专利名称：检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在体液(如尿液)中检测前列腺癌细胞的方法。
背景技术：
前人的研究发现微小染色体维持蛋白(MCM)是上皮组织的细胞周期过程中的关 键调节因子(见 W099/21014 和 Gonzalez 等，NatureReviews/Cancer,第 5 卷第 1；35_141 页，2005年二月)。多种保守机制限制DNA在每个细胞周期中只复制一次。MCM及其调节因 子在增殖中的关键作用使得它们成为癌症检测和预后中常规临床应用的潜在的重要生物 标记物。MCM被鉴定为“细胞周期状态”的有用的生物标记物，即，细胞是否能够增殖而不 是静止或衰老的。所有6种MCM(MCM 2-7)的表达见于细胞周期的所有时相，而在退出细胞 周期进入静止期、分化或衰老之后表达量下调。这在正常分层上皮(包括很多组织，包括宫 颈、膀胱、结肠以及其它上皮组织的口咽部)的免疫组化检测中是很明显的。在以上列举的 每一个示例中，MCM限制在基底增殖性隔间而不存在于终末分化的表层角质形成细胞。相 反，在侵袭前上皮病变中，增殖性隔间随着组织学分级增加而逐渐扩大，与此同时，上皮表 面出现MCM阳性细胞(在高度鳞状上皮病变例如宫颈中为90%以上，在同一组织的低度鳞 状上皮内病变中为约40% )。MCM能从静止细胞中区分出周期细胞的能力促进了癌症筛检方法的潜在的临床应 用，所述癌症筛检方法依赖于检测从表面上皮细胞脱落的恶性或恶化前细胞，如使用细胞 检测技术进行宫颈癌筛检或从病人受膀胱移行细胞癌影响的尿液中进行膀胱癌筛检。本发明涉及用于检测前列腺癌的筛选。尽管MCM可以作为检测体液如尿液中的恶 化细胞的靶标，但它们不是组织特异性的。因此，需要在尿液中特异性检测前列腺癌细胞的 方法。本发明基于前列腺上皮细胞可在尿液中检测到，这反过来可用于恶性肿瘤分析。因此根据本发明的第一个方面，提供了一种检测或测定来自受试者的体液样本中 前列腺癌细胞的存在的方法，该方法包括(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；(ii)使所述细胞样本与能够结合前列腺抗原的特异性结合元件接触；和/或(iii)使所述细胞样本与能够结合微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的特异性结合 元件接触；以及(iv)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。一般来说，所述体液不是血液或脑脊液。所述体液可以为尿液或精液。或者所述 体液可以为粪便。优选地，所述体液为尿液。优选地，所述受试者为人类。细胞可以经技术人员所知的任一方法从所述体液样本中分离出来。所述细胞一般 通过所述体液样本离心或过滤分离得到。优选由体液样本过滤而分离得到细胞。在本发明 的优选方法中，对所述样本进行抗原修复(retrieval)。抗原修复在本领域是标准的(见提 供示例性方法的Hiraiwa等关于Shin等(1991) Lab. Invest. 64，693-702)。抗原修复条件 可以包括使所述细胞样本接触pH为7. 8的EDTA缓冲液中，95°C水浴或微波45分钟。
在本发明的一种方法中，所述前列腺抗原可以为前列腺组织的特异抗原。前列腺 抗原可以存在于正常(即非癌的)和前列腺肿瘤细胞中。所述前列腺抗原的例子包括但 不限于前列腺酸性磷酸酶(PSAP)、前列腺特异抗原(PSA)、前列腺特异G蛋白偶联受体 (PSGR)和α -甲酰辅酶A消旋酶(AMACR)。优选地，该前列腺抗原为PSAP或PSGR。在本发 明的一种实施方式中，所述前列腺抗原为PSA。在本发明的一种方法中，所述MCM选自MCM 2、3、4、5、6和7。所述MCM可以为2个 或更多不同MCM的组合，例如，选自MCM 2、3、4、5、6和7的2个不同的MCM。例如，所述MCM 可以包括MCM2和选自MCM 3、4、5、6和7的一个其它的MCM。在另一个例子中，所述MCM可 以包括MCM5和选自MCM 2、3、4、6和7中的一个其它的MCM。在本发明的一种优选方法中， 所述MCM选自MCM 2、3、5和7。在本发明的另一种优选方法中，所述MCM选自MCM 2、5和 7。在本发明的一种方法中，所述MCM可以包括MCM 2和MCM 5。在本发明的另一种 方法中，所述MCM可以包括MCM 2和MCM 7。在本发明的又一种方法中，所述MCM可以包括 MCM 5 禾口 MCM 7。此处所述的“特异性结合元件”为彼此具有结合特异性的分子对中的元件。特异 性结合对的元件可以为自然来源或者完全或部分合成产生。所述分子对的一个元件在其表 面有一个可以为突出或凹洞的区域，这个区域与分子对的另一元件的特别的空间和极性组 织特异性结合并因此互补。因此，所述分子对的元件具有彼此特异性结合的特性。特异性结合对的类型的例子为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受 体、受体-配体、酶-底物、DNA-DNA(如寡核苷酸)。本发明主要关注抗原-抗体类型的反 应，尽管它也关注与此处定义的抗原结合的小分子。本文使用的术语“抗体”为免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分， 即，包含特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，不论是天然的或者部分或全部合成产生 的。