专利名称：对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性的评价方法
技术领域：
本发明涉及对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性的评价方法。
背景技术：
晒伤是照射的紫外线超出黑色素的保护能力时所产生的。晒伤现象有两种刚受过紫外线照射后不发病，而在2 6小时后皮肤变红，疼痛在6 48小时后变得最厉害的晒斑(红斑sunburn)；以及在M 72小时期间色素进行了沉积的晒黑(suntan)。晒斑是指UVB透过表皮到达至真皮乳头体，其结果乳头体内的毛细血管作为炎症反应产生了充血，从而使皮肤的颜色变红的状态(红斑)。当紫外线量超过黑色素的防御反应时，细胞组织受到损伤，引起发热、水泡、疼痛。这称为日光皮肤炎。另外，晒黑是UVA影响到了黑素细胞，而促进黑色素的生成。UVA不会伴随发红及炎症，但会使皮肤的新陈代谢变慢，因此产生斑痕。担心形成这些晒伤原因的紫外线会对皮肤有生癌作用、并产生对白内障等眼疾患的影响以及对免疫功能的影响等多种对健康的影响。当皮肤暴露于紫外线时，引起各种紫外线损害。紫外线使皮肤产生炎症、或将皮肤的不饱和脂质氧化而产生脂质自由基，生成过氧化脂质。像这样由紫外线导致的炎症或氧化会引起组织、细胞、DNA的损害。作为因皮肤暴露在紫外线中所引起的现象，一般可以列举皱纹、斑痕及皮肤癌等。近年来，作为流行病学的数据，报道了由于对紫外线的敏感性的不同(肤色、皮肤类型等)，皮肤癌的风险会提高(非专利文献1、2、；3)。进而，确定了对于作为皮肤癌一种的恶性黑素瘤(melanoma)的危险风险度，由于黑皮质素1受体(melanocortinl receptor) 的1碱基取代的基因变异导致其风险变高数倍(非专利文献4、幻。对于紫外线的敏感性根据皮肤类型(根据晒伤时的晒斑、晒黑的状态的不同而分类)会有很大的差异，可以分为六等级的类型，或者以产生红色(红斑)的最小紫外线能量(最小红斑量MED)为基准进行分类，前者为主观的观测，后者伴随不照射紫外线就不能测定的风险。由于臭氧层破坏等， 导致形成与以前相比更为严重的紫外线增加的问题，需要对个人适当地进行对紫外线的敏感性风险评价。另一方面，通常在形成称为斑痕的色素沉积的初期阶段，通过在皮肤表面表现之前进行各种刺激，表皮角化细胞生成α _MSH、bFGF、CGRP、内皮素等信息传递物质，并传递至黑素细胞。传递至黑素细胞后，细胞内产生大量的黑色素。进而因紫外线导致代谢回转异常而大量产生的黑色素无法排出，因而向色素性病变转化。报道了即使在使用了生物体外 (in vitro)系的实验中，在对黑素细胞照射UV时，作为细胞的增殖因子标记的p73、Nup88、 p27、Idl、PCNA，还有作为细胞凋亡相关蛋白质的bCl-2的表达也产生了增减(非专利文献 5)。目前，报道了利用活组织检查，使用皮肤组织有侵袭地对斑痕部和正常部进行比较，结果在斑痕部，NT-3、ADAM9、HB-EGF这样的蛋白质的表达显著增加(专利文献1)。此外， 报道了作为预测皮肤的斑痕形成的检查方法，利用活组织检查测定MLSTD1、MOGATU Mcp9、Krt2-6b等的mRNA量，来判断斑痕形成的风险(专利文献2、3、4)。另外，专利文献5中公开了一种方法，其作为非侵袭方法，将源于通过胶带剥离(tape stripping)或擦过而采集的皮肤的角质层作为试样，分析白介素I(IL-I)和白介素1受体拮抗剂(IL-Ira)的存在量， 并进行肌质的评价。专利文献1 日本国特开2004-205246号公报专利文献2 日本国特开2005-106745号公报 专利文献3 日本国特开2005-110505号公报 专利文献4日本国特开2007-289063号公报 专利文献5 日本国专利第3590708号公报 非专利文献 1 :Arch Dermatol. 2004 ； 140 :819-824 非专利文献 2 =Cancer Causes Control. 1997 ；8 (2) :246-252 非专利文献 3 =Ann Epidemiol. 2008 ； 18 (8) :614-627 非专利文献 4 Jnvest Dermatol. 117 :294-300,2001 非专利文献 5 :Am. J. Hum. Genet. 66 :176-186，2000 非专利文献 6 Carcinogenesis 24(12) :1929-1934,200
