲苯中脱蜡，接着于浓度渐减的乙醇中水合。内生性过氧化酶以3%过氧化氢阻断 (blocking)，再以牛血清蛋白阻断5分钟。再将玻片培养于以0. 05M Tris缓冲液(pH 7.4) 稀释的抗PDPK Fa/GSK-3 α抗体(2 μ g/mL)中于4°C作用16小时，再与超级增强剂(super enhancer,Super Sensitive Non-Biotin Detection System,BioGenex,San Ramon,CA)于 室温培养20分钟，并以polymer-HRP(Super Sensitive )标帜物培养30分钟。免疫染色 法最后以DAB(3-3，diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色。在抑制酵素反应后，将 玻片在室温下培养于DS-enhancer(Zymed，San Francisco，CA) 5分钟，以防止两种染色系统 间的交互作用。之后，将玻片在室温下培养于⑶34、波形蛋白(vimentin)、⑶68或α-SMA 抗体中1小时。清洗后，将玻片在室温下培养于抗小鼠碱性磷酸酶30分钟。使用BCIP/NBT 溶液以显现键结的抗体。以甲基绿溶液对比染色切片。免疫细胞化学分析于室温、700rpm下将平均1 X IO6个细胞将细胞离心(Kubota 5200，日本)3分钟， 使细胞贴附在涂覆聚离胺酸的玻片上。染色前，细胞聚落(cytospots)以3.7%三聚甲醛 固定15分钟，并以0.2% Triton X-100处理90秒。内生性过氧酵素将被3%过氧化氢阻 断，再以胎牛蛋白阻断10分钟。将玻片培养于4°C、稀释于0.05M Tris缓冲液(pH 7.4)的抗 PDPK Fa/GSK-3 α 抗体(2 μ g/mL)中 16 小时，再与超级增强剂(super enhancer, Super Sensitive Non-Biotin Detection System, BioGenex, San Ramon, CA)于室温培养20 分钟， 以及另以polymer-HRP(Super Sensitive )标帜物培养30分钟。免疫染色最后以DAB(3， 3，diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色。在抑制酵素反应后，将玻片于室温下培 养于DS_enhancer(Zymed，San Francisco, CA) 5分钟，以防止两种染色系统间的交互作用。 之后，将玻片在室温下培养于⑶34、vimentin、⑶68或α-SMA抗体中1小时。清洗后，将玻 片在室温下培养于抗小鼠碱性磷酸酶30分钟。使用BCIP/NBT溶液以显现键结的抗体。以 甲基绿溶液对比染色玻片。统计分析在本发明之统计分析中，样本区分为1.组织样品检测结果具有不健康细胞和 2.组织样品检测结果不具有不健康细胞两个组别。整体存活率系从诊断日至死亡日或后续 治疗日止进行计算。未发病存活率系从诊断日至复发日止进行计算。Kaplan-Meier方法系 用以测定存活机率，而对数级距试验系用以比较组间存活曲线。依据需要使用卡方检定、学 生t试验及Marm-Whitney U试验以比较两组。影响系以Cox比例风险模型进行分析。罗 吉斯回归系用以计算癌症家族中出现不健康细胞的风险。P < 0. 05被认为具统计上地显著 性。本研究是由在台湾的国家科学委员会核准的研究计划及经费并在知情同意书及 该机构的监督伦理委员会的核准下执行。以下实施例被提供用以说明但并非限定该发明。实施例1、骨髓衍生细胞中的PDPK F./GSK-3 α异常表达为了在骨髓衍生细胞(BMDC)中证实PDPK FA/GSK_3 α的全身性角色，对24位白 血病病患的骨髓进行独立的群组研究。PDPK Fa/GSK-3 α异常表达常可在具有进展性疾病 的白血病病患的BMDC中侦测。在24例的群组研究中，14例为阴性，而10例被发现与PDPK Fa/GSK-3 α异常表达相关。