术语也包括具有为抗体结合结构域的结合结构域的任意多肽或蛋白，或者具有与抗体 结合结构域同源的结合结构域的任意多肽或蛋白。这些可以来源于天然来源，或者它们可 以由部分或全部合成产生。抗体的例子为免疫球蛋白同型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA) 及其同型亚类；包含抗原结合结构域的片段，如Fab、scFv、Fv、dAb、Fb ；以及双抗体。抗体 可以为多克隆的或单克隆的。由于抗体可以以多种方式进行修饰，所以术语“抗体”应解释为覆盖具有结合结构 域的任一特异性结合元件或物质，所述结合结构域具有所需特异性。因此，这个术语包括抗 体片段、衍生物、抗体的功能等同物和类似物、人源化抗体，其包括包含免疫球蛋白结合结 构域的任一多肽，不论是天然的或者全部或部分合成的。对于目标靶标特异的抗体，例如MCM或PSA、PSAP、PSGR或AMACR，可以采用本领域 的标准技术获得。制备抗体的方法包括用蛋白或蛋白的片段或表达所述蛋白或片段的细胞 或病毒免疫哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔子)。抗体可以使用本领域已知的众多技术中的任 一种从被免疫的动物处获得，并进行筛选，例如使用抗体与目标抗原的结合。“抗原结合结构域”是抗体的某一部分，这一部分包含与抗原的部分或全部特异性 结合并互补的区域。如果抗原很大，抗体可以只与抗原的一个特别的部分结合，这部分称为 表位。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗原结合结构域可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区。“特异”一般用于指特异性结合对的一员不表现与其特异性结合伙伴之外的分子 的任何显著结合的情形，例如，与任一其它分子的交叉反应性少于约30%，优选20%、10% 或1%。按照本发明，本发明的所述特异性结合元件优先为“分离”的形式。元件一般游离 于或基本上游离于它们天然联系的物质，例如当它们见于其自然环境或它们所制备的环境 (如细胞培养)中(当该制备由体外或体内重组DNA技术进行时)时和它们在一起的其它多肽。因此本发明所述特异性结合元件优选抗体或其片段。因此，例如，在(ii)中，所述 特异性结合伙伴元件可以为具有对前列腺组织特异的抗原结合结构域的抗体或其片段。例 如，在(iii)中，所述特异性结合元件可以为具有对MCM特异的抗原结合结构域的抗体或其 片段。所述抗体可以为多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体或前述任一抗体的片段。优 选的特异性结合元件为单克隆抗体。例如，在(ii)中，特异性结合元件可以为具有对前列 腺组织特异的抗原结合结构域的单克隆抗体。对PSA(Dako)、PSAP(Sigma)、PSGR(Abcam) 和AMACR(Dako)特异的单克隆抗体为本领域所已知，其详细信息包含在附件1中。例如，在 (iii)中，特异性结合元件可以为具有对MCM特异的抗原结合结构域的单克隆抗体。对MCM 特异的单克隆抗体为本领域所已知，例如，在本研究中所使用的抗-MCM2的抗体由Cancer Cell Unit, Hutchison/MRCResearch Centre, Hills Road, Cambridge CB2OXZ 友情提供。使用杂交瘤细胞生产单克隆抗体为本领域所公知。用于产生单克隆抗体的方法 由 Kohler 和 Miltein 在 Narure 256,495-497 (1975)以及 Donillard 和 Hoffman，"Basic Facts about Hybridomas，，in Compendium of ImmunologyV.il ed. by Schwartz, 1981 上 公开，这些都被引入本文作为参考。在本发明的一种方法中，本发明所述特异性结合元件可以为可检测标签例如，放 射性标记如1或99Tc所标记，放射性标记可以以抗体成像领域所已知的常规化学方法附加 到特异性结合元件上。标签也包括酶标记，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。标签也包括 化学部分，如生物素，其可以通过与特异的同源可检测部分(如标记的抗生物素蛋白)结合 检测。特异性结合元件如抗体在正常和测试样本中的反应性可以通过任一合适的方法 测定。其它标签包括具有可光谱分离的吸收或发射特性的荧光素、磷光剂或激光染料。合 适的荧光素包括荧光黄、罗丹宁、藻红素和德克萨斯红。合适的显色染料包括二氨基联苯 胺。其它的标签包括大分子胶体粒子或颗粒物，如有色的、磁性或顺磁的乳胶微球和可直接 或间接产生可视觉观察、电子检测或以其它方式记录的可检测信号的生物或化学活性的试 剂。上述分子可以为酶，所述酶催化可产生或改变颜色的或导致例如电性能的变化的反应。 它们可以为可分子激发的，从而能量状态间的电子转移导致特有的光谱吸收或激发。它们 可以包括与生物传感器相连使用的化学实体。在下文所描述的实施例中，使用了碱性磷酸 酶或辣根过氧化物酶。在本发明的一个优选方面，所述方法包括以下步骤(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；
