专利名称：一种以多捕获特性为特征的半定量胶体金属检测技术及其制备方法和用途的制作方法
一种以多捕获特性为特征的半定量胶体金属检测技术及其
制备方法和用途[技术领域]一种免疫胶体金属检测技术，特别是一种可直接进行半定量分析的 胶体金属检测技术及其制备方法和用途。 胶体金属标记技术是以胶体金属作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应 的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用 不同颗粒大小的胶体金属还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此已成为继荧 光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。现已广泛应用于电镜、流式细 胞仪、免疫印迹、体外诊断试剂、食品药品质量检测试剂的制造等领域。胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成 为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金在弱碱环境下带 负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不 影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，胶体金颗粒还可以与其他多种生 物大分子物质(如毒素、抗生素、激素、核酸、多肽等)结合。根据胶体金的一些物理性状， 如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体 金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。免疫胶体金属检测技术大体上可分为以液相反应为主的检测技术和以固相载体 反应为主的检测技术，其中以液相反应为主的检测技术，如流式细胞检测技术和用于光镜、 电镜水平定位、定性或定量研究特定抗原物质的组织、细胞或亚细胞结构的分布特性的液 相免疫组化测定技术，以固相载体反应为主的检测技术，如广泛使用的胶体金属免疫层析 法等。与其他检测方法比较，具有以下一些优点1)快捷迅速不论是免疫层析法还是斑点 免疫渗滤法都具有快速的特点，一般在几分钟之内就可得出结果，这是目前其它快速检测 方法所无法达到的。2)灵敏度高免疫胶体金属检测方法并不因为其快速而牺牲了它的检 测灵敏度，最低检出量可达到0. lng/ml以下，如心肌肌钙蛋白T快速检测试剂。3)安全简 便，由于胶体金属本身具有颜色，定性检测不需任何仪器和设备，肉眼即可判断结果。4)生 产成本低廉。然而，目前被广泛使用的以固相载体反应为主的检测技术如不配备相应的检测仪 器，仅依靠肉眼判断结果，还仍局限在定性水平，只能在某一检测水平上判断有还是无，如 用于早孕检测的早早孕胶体金法检测试纸的尿液人绒毛膜促性腺激素最低检出量为25U/ L，而正常尿液人绒毛膜促性腺激素的浓度1U/L以下，用于急性心肌梗死早期诊断的血液 心肌肌钙蛋白I胶体金检测试剂的最低检出量为1. 5ng/ml，而正常血液心肌肌钙蛋白I浓 度低于0. 15ng/ml。因此，只有存在如此大的阴性和阳性差异的情况下，现有的依靠肉眼判 断的检测方法才能判定检测为阳性或阴性，但无法确定其具有进一步的临床诊断和治疗价 值的动态变化结果。因此，开发一种使用方便，操作快捷的可依靠肉眼判断进行半定量分析 的的胶体金属快速检测技术将对提高医疗卫生、畜牧业、农业等领域服务质量和质量控制水平具有重要的意义。 本发明的目的是提供一种免疫胶体金属检测技术，特别是一种不需要依赖仪器设 备可直接通过目测进行半定量分析的免疫胶体金属检测技术及其制备方法和用途。为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案。本发明所述的一种免疫胶体金属检测技术，其特征在于所述的检测技术是将一个 以上不同捕获强度的捕获剂包被在同一检测膜的不同部位，与待测物在同一系统中反应进 行的检测方法。所述的检测技术，包括以下步骤1)将一个以上不同捕获强度的捕获剂包被在同一检测膜的不同部位；2)将待测液体中的待测物与胶体金属显色剂进行特异性结合反应，形成待测物显 色剂复合物；3)将所述的待测物显色剂复合物与所述的已包被的捕获剂在同一系统中进行 反应，此时在不同捕获强度捕获剂的包被位点呈现不同的显色强度，形成一特定的显色图 案；4)待测样中待测物的浓度不同，检测时呈现的显色图案不同；5)用不同浓度的标准溶液进行所述的检测反应，得到浓度依赖性的标准显色图 案；6)将样品检测所得的显色图案与标准显色图案进行比较，获得待测样品中待测物 的浓度区间范围。