⑶34 (BD Pharmingen，与第三类⑶34抗原决定位专一性反应 的581/CD34株，用以专一性的辨识人类造血干/源祖细胞)的免疫表达型进一步显示相 对于阴性病例(图1B)，一小族群的CD34+造血干/源祖细胞及CD34-间质干/源祖细胞 (Moioli et al，PLoS ONE, 2008, 3 :e3922)的 PDPK FA/GSK_3 α 极强度表达(> 3+)及其有 PDPK Fa/GSK-3 α的中度至高度表达(2+至3+)的衍生物(图1Α)常可在具有恶化性疾病 的病患的骨髓中侦测得到。目前已知特别在异常伤口愈合过程及慢性发炎过程中BMDC会 被召募至全身各大重要器官的受伤组织。异常伤口愈合可为大部分人口发病率及死亡率的 重要成因。因此，正面而言，BMDCs对许多疾病是具有潜力的疗法，包括末期缺血性心脏病、 动脉狭窄及成骨不全症。相反地，负面而言，BMDCs促进在许多重要器官包括肝、肺、肾、小 肠、骨髓及不同肿瘤周围的全身性纤维化，意味着BMDCs相反地也参与在全身性疾病形成 及恶化的过程中(LeBousse-Kerdiles et al,Eur Cytokine Netw，2008，19 69-80 ；Lin et al, CellsTissues Organs，2008，188 178-188)。由于多受质 / 多功能 PDPK 的性质，BMDC 的PDPK Fa/GSK-3 α异常表达可显示全身性疾病形成及发展的基本机制。总而言之，骨髓 研究的结果提供最初证据以证明多受质/多功能PDPKFa/GSK_3 α作为在内生性失调骨髓 中的BMDC系统性不健康讯号的角色。实施例2、在不同种类的可治愈第I期肿瘤基质的PDPK F./GSK-3 α异常表达
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在本实施例中，用于免疫组织化学分析的基质组织标本经由在1987-2004年间在 台湾台北国立台湾大学附设医院治疗的极早期第I期肿瘤的367位病患的就医纪录的详细 事后审查。表1显示基质组织位置、年龄、性别、存活状态及PDPK Fa/GSK-3 α状态。病人 被观察至2006年4月。表1、病患特征 即使在手术切除肿瘤后，经常可在具有较差预后的各种第I期肿瘤的基质侦测到 PDPK Fa/GSK-3 α异常表达。在367例第I期肿瘤的群组研究中，240例为阴性，而127例为与 PDPK Fa/GSK-3 α异常表达相关。若病人肿瘤基质内有此讯号分子异常表达，则此等病人容 易有较差的愈后(图2)。⑶34、⑶68、vimentin及α-平滑肌蛋白(α-SMA)的免疫表达型分 析进一步显示即使在手术切除后，较差预后第I期肿瘤基质中有一小族群PDPK Fa/GSK-3 α 极高度表达(> 3+)的CD34+/vimentin-造血干/源祖细胞、CD34+/Vimentin+纤维球及 CD347vimentin+间质干 / 源祖细胞(Bucala, Fibrocytes, World ScientificPub Co Inc, 2007 1-18 ；Moioli et al，PLoS ONE，2008，3 :e3922)(图 3A及图 3C)如实施例 1 所述，伴随 着相对较大族群PDPK Fa/GSK-3 α中度至高度表达(2+至3+)的CD68+巨噬细胞(图3Ε)、 vimentin+纤维母细胞及间质细胞(图3C)及α -SMA+肌纤维母细胞(图3G)。相反的是，有良好结果的病例则呈现PDPKFA/GSK-3a阴性反应(请参阅图3B、3D、3F、3H)。不管是乳房、 胆管、大肠直肠、子宫颈、食道、胃、肝、肺、口腔、卵巢、胰脏、前列腺及肾脏的间质，若有PDPK Fa/GSK-3 α异常表达，第I期病患倾向罹患系统性纤维化、感染、阻塞、栓塞、溃疡、上消化道 出血及多重器官衰竭。Cox回归分析更进一步显示与阴性第I期病患相较，阳性第I期病患 具有超过6倍罹患系统性疾病及症候群的风险(发病存活率的危险比为6. 