发明内容
本发明的目的在于使用利用非侵袭的手段采集的皮肤角质层来提供对皮肤晒斑的抗性的指标。此外，本发明中所说的对皮肤晒斑的抗性是指因暴露在紫外线中导致的照射后M小时以内发生的炎症可以提前恢复，并且发红的程度减少。(1)对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的选自由博来霉素水解酶、组织蛋白酶D及精氨酸酶I(Arginase-I)构成的组中的一种或两种以上的蛋白质的表达量作为指标。(2) 一种方法，其特征在于，根据(1)所述的评价方法来选择防止皮肤晒斑的化妆品。 本发明明确了 在使用非侵袭的手法得到的皮肤角质层中，膜联蛋白iKArmexin II)、博来霉素水解酶、组织蛋白酶D、精氨酸酶1及扁平上皮癌相关抗原(squamous cell carcinoma-related antigen2) (SCCA2)的存在量可以成为对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性的指标。按照本发明，可以在不实际照射紫外线的情况下，评价对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性。本发明可以使用利用非侵袭的胶带剥离手段采集的皮肤角质层来进行评价，因此安全且简便。另外，利用本发明的评价方法，可以筛选对提高对由紫外线导致的皮肤晒斑的抵抗有用的成分。按照本发明，可以评价由紫外线导致的炎症(红斑)的恢复力。如果由紫外线导致的炎症的恢复力低，则可以推测因紫外线暴露导致的皮肤老化、皱纹、斑痕、进而皮肤癌的风险高，因此对于对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性弱的人，可以恰当地进行预先推荐使用强力的防晒剂(sunscreen)等美容咨询。
图1是表示紫外线照射后a *值的变化量的图。图2是对被验者的皮肤角质层中精氨酸酶1的存在量的平均值进行比较的图。图3是对被验者的皮肤角质层中膜联蛋白II的存在量的平均值进行比较的图。图4是对被验者的皮肤角质层中博来霉素水解酶的存在量的平均值进行比较的图。图5是对被验者的皮肤角质层中组织蛋白酶D的存在量的平均值进行比较的图。图6是对被验者的皮肤角质层中SCCA2的存在量的平均值进行比较的图。
具体实施例方式下面，对本发明的实施方式更详细地进行说明。本发明基于对在利用非侵袭的手法采集的皮肤角质层中存在的五种蛋白质进行计量而得到的存在量，可以获知该被验者对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性。本发明人等发现在暴露于紫外线后的恢复程度与所述五种蛋白质的存在量有相关性，从而完成了本发明。所述五种蛋白质是膜联蛋白II、博来霉素水解酶、组织蛋白酶D、精氨酸酶1及SCCA2。 对于膜联蛋白II、博来霉素水解酶、组织蛋白酶D这些蛋白质的表达量少的人具有对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性强的倾向。对于精氨酸酶1、SCCA2这些蛋白质的表达量多的人具有对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性强的倾向。因此，对于这五种蛋白质，预先将它们的表达量设定为几个等级，从而可以将对由紫外线导致的皮肤晒斑的抵抗程度进行指标化。通过测定从被验者采集的皮肤角质层中的表达量，并与所述指标进行比较，可以容易地获知该被验者的皮肤晒斑抗性。基于该结果，可以对需要注意晒伤的人进行指导，使他们在户外活动时小心。或者，当判明对于紫外线弱时，可以针对个人采取选择紫外线遮蔽效果强的化妆品等对策。或者，可以在具有科学根据的前提下进行化妆品选择的咨询。另外，利用因紫外线容易产生晒斑的培养皮肤模型，通过探索对这五种蛋白质的表达量有影响的被测物质，可以筛选能够改善对由紫外线导致的晒斑的抗性的药剂。本申请发明因通过胶带剥离等非侵袭方法安全且容易地采集皮肤角质层，使用该皮肤角质层在短时间特定目标蛋白质的表达量，所以，可在化妆品柜台等简单地进行测定， 可以当场作为化妆品选择的信息而有效利用。