所述的标准显色图案用2-20个不同浓度的标准溶液进行制备，得到2-20种不同 的显色图案，每种显色图案代表待测样中的一个特定的浓度。将样品检测所得的显色图案 与标准显色图案进行比较，就能够获得与其最接近的一个或两个标准显色图案，根据这一 个或两个标准显色图案所代表的待测物样品浓度就可以获得待测样品中待测物的浓度区 间范围。所述的检测技术由固相检测膜、支撑片、显色剂、捕获剂和标准显色图案组成。所述的固相检测膜具有明显的蛋白质结合特性包括硝酸纤维素膜、PVDF膜、 尼龙膜、DEAE纤维素膜。常用的具有明显的蛋白质结合特性的固相模有硝酸纤维素膜 (Nitrocellulose Blotting Membranes, NC)禾口 PVDF 膜(Polyvinylidene-Fluoride)、尼龙 膜、DEAE纤维素膜等。硝酸纤维素膜是最广泛使用的蛋白质转移结合介质，对蛋白有很强 的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光(Luminol类)、常规显色、染 色和荧光显色；背景低，信噪比高。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜作为基质的转印膜，与硝酸纤 维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能，市售硝 酸纤维素膜的典型结合量是80-100 μ g/cm2,而PVDF膜结合量是100-200 μ g/cm2。尼龙膜 也有用于蛋白结合，比较于硝酸纤维素膜来说，它的优点是结合力强，结实又柔软且不易卷 曲，机械强度大，便于操作，缺点是背景高。所述的显色剂为胶体金属标记的能与待测物特异性结合的检测剂，其中胶体金属 包括胶体金、胶体硒、胶体银、胶体铜、胶体铁；与待测物特异性结合的检测剂包括抗原、抗体、亲和素、链亲和素。所述的捕获剂包括下列物质1)能与所述的待测物特异性结合的抗体；2)能与所 述的待测物特异性结合的抗原；3)能通过生物素标记物与待测物特异性结合的亲和素；4) 能通过生物素标记物与待测物特异性结合的链亲和素。所述的能通过生物素标记物与待测物特异性结合的亲和素为检测试剂最常用的 生物素-亲和素检测系统，具体为当待测物为抗原时，用胶体金属标记特异性第一抗体， 用生物素标记可与第一抗体配对的第二抗体，用亲和素包被固相检测膜。检测时，抗原首先 与胶体金属标记的第一抗体特异性结合，再通过抗原与生物素标记的第二抗体结合，形成 胶体金属-第一抗体+抗原+第二抗体复合物，然后所述的复合物通过生物素与包被的亲 和素结合，产生显色反应。所述的能通过生物素标记物与待测物特异性结合的链亲和素为检测试剂最常用 的生物素-链亲和素检测系统，具体为当待测物为抗原时，用胶体金属标记特异性第一 抗体，用生物素标记可与第一抗体配对的第二抗体，用链亲和素包被固相检测膜。检测时， 抗原首先与胶体金属标记的第一抗体特异性结合，再通过抗原与生物素标记的第二抗体结 合，形成胶体金属-第一抗体+抗原+第二抗体复合物，然后所述的复合物通过生物素与包 被的链亲和素结合，产生显色反应。所述的支撑片为用于固定固相检测膜和其它检测材料的支撑物，以PVC板最为常用。所述的不同捕获强度的捕获剂包括下列方式1)不同剂量的同一捕获剂，2)不同 类型的捕获剂及其组合，其中包括用所述的抗体、抗原、亲和素、链亲和素中的一种以上的 成分分别包被检测膜和用所述的抗体、抗原、亲和素、链亲和素中的一种以上的成分混合制 成不同浓度的混合物包被检测膜。所述的不同剂量的同一捕获剂包括用不同浓度的捕获剂 包被和用同一浓度不同包被体积的捕获剂包被，最终结果是使在检测膜上的不同部位包被 的捕获剂的剂量或包被的捕获剂的绝对量的不同。所述的不同类型的捕获剂及其组合为所 述的抗体、抗原、亲和素、链亲和素中的一种以上不同的组合，例如将检测膜的不同部位分 别用相同或不同浓度的抗体、亲和素、链亲和素包被或用抗原、亲和素、链亲和素包被；或者 是将抗体与亲和素或链亲和素按比例混合进行包被或抗原与亲和素或链亲和素按比例混 合进行包被，其结果是使检测膜上不同的捕获剂包被位点与待测物反应时呈现不同的显色 强度。所述的一个以上不同捕获强度捕获剂的数量选择2-20个，优选3-10个，更有选 3-5个。其在检测膜上的包被方式可采用线条式，也可采用斑点式。所述的检测技术包括免疫层析法和斑点法。所述的检测技术还包括双球夹心法、 微板法等。所述的检测技术为胶体金属免疫层析法，由包括支撑片、固相检测膜、含有显色剂 膜垫、捕获剂、样品垫、标准显色图案、吸水垫、移液管等组成，其中在支撑底片上依次装有 样品垫、含有显色剂膜垫、包被有捕获剂的固相检测膜、吸水垫，包括以下步骤1)将一个以上不同捕获强度的捕获剂包被在同一检测膜的不同部位，即为包被有 捕获剂的固相检测膜；2)用胶体金属溶液标记能与待测物特异性结合的检测剂，制备显色剂；