258，95%信赖 区间为 4. 125-9. 493，P < 0. 001)。虽然 Hanahan 及 Weinberg(Cell，2000，100 :57_70)列 举了癌症特征，现行的疗法仍对大约一半的病人无效。近来的研究提出挑战，认为无法治愈 的早期肿瘤仅为系统性骨髓疾病的最终产物，且仅为系统性慢性疾病的一小部分。骨髓及 肿瘤基质之间的密切关系现已被更广泛地认定。有越来越多的证据显示在许多情况下，不 管是从伤口愈合异常到末期全身性纤维化疾病及/或肿瘤，骨髓是间质系细胞的来源，并 且BMDC是一种会大量被召募至纤维化或肿瘤组织基质的细胞型态(Direkze andAlison, Hematol Oncol，2006，24 :189_195 ；Bellini and Mattoli，Lab Invest,2007,87 :858_870 ； Karnoub et al,Nature,2007,449 557-563 ；Lin et al,Cells TissuesOrgans,2008,188 178-188)。目前已知，除了局部固有的细胞及上皮间质转化(EMT)过程之外，BMDCs是从伤 口愈合异常到末期系统性纤维化疾病及/或肿瘤生成的系统性组织恒定之原始来源。骨 髓干细胞及源祖细胞及其衍生物(例如基质及发炎细胞)中的内生性缺陷可为伤口愈合 异常、慢性发炎及上述相关的系统性疾病及症候群的主要成因。因此，若以局部切除无法 治愈第I期肿瘤的疾病本质上不再单纯是特定的肿瘤疾病；它们在开始时即为寄主性、骨 髓系统性疾病。总之，本发明之结果提供进一步的证据，证明以PDPK Fa/GSK-3 α作为内生 性失调骨髓中的BMDC系统性不健康讯号之角色。无论病入膏肓的病因起源为何，综合结 果确立PDPK Fa/GSK-3 α作为受试者的系统性伤口愈合异常及全身性不健康状态的极早预 测的系统性讯号。综合以上结果支持现有的见解肿瘤及/或纤维化组织的基质通常伴随 多种基质细胞的召募，像极了异常愈合的伤口，承接了不断储存的生长因子、细胞因子、基 质重组蛋白及结缔组织元素，最后引起多重器官衰竭。综合结果也与 下列见解一致如同 Takaishi等人(J Clin Oncol, 2008, 26 =2876-2882)提出的观点，若被召募至慢性发炎组 织，BMDC可能是最早期未受约束的癌干细胞。值得一提地，在某些情况，我们确实观察到一 小族群的CD44+细胞(癌干细胞的特征标志)在不可治愈第I期肿瘤的基质中有PDPK Fa/ GSK-3 α极高度表达。藉由利用PDPK FA/GSK_3 α及实施例I及II说明的BMDC系统，用以 能普遍性地测定受试者罹患系统性疾病及症候群风险的应用分子及细胞表达图谱可被建 立。不论其病因起源为何、但由于在伤口异常愈合期间的系统性种下病原，本发明确立PDPK Fa/GSK-3 α在BMDC的表达可作为受试者之非常可靠的预测因子，用来预测受试者罹患无可 救药的系统性疾病的可能性。实施例3、在发炎纤维化组织中PDPK F./GSK-3 α的异常表达根据前述建立的见解，PDPK Fa/GSK-3 α异常表达确实可经常在发炎纤维组织中 被侦测。在包括26例没有纤维化及9例纤维化的35例鳞状增生组织的独立群组研究中， 如同第1图及第3图所示的，有PDPK Fa/GSK-3 α异常表达的BMDC在具有纤维化的增生组 织中被显著地侦测到，9例纤维化中的7例被发现为PDPK Fa/GSK-3 α阳性。相反地，26例 没有纤维化组织中的18例被发现为PDPK Fa/GSK-3 α阴性(卡方检定，ρ = 0. 022)。⑶34、 ⑶68、vimentin及α -SMA的免疫表达型分析还显示有一小族群PDPKFA/GSK_3 α极高度表达(> 3+)的CD34+/vimentirT造血干/源祖细胞、CD34+/vimentin+纤维球及CD347 vimentin+间质干/源祖细胞，判随着相对较大族群PDPK FA/GSK-3 α中度至高度表达(2+ 至3+)的⑶68+巨噬细胞、Vimentin+纤维母细胞及间质细胞及α -SMA+肌纤维母细胞可经 常在发炎纤维组织中被侦测，相对地没有纤维化组织则呈现阴性，此已在实施例I及II说 明。