测定该蛋白质的表达量的机器可以将检测出的结果与所述等级化的指标进行比较并进行提示。进而，基于该结果，还可以显示合适的化妆品。此外，本发明作为医疗目的以外的目的，可以评价皮肤老化等老化风险，基于此， 作为医疗以外的目的，可以采取处理措施。精氨酸酶1是分子质量为34，735Da的细胞内蛋白质，其是将精氨酸转化为鸟氨酸和尿素的酶。哺乳类精氨酸酶至少存在两种亚型(I型和II型)，它们在组织分布、细胞内局部存在性、免疫学交差反应性及生理学功能上都不同。该基因指令的亚型I型为胞浆酶，作为尿素循环的构成因子在肝脏中优先表达。该酶的遗传性缺损会导致作为以高血氨症为特征的常染色体隐性遗传疾病的精氨酸血症。基因碱基序列信息(ARG1，Nucleic16 :8789-8802(1988), X12662) 氨基酸序列信息(Arginase-1，Cell Death Differ. 2000 Feb ；7 (2) : 137-44，P05089)。 膜联蛋白II是分子质量为38，473Da的细胞内蛋白质，其是由钙控制的膜结合蛋白质，在该蛋白质上结合二个钙离子。在两组膜联蛋白重复序列中，一组结合钙，一组结合磷脂。该蛋白质与结合于细胞膜上磷脂的肌动蛋白及细胞骨架类的蛋白质交联，或者通过 t-PA (组织型纤溶酶原激活物，tissue plasminogen activator)将纤溶酶原活化。基因碱基序列信息(Annexin A2，Gene 95 :243-251 (1990)，BC015834)。氨基酸序列信息(Annexin A2, J. Biol. Chem. 266 :5169-5176(1991)，P07355)。 博来霉素水解酶是分子质量为52，562Da的细胞内蛋白质，其是木瓜蛋白酶家族的中性半胱氨酸蛋白酶的一种。唯一知道的活性是使糖肽的博来霉素(BLM)(癌的复合化学疗法的重要要素)的代谢不活性化。基因碱基序列信息(BLMH，1230091253543_0， X92106)。氨基酸序列信息(bleomycin hydrolase, Biochemistry 35:6706—6714(1996)， Q13867)。组织蛋白酶D是分子质量为44，542Da的溶酶体性天冬氨酸蛋白酶，其可促进细胞内蛋白质的分解。其与炎症、动脉粥样硬化症、血栓症及阿尔茨海默病等的发病有关，还认为其与细胞凋亡、乳癌等肿瘤细胞的增殖有关。基因碱基序列信息(CTSD， 1230091253543_1，M63138)。氨基酸序列信息(Cath印sin D, Nat. Biotechnol. 21 660-666(2003)，P07339)。jffi^Fii^lgffi^ijlJ^ (squamous cell carcinoma-related antigen2 (SCCA2)) ^ 分子质量为44，8MDa的细胞内蛋白质，其是在羧基末端侧具有丝酶抑制蛋白结构的丝氨酸蛋白酶抑制剂。在正常扁平上皮中有少许表达，但在扁平上皮癌中发现有高表达。另外， SCCA2除了较强地抑制组织蛋白酶G、糜酶的丝氨酸蛋白酶以外，还抑制半胱氨酸蛋白酶、 木瓜蛋白酶及组织蛋白酶L。基因碱基序列信息(SERPINB4，1230091253M3_2，X89015)。 氨基酸序列信息(Serpin B4, Int. J. Cancer 89 :368-377(2000)，P07355)。所述的精氨酸酶1、膜联蛋白II、博来霉素水解酶、组织蛋白酶D及SCCA2可以是前体蛋白质，也可以是成熟蛋白质，另外可以是截短型，也可以是非截短型。作为前体蛋白质可以列举蛋白质原、前蛋白质原等。有的蛋白质原、前蛋白质原等具有信号肽。从皮肤角质层采集角质层蛋白质的方法(1)通过胶带剥离法的角质层的采集胶带剥离法是指通过在皮肤上粘贴粘附胶带并揭下粘附胶带，从而采集粘附面上粘附的角质层的方法。使用市售的粘附胶带，例如可通过在人脸颊部按压粘附胶带，使角质层粘附在粘附胶带上来采集。作为市售的粘附胶带，可例举ASAHIBI0MED公司制角质检测仪、M0RITEX 公司制角质层seal、PR0M0T00L公司制角质检测仪(盘式W、盘式G、PRO式)、Integral公司制Corneofix、3M公司制透明胶带、3M公司制透明双面胶带等。