(ii)使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触；和(iii)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。在本发明的另一方面上，所述方法包括以下步骤(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；(ii)使所述细胞样本与一种或多种MCM的特异性结合元件接触；和(iii)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。在本发明的另一个优选方面，所述方法包括以下步骤(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；(ii)使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触；和(iii)使所述细胞样本与微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的一种或多种特异性结 合元件接触；和(iv)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触的步骤可以与使所述细胞 样本与微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的一种或多种特异性结合元件接触的步骤分别、顺 序或同时进行。在本发明的一种实施方式中，使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合 元件接触的步骤与使所述细胞样本与微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的一种或多种特异 性结合元件接触的步骤同时进行。使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触的步骤与使所述细胞样本 与微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的一种或多种特异性结合元件接触的步骤优选分别和 顺序进行。因此在本发明的一个优选方面，提供了一种用于检测或测定来自受试者的体液 样本中前列腺癌细胞的存在的方法，其包括(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；(ii)使所述细胞样本与能够结合前列腺抗原的特异性结合元件接触；接下来，(iii)使所述细胞样本与能够结合微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的特异性结合 元件接触；和(iv)测定所述的特异性结合元件与所述细胞样本的结合。在本发明的另一个方面，提供了组合物，其包含前列腺抗原(例如PSA和/或 PSAP)的特异性结合元件和微小染色体维持蛋白(MCM)多肽(如MCM2和/或MCM5和/或 7)的一种或多种特异性结合元件。在本发明的另一方面，提供了在根据本发明的方法中使用的试剂盒，所述试剂盒 包含根据本发明的组合物。可以含有一种或多种其它试剂，如本文所描述的标签分子。其它 试剂可以包括以下组分的任意组合或全部减少非特异染色的封闭试剂、在储存中维持特 异性结合元件活性的储存缓冲液、要使用的染色缓冲液和/或洗脱液(如在抗体染色时)、 正对照、负对照等等。正对照和负对照可以用于验证根据本发明使用的和试剂盒可以提供 的试剂的活性和正确使用。对照的设计和使用是标准的并且在本领域普通技术人员的常规 能力以内。所述试剂盒还可以含有实施本发明方法的说明书。在本发明的另一方面，提供了用于治疗受试者的前列腺癌的方法，所述方法包 括(i)根据本发明的第一方面的方法，检测或测定来自所述受试者的体液样本如尿液中前列腺癌细胞的存在；(ii)当所述样本中检测到前列腺癌细胞时，向所述受试者给予前列腺癌的治疗。本发明另一方面提供了一种将前列腺组织分类为(i)正常或(ii)潜在或实际上 为癌症前期或患癌的、发育异常的或患肿瘤的方法，该方法包括测定体液样本与能够结合 前列腺抗原的特异性结合元件和/或能够结合微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的特异性结 合元件的结合。结合的形式和程度可以与已知正常样本和/或已知异常样本的结合的形式 和程度相比较。在本说明书的整个描述和权利要求中，词语“包含”(comprise)和“含 有”(contain)以及这些词的衍生词，如“包括(comprising) ”和“包括(comprises) ”，意为 “包括但不限于”，目的不是为了排除其它的部分、添加物、成分、整数或步骤。在本说明书的整个描述和权利要求中，单数包含复数，除非文本另有要求。尤其 是，本说明书在使用不定冠词的地方理解为涵盖复数和单数，除非文本另有要求。与本发明的一个具体方面、实施方式或实施例一起描述的特征(features)、整数 (integers)、特点(characteristics)、化合物、化学部分或基团理解为适用于本文描述的 任一其它方面、实施方式或实施例，除非与其不相容。以下，参考下列附图以实施例的方式来描述本发明
图1 用MCM-2和PSA抗体标记的前列腺癌细胞(细胞系C4_2b)的照片；a)前列 腺癌细胞显示出MCM-2的暗的核的染色和PSA的红色的胞质染色；和b)高分辨率的前列腺 细胞显示出非常暗的MCM2的核染色，胞质中的红色指示PSA的存在；图2 用MCM-2和PSA的抗体标记的膀胱癌细胞(细胞系EJ28)的照片；a)膀胱癌 细胞显示出MCM的靶标核染色，没有检测到PSA ；b)高放大倍数下，膀胱癌细胞显示出靶标 核染色细胞，没有检测到PSA;图3 高放大倍数的照片。a)用MCM-2和PSA的抗体标记的前列腺癌细胞(细胞 系C4-2b)_显示出指示MCM阳性的深染色的核和指示PSA的染色为红色的周围胞质物质； b)用MCM-2和PSA的抗体标记的膀胱癌细胞(细胞系EJ-28)-显示出指示MCM的深染色的 核，但没有任何胞质染色，指示不存在PSA。