越来越多的证据显示在组织中，尤其在发炎纤维化组织的伤口异常愈合期间，如同图1 所示的BMDCs将会干/源祖细胞及其衍生物(例如vimentin+纤维母细胞、α -SMA+肌纤维 母细胞及CD68+巨噬细胞)之新来源。纤维化疾病为世界各地发病及致死率的重要成因，其 发生在多种重要器官且系统性纤维化过程于所有组织是一致的。涉及此过程中的不同BMDC 种类可共同刺激结缔组织成分储存，而逐渐破坏正常组织的构造及器官功能丧失而导致死 亡(Dunsmore and Shapiro, J Clin Invest, 2004,113 180-182 ；Bellini and Mattoli, Lab Invest, 2007,87 858-870 ；Bucala,Fibrocytes,WorldScientific Pub Co Inc,2007 1-18 ；Le Bousse-Kerdiles et al,Eur Cytokine Netw,2008,19 :69_80 ;Lin et al,Cells Tissues Organs, 2008,188 :178-188)。总之，如上所述，本发明之结果提供证据以证明PDPK Fa/GSK-3 α异常表达的BMDC与伤口愈合异常及慢性发炎的纤维化特征相关。在实施例1 至3所示的所有结果共同提供进一步的证据，证明PDPK Fa/GSK-3 α作为在骨髓中内生性 失调的BMDC不健康讯号系统性角色。棚仿丨丨4、*自赫雜舰患前H翻白姊浦赫少励血麵 PDPK F./GSK-3 α 异常表达有许多证据显示了在周边血液的⑶347vimentin+纤维球，即在血液中骨髓衍 生基质源祖，在伤口愈合异常及发炎纤维化过程期间为的纤维母细胞及肌纤维母细胞的 新来源(Bucala et al, Mol Med, 1994,1 71-81 ；Schmidt etal, J Immunol, 2003,171 380-389 ；Bellini and Mattoli, Lab Invest,2007,87 858-870 ；Bucala, Fibrocytes, World Scientific Pub Co Inc，2007 :1-18 ;Lin etal,Cells Tissues Organs,2008,188 178-188)。不谋而合地，PDPK FA/GSK_3 α高度表达在似⑶34+纤维球可在来自3个不同家 庭的3个不断反复发炎的孩童周边血液中全部侦测到(图4)。这类主要源自BMDC的不健 康细胞与人类疤痕增生、肾因性全身性纤维化症、动脉粥样硬化病变及肺纤维化相关。综合 实施例1至3，该结果提供综合证据以证明PDPK Fa/GSK-3 α作为骨髓中内生性失调的BMDC 极早期不健康讯号的系统性角色。根据此概念，33位(13位男性及20位女性)年龄介于10至65岁(平均士标准 差，42. 5士 13. 1)的受调查正常个体中，癌症家族成员容易在其血液中侦测到不健康细胞 (P = 0.001)。罗吉斯回归显示癌症家族成员与非癌症家族成员相较，具有超过13倍出现 不健康细胞的风险(出现不健康细胞的胜算比为13. 333，95%信赖区间为2. 454-72. 452,ρ =0.003，表2)。该结果还证明癌症家族成员容易在骨髓中发展出有高度PDPK Fa/GSK-3 α 表达的不健康BMDCs的内生性缺陷，如实施例1至4所建立，其提供一种预测是否一受试者 为系统性地不健康及处于罹患系统性疾病及症候群风险的方法。表2、在癌症家族中出现不健康细胞的风险 缩写95% CI为95%信赖区间*ρ < 0. 05被视为具有统计上显著性(I"卡方检定， 罗吉斯回归)实施例5、罹患、川崎氏症候群的系统t牛不健康幼)L的脐带血中的PDPKR/GSK-3CI