(2)提取缓冲液为了从粘附在粘附胶带上的角质层中提取角质层蛋白质，使用提取缓冲液。作为提取缓冲液，例如可例举如下组成。组成PBS(-)、0. 1% SDS0用粘附胶带采集的皮肤的角质层是角化细胞分化的角质层，富含细胞骨架系的蛋白质。因此，为提高角质层蛋白质的提取效率，优选在该提取缓冲液中含有适当的表面活性剂。作为表面活性剂，优选使用SDS (月桂基硫酸钠、CH3 (CH2) n0S03Na)。(3)角质层蛋白质的提取通过将采集了角质层的粘附胶带放入圆筒容器，使用高速旋转的均质器用研杵 (Pestle)(以下称为“研杵”)摩擦粘附面，可迅速进行角质层蛋白质的提取。将粘附胶带的粘附面朝向圆筒容器内侧，将粘附面的相反面沿圆筒容器的内侧放入圆筒容器。通过将粘附胶带的粘附面的相反面沿圆筒容器的内侧放入，可容易地用研杵摩擦粘附面。作为另外的方法，也可以将采集有角质层的胶带浸入提取缓冲液中，用刮刀摩擦，从而提取角质层蛋白质，还可以使用振荡法或超声波法。(4)角质层蛋白质提取液的回收将角质层蛋白质提取液静置约1分钟，使泡沉静后，优选从圆筒容器中吸引角质层蛋白质提取液进行回收。(5)角质层蛋白质中精氨酸酶1、膜联蛋白II、博来霉素水解酶、组织蛋白酶D及 SCCA2的存在量的分析所得到的角质层蛋白质提取液中的精氨酸酶1、膜联蛋白II、博来霉素水解酶、组织蛋白酶D及SCCA2的存在量，可以利用免疫印迹法、ELISA法、抗体芯片法、FRET法来进行定量分析。对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性的评价明确了 照射IMED的紫外线1周后皮肤红斑消失的组的膜联蛋白II、博来霉素水解酶及组织蛋白酶D的存在量，比皮肤晒斑没有消失的组的存在量少。另夕卜，明确了 照射IMED的紫外线1周后皮肤晒斑消失的组的精氨酸酶1、SCCA2 的存在量，比皮肤晒斑没有消失的组的存在量多。因此，当皮肤角质层中的膜联蛋白II、博来霉素水解酶及组织蛋白酶D的存在量比平均值少时，或者精氨酸酶1、SCCA2的存在量比平均值多时，可以评价为对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性强。相反，对于皮肤角质层中的膜联蛋白II、博来霉素水解酶及组织蛋白酶D的存在量比平均值多的人、或者精氨酸酶1、SCCA2的存在量比平均值少的人，可以评价为因暴露于紫外线下，皮肤老化、斑痕及皱纹容易加重，并且易于产生斑痕等紫外线损害。由紫外线导致的皮肤晒斑的消失促进剂的筛选通过对使小鼠等的皮肤角质层中的膜联蛋白II、博来霉素水解酶及组织蛋白酶D 的存在量减少、或者使精氨酸酶1、SCCA2的存在量增大的成分进行研究，可以筛选由紫外线导致的皮肤晒斑的消失促进剂。实施例1.被验者将10名年龄为20多岁和30多岁的男性作为被验者。各被验者的年龄、皮肤类型、 最小红斑量、紫外线照射前的a *值示于表1。另外，皮肤类型II是“容易产生晒斑，略微产生晒黑”的类型，皮肤类型III是“正常产生晒斑，正常产生晒黑(淡茶色的晒伤)，，的类型，皮肤类型IV是“略微产生晒斑，总是产生晒黑(茶色的晒伤)”的类型。表1所示的皮肤类型是被验者自己申告的。因此，此次客观测定的最小红斑量与皮肤类型未必相对应。
此外，将a *值作为伴随由紫外线导致的炎症而产生的发红等级的指标进行了测定。
权利要求
1.对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性的评价方法，其特征在于，将皮肤角质层中的选自由博来霉素水解酶、组织蛋白酶D及精氨酸酶1构成的组中的一种或两种以上的蛋白质的表达量作为指标。
2.一种方法，其特征在于，根据权利要求1所述的评价方法来选择防止皮肤晒斑的化妆品。
全文摘要
本发明是对由紫外线导致的皮肤晒斑的抗性的评价方法，将使用非侵袭的手段采集的皮肤角质层中的选自由膜联蛋白II、博来霉素水解酶、组织蛋白酶D、精氨酸酶1及SCCA2构成的组中的一种或两种以上的蛋白质的表达量作为指标。
文档编号G01N33/15GK102203620SQ200980143819
公开日2011年9月28日 申请日期2009年12月18日 优先权日2008年12月24日
发明者安田知永, 速水耕介 申请人:株式会社芳珂