实施例材料
抗原 _gjt_目录号供应商
MCM26A8 MCA3251ZAbD Serotec
MCM2D1.9H5 MCAl 859AbD SerotecCN 102089657 A说明书6/14 页MCM24B8M069-3 MBL InternationalMCM2SPMl 96 Mal-38102Fisher ScientificPSA表位3PS2abl0189AbeamPSA表位18A6abl0187AbeamPSA表位45G6abl0186AbeamPSARb polyclonalab9537AbeamPSAPRb polyclonalGTX72749GeneTexPSGRRb PolyclonalGTX71863GeneTex抗原 克隆供应商产品编号
MCM3JCC07 Leica Microsysterms (Novacastra) Protein 3NCL-MCM3
MCM5CRCT5.1 Leica Microsysterms (Novacastra) Protein 5NCL-MCM5
MGM7DCS-141.1 Leica Microsysterms (Novacastra) Protein 7NCL-MCM7实施例1MM j患有前歹！丨腺癌的病人的尿液讲行MCM检测丨随后将收集自患有前列腺癌的病人的尿液转移至实验室，用常规的方法进行液基 细胞学片子的制备。尤其是，将全部体积的尿液样本分装至falcon管中用于离心及后续的 标准步骤，制备了包含前列腺特异上皮细胞的细胞沉淀的制备物。用于常规评估的比较PAP 染色的片子咨询了负责细胞病理学实验室的顾问，同时用于免疫细胞化学染色的片子存放 于4°C以待成批染色及其后处理。在下文描述与细胞免疫病理学实验室染色相关的文档。 尤其是，在95°C水浴45分钟的条件下使用抗原修复和pH为7. 8的EDTA是细胞学片子预染 色方案的一个重要部分。材料与方法针对前列腺MCM的双染饩方案本方案使用DAKO EnVisionTM G/2双染色系统(K5361)，目的是使用小鼠和兔子 的一抗进行免疫组化检测在经福尔马林固定、石蜡包埋的组织中或固定的细胞涂片中的抗 原。设计观察系统以在一个样品中同时检测两种不同的抗原。该系统可以在人工操作或使 用Dako自动染色仪器时使用。所述程序为顺序双染色，使用HRP/DAB+观察第一个抗原，使用AP/永久红观察第 二个抗原。双内源酶封闭抑制某些组织中存在的内源的碱性磷酸酶、过氧化物酶和假过氧 化物酶的活性。对内源的酶进行封闭之后的第一个步骤是将样品与最佳稀释的小鼠或兔子 的一抗孵育，之后与聚合物/HRP试剂孵育。该试剂是HRP偶联的、也携带抗小鼠和兔子免 疫球蛋白的抗体的葡聚糖聚合物。所述反应通过DAB+发色体观察。封闭步骤之后，使用双 染封闭试剂，样品与第二个最佳稀释的小鼠或兔子的一抗孵育。下一步，加入兔子/小鼠 (LINK)；携带抗小鼠和兔子的免疫球蛋白的抗体的葡聚糖聚合物，之后与聚合物/AP试剂 孵育。通过永久红发色体观察第二个反应。所述试剂盒提供除一抗外的所有指定试剂。自动染色机染色方案的第一种抗体(MCM-幻为1 40的稀释倍数由Cancer CellUnit，MRC，Cambridge提供。自动染色机染色方案的第二种抗体(MCM-2)为1 40的稀释
倍数由 Cancer Cell Unit，MRC，Cambridge 提供。
权利要求
1.一种检测或测定来自受试者的体液样本中存在前列腺癌细胞的方法，所述方法包括(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；( )使所述细胞样本与能够结合前列腺抗原的特异性结合元件接触；和/或(iii)使所述细胞样本与能够结合微小染色体维持(MCM)多肽的特异性结合元件接 触；和(iv)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述体液为尿液或精液。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述体液为尿液。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，通过过滤所述体液样本从体液样本中分 离出所述细胞。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，使在(i)中分离的所述细胞样本进行抗原修复。
6.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述前列腺抗原为前列腺组织特异性抗原。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述前列腺抗原在正常的前列腺细胞中表达。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述前列腺抗原在前列腺肿瘤细胞中表达。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述前列腺抗原选自前列腺酸性磷酸酶 (PSAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性G蛋白偶联受体(PSGR)和α -甲酰-辅酶 A消旋酶(AMACR)。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述前列腺抗原为PSAP或PSA。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述前列腺抗原为PSA。