异常表汰在同意上述显示的结果下，这种不健康的BMDC也可在罹患川崎氏症候群(特性为 免疫系统失调)的系统性不健康幼儿的脐带血中被侦测(图5)。该结果提供进一步的证据 以证明PDPK Fa/GSK-3 α作为与脐带血及骨髓干/源祖细胞相关的极早期不健康讯号分子 的系统性角色。综合全部结果，本发明已确立PDPK Fa/GSK-3 α作为一受试者BMDC系统性 不健康的讯号，从极早症状发展中时期至极末症候群已形成时期，系统性疾病整个病程都 可涵盖。实施例6、在非伤口愈合-溃疡中的PDPK F /GSK-3 α异常表汰PDPK Fa/GSK-3 α异常表达可经常在溃疡性间质中被侦测。在39例带有溃 疡的口腔组织之独立群组研究中，39例中的34个在BMDCs的分层族群(hierarchical population)上有PDPK FA/GSK_3 α异常表达，BMDCs分层族群包括有一小族群PDPK Fa/ GSK-3 α 极高度表达(> 3+)的 CD34+/vimentin_ 造血干 / 源祖细胞、CD34+/vimentin+ 纤 维球及CD347vimentin+间质干/源祖细胞，判随着相对较大族群PDPK FA/GSK_3 α中度至 高度表达(2+至3+)的衍生细胞，如前所述。该结果提供进一步的证据以证明PDPK Fa/ GSK-3 α作为骨髓中内生性缺陷的BMDC与受损伤口愈合相关的不健康讯号的系统性角色。综上所述，本发明已确立PDPK Fa/GSK-3 α作为一个极早期不健康讯号，而且也是 骨髓及脐带血中最后的致死讯号。PDPK Fa/GSK-3 α因此可作为BMDC的内生性失调的系统 性的不健康讯号。因此，本发明提供一种侦测系统，可以在移植前诊断及预测骨髓及脐带血 的健康及疾病状态。在本发明显示的不健康BMDC及PDPK Fa/GSK-3 α可作为极早期用以 预测受试者与系统性骨髓问题相关的终身健康及疾病状态的分子及细胞系统。综上所述，本发明提供一种利用PDPK Fa/GSK-3 α作为一诊断标帜物预测受试者 是否为系统性地不健康及处于罹患系统性疾病及症候群的风险的方法。本发明实属难能的创新发明，深具产业价值，援依法提出申请。此外，本发明可以 由本领域技术人员做任何修改，但不脱离如所附权利要求所要保护的范围。
序列表<110>国立清华大学<120>不健康细胞的侦测方法及其应用<130>US 61/193，703<150>US 61/193，703<151>2008-12-17<160>2<170>Patent In Version 3. 3<210>1<211>483<212>Protein<213>Homo sapiens<220><223>GSK3-alpha<300><308>GenBank Accession No. AADl1986<309)1998-02-02<400>1MSGGGPSGGGASVGAMGGGVTTVVATLGQGLQDKRFKNRETVYRVARHFTLVDPDTAVLKIDVffSAGCVLYTEFKFPQIKSFFDELRCLGTTTLTPSSQA<210>2<211>483<212>Protein<213>Homo sapiens<220><223>Glycogen synthase kinase 3 alpha<300><301>Strausberg, R. L. , Feingold, Ε. A. , Grouse, L. H. , Derge, J. G. , Klausner, R. D. ,Collins, F. S. , Wagner, L. , Shenmen, C. Μ. , Schuler, G. D. , Altschul, S. F. , Zeeberg, B. , Buetow, K. H. , Schaefer, C. F. , Bhat, N. K. , Hopkins, R. F. , Jordan, H. , Moore, Τ. , Max, S. I. ,Wang, J. , Hsieh, F. , Diatchenko, L. , Marusina, K. , Farmer, A. A. , Rubin, G. Μ.,