12.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述MCM选自MCM2、3、4、5、6和7。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述MCM为MCM2和/或MCM5。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述MCM包含两种或多种不同的MCM。
15.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述特异性结合元件为抗体或其片段。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体。
17.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，用可检测的标签标记所述特异性结合元件。
18.如权利要求1-11或15-17中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤 (i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；( )使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触；和 (iii)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。
19.如权利要求1-5或12-17中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤 (i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；( )使所述细胞样本与一种或多种MCM的特异性结合元件接触；和 (iii)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。
20.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；( )使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触；和(iii)使所述细胞样本与微小染色体维持(MCM)多肽的一种或多种特异性结合元件接 触；和(iv)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。
21.如权利要求21所述的方法，其中，使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元 件接触的步骤可以与使所述细胞样本与MCM多肽的一种或多种特异性结合元件接触的步 骤分别、顺序或同时进行。
22.如权利要求21所述的方法，其中，使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元 件接触的步骤与使所述细胞样本与MCM多肽的一种或多种特异性结合元件接触的步骤同 时进行。
23.一种组合物，其包含前列腺抗原的特异性结合元件和MCM多肽的一种或多种特异 性结合元件。
24.一种用于检测和测定来自受试者的体液样本中存在前列腺癌细胞的试剂盒，所述 试剂盒包含如权利要求23所述的组合物。
25.如权利要求M所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含一个或多个可检测的标签。
26.一种用于治疗受试者的前列腺癌的方法，所述方法包括(i)根据如前述任一项权利要求所述的方法，检测或测定来自所述受试者的体液样本 中前列腺癌细胞的存在，所述体液样本例如尿液；( )当所述样本中检测到前列腺癌细胞时，向所述受试者给予前列腺癌的治疗。
27.一种将前列腺组织分类为(i)正常或(ii)潜在或实际上为癌症前期或患癌症的、 发育异常的或患肿瘤的方法，所述方法包括测定体液样本与能够结合前列腺抗原的特异性 结合元件和/或能够结合微小染色体维持(MCM)多肽的特异性结合元件的结合。
全文摘要
本发明涉及一种检测或测定来自受试者的体液样本中前列腺癌细胞的存在的方法，该方法包括(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；(ii)使所述细胞样本与能够结合前列腺抗原的特异性结合元件接触；和/或(iii)使所述细胞样本与能够结合微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的特异性结合元件接触；和(iv)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。
文档编号G01N33/50GK102089657SQ200980124210
公开日2011年6月8日 申请日期2009年6月18日 优先权日2008年6月24日
发明者D·B·盖勒维 申请人:赛托系统有限公司