PGGSGRARTS SFAEPGGGGG GASSSGGGPG GSGGGGSGGP PERSQEVAYT DIKVIGNGSF LQIMRKLDHC NIVRLRYFFY KAKLTIPILY VKVYMYQLFR LCDFGSAKQL VRGEPNVSYI AELLLGQPIF P⑶SGVDQLV AHPffTKVFKS RTPPEAIALC TQLPNNRPLP PLFNFSAGEL LTETPTSSDff QSTDATPTLT
GGGGGPGGSASGPGGTGGGK50GAGTSFPPPGVKLGRDSGKV100GVVYQARLAETRELVAIKKV150SSGEKKDELYLNLVLEYVPE200SLAYIHSQGVCHRDIKPQNL250CSRYYRAPELIFGATDYTSS300EIIKVLGTPTREQIREMNPN350SSLLEYTPSSRLSPLEACAH400SIQPSLNAILIPPHLRSPAG450NSS483Hong, L. , Stapleton, Μ. , Soares, Μ. B. , Bonaldo, Μ. F. , Casavant, Τ. L. , Scheet ζ, Τ. Ε., Brownstein, Μ. J. , Usdin, Τ. B. , Toshiyuki, S. , Carninci, P. , Prange, C. , Raha, S. S., Loquellano, N. Α. , Peters, G. J. , Abramson, R. D. , Mullahy, S. J. , Bosak, S. Α. , McEwan, P. J. , McKernan, K. J. , Malek, J. Α. , Gunaratne, P. H. , Richards, S. , Worley, K. C. , Hale, S., Garcia, Α. Μ. , Gay, L. J. , Hulyk, S. W. , Villalon, D. K. , Muzny, D. Μ. , Sodergren, Ε. J. , Lu, Χ. , Gibbs, R. Α. , Fahey, J. , Helton, Ε. , Ketteman, Μ. , Madan, Α. , Rodrigues, S. , Sanche ζ, Α. , Whiting, Μ. , Madan, Α. , Young, Α. C. , Shevchenko, Y. , Bouffard, G. G. , Blakesley, R. W., Touchman, J. W. , Green, Ε. D. , Dickson, Μ. C. , Rodriguez, Α. C. , Grimwood, J. , Schmutz, J., Myers, R. Μ. , Butterfield, Y. S. , Krzywinski,Μ. I. , Skalska, U. , Smailus, D. Ε. , Schnerch, Α. , Schein, J. Ε. , Jones, S. J. and Marra, Μ. Α.<302>Generation and initial analysis of more than 15,OOOfull-Iength human and mouse cDNA sequences<303>Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.<304>99<305>26<306>16899-16903<307>2002-12-24<308>Genbank Accession No. AAH27984<309>2006-07-15<400>1MSGGGPSGGG PGGSGRARTSASVGAMGGGV GASSSGGGPGTTVVATLGQG PERSQEVAYTLQDKRFKNRE LQIMRKLDHCTVYRVARHFT KAKLTIPILYLVDPDTAVLK LCDFGSAKQLIDVffSAGCVL AELLLGQPIFYTEFKFPQIK AHPffTKVFKSSFFDELRCLG TQLPNNRPLPTTTLTPSSQA LTETPTSSDff
SFAEPGGGGGGGGGGPGGSASGPGGTGGGK50GSGGGGSGGPGAGTSFPPPGVKLGRDSGKV100DIKVIGNGSFGVVYQARLAETRELVAIKKV150NIVRLRYFFYSSGEKKDELYLNLVLEYVPE200VKVYMYQLFRSLAYIHSQGVCHRDIKPQNL250VRGEPNVSYICSRYYRAPELIFGATDYTSS300PGDSGVDQLVEIIKVLGTPTREQIREMNPN350RTPPEAIALCSSLLEYTPSSRLSPLEACAH400PLFNFSAGELSIQPSLNAILIPPHLRSPAG450QSTDATPTLTNSS48权利要求
一种侦测受试者具有不健康细胞的方法，该方法包括由所述受试者获得生物样本；及测定在该样本的细胞内的脯氨酸导引蛋白激酶FA/肝醣合成酶激酶3α的表达量；其中，在该细胞内的脯氨酸导引蛋白激酶FA/肝醣合成酶激酶3α的表达程度相较于正常细胞高时，表示不健康细胞的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样本为骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、 腹水、胸膜积水或体液。
3.如权利要求1所述的方法，其中脯氨酸导引蛋白激酶Fa/肝醣合成酶激酶3α的所 述表达由分析脯氨酸导引蛋白激酶Fa/肝醣合成酶激酶3 α蛋白、信使核醣核酸、脱氧核醣 核酸或活性程度进行测定。
4.如权利要求1所述的方法，其中该细胞为干/源祖细胞或选自由骨髓衍生细胞、间质 干/源祖细胞、造血干/源祖细胞、癌症干细胞、纤维球细胞、巨噬细胞、纤维母细胞、肌纤维 母细胞、间质细胞及类似物所组成的群组其中之一的衍生物。
5.一种预测受试者是否为系统性地不健康及处于罹患系统性疾病及症候群的风险中 的方法，该方法包括由所述受试者获得生物样本；及测定所述样本中的脯氨酸导引蛋白激酶Fa/肝醣合成酶激酶3 α的表达；其中脯氨酸导引蛋白激酶Fa/肝醣合成酶激酶3 α的表达量较正常细胞高，表示该受 试者为系统性地不健康及处于罹患系统性疾病及症候群的风险。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述生物样本为骨髓、脐带血、周边血液、组织样本、 腹水、胸膜积水或体液。
7.如权利要求5所述的方法，其中脯氨酸导引蛋白激酶Fa/肝醣合成酶激酶3α的所 述表达由估计脯氨酸导引蛋白激酶Fa/肝醣合成酶激酶3 α蛋白、信使核醣核酸、脱氧核醣 核酸或活性程度进行测定。
8.如权利要求5所述的方法，其中该细胞为干/源祖细胞或选自由骨髓衍生细胞、间质 干/源祖细胞、造血干/源祖细胞、纤维细胞、巨噬细胞、纤维母细胞、肌纤维母细胞及类似 物所组成的群组其中之一的衍生物。
9.一种用于在生物样本中确认并侦测不健康细胞的诊断套组，该诊断套组包括一个或 数个针对脯氨酸导引蛋白激酶Fa/肝醣合成酶激酶3 α的试剂；以及非必须地操作说明。
全文摘要
本发明公开了一种利用细胞内脯氨酸导引蛋白激酶FA/肝醣合成酶激酶3α(PDPK FA/GSK-3α)的表达侦测受试者的不健康细胞存在的方法及其利用。本发明另一方面公开了一种用以预测受试者是否为全身性地不健康以及处于罹患全身性疾病及症候群的风险中的方法。
文档编号G01N33/573GK101899493SQ20091026036
公开日2010年12月1日 申请日期2009年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者杨孝德 申请人:国立清华大学