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3)将标记后的免疫显色剂喷涂至显色剂垫上，干燥，即为含有显色剂膜垫；4)在支撑底片上依次装贴样品垫、含有显色剂膜垫、包被有捕获剂的固相检测膜、 吸水垫；5)将待测样品点加至样品垫上，进入含有显色剂膜垫，使待测物与胶体金属显色 剂进行特异性结合反应，形成待测物显色剂复合物；3)将所述的待测物显色剂复合物与所述的已包被的捕获剂在同一系统中进行 反应，此时在 不同捕获强度捕获剂的包被位点呈现不同的显色强度，形成一特定的显色图 案；4)待测样中待测物的浓度不同，检测时呈现的显色图案不同；5)用不同浓度的标准溶液进行所述的检测反应，得到浓度依赖性的标准显色图 案；6)将样品检测所得的显色图案与标准显色图案进行比较，获得待测样品中待测物 的浓度区间范围，进而进行待测样品中待检物含量的半定量分析。所述的检测技术，其特征在于联合使用多种胶体金属显色信号放大技术提高检测 灵敏度，包括免疫金银染色放大技术、生物素-亲合素放大技术、生物素-链霉亲合素放大 技术、第二抗体结合放大技术。所述的技术结合荧光显色、显色定量分析等设备，可进行待 测物含量的全定量分析。所述的检测技术在胶体金属固相检测技术产品开发中的用途，包括医疗卫生、畜 牧业、农业等多个领域。目前免疫胶体金属检测技术已广泛用于各个领域，所述的检测技术 在医疗卫生检测产品以及食品、药品和实验用品的目标检测物含量检测中的用途。本发明 技术可制成多种即用型产品，不仅使用方便、易于储藏，便于携带，而且检测所需时间短，如 进行半定量分析，不需要专用设备，也不需要专用的实验条件以及相关的专业知识。[有益效果]1、首次采用胶体金属标记显色技术将待测物样品与包被在同一检测膜上不同部 位的一个以上不同捕获强度的捕获剂在同一反应体系下进行反应，不借助仪器设备可通过 肉眼观察直接判定待测物的含量区间范围，进行半定量分析，提高了该检测技术的准确性。2、快速检测是人们对目前广泛用于医疗卫生疾病诊断和病情监测的检测试剂和 用于畜牧业和农业等多个领域的产品质量控制的检测试剂的共同要求和愿望，但现行的免 疫胶体金属检测技术的半定量和定量分析方法均需要相应的实验设备、实验条件和相应的 人员技术要求。这给检测带来不便，同时需要较长的检测时间。而检测耗时在某些情况下 非常关键，如急性心肌梗死病人从发病至完成必要的检测明确诊断而实施介入或溶栓治疗 的时间对疾病预后非常关键，时间越短预后越好。而检测的方便程度在多数情况下直接影 响技术产品的普及使用和被检产品的质量控制。而快速检测是本发明技术的重要特点。3、可通过目测进行样品中待测物含量的半定量直接测定，克服目前胶体金属检测 技术通过目测只能进行定性分析的缺点，提高了检测质量和适用范围。以心肌肌钙蛋白I 胶体金检测试剂盒为例，心肌肌钙蛋白I是反映心肌受损的一重要标志物，正常情况下血 液浓度很低，低于0. 16ng/ml。心肌受损时血液浓度会有所升高，最高可达每毫升几百纳克 (ng)，与心肌受损的程度相关。大多数心肌损伤性疾病如心肌炎、心力衰竭、心肌病、心绞痛 等其血液心肌肌钙蛋白I浓度多数在1. 5ng/ml以下，大于1. 5ng/ml的病例不足10%，但90%以上急性心肌梗死发病后6小时的病例，其血液中心肌肌钙蛋白I浓度大于1. 5ng/ml, 并且随着病情变化而变化。大多数心肌组织坏死严重的病例其血液中心肌肌钙蛋白I的浓 度大于5ng/ml。目前临床上使用的不用仪器仅用肉眼判断结果的胶体金快速检测试剂盒， 只能提供阳性或阴性的检测结果，即血液浓度大于1.5ng/ml时显色，为阳性，血液浓度小 于1. 5ng/ml时不显色，为阴性，只对急性心肌梗死的病例提供辅助诊断价值，对其它心肌 损伤性疾病及心肌梗死后的病情变化动态及治疗效果无法提供有价值的检测资料。本发明 技术不用仪器仅用肉眼判断可直接进行血液心肌肌钙蛋白I浓度的半定量分析，及做到快 速方便，又可有效地提高监测质量、扩大检测有效范围。4、使用方便。本发明产品使用方便、携带方便，为产品的使用提供了更为便捷的途
经。 5、生产工艺简单价格低廉，非常利于市场推广。因此，本发明技术在医疗卫生、畜牧业、农业等多个领域对提高服务质量和产品质 量控制具有重要的意义和良好的应用前景。
图1为本发明层析法检测试剂盒结构示意2为本发明斑点法检测试剂盒结构示意图通过以下具体实施实例，可以进一步了解本发明，但以下实例不是对本发明的限 定。所用的标准比对品均经过化学发光法确定其待测物浓度。实施例1-本发明层析法半定量检测试剂盒的制作如图1所示，本发明层析法的基本结构由包括样品垫1、显色剂2、固相检测膜3、捕 获剂4、吸水垫5、支撑片6、标准显色图案7组成，其中样品垫1、喷涂有显色剂2的膜垫、包 被有捕获剂4的固相检测膜3和吸水垫5依次附着于支撑片6上，不同浓度的标准显色图 案7也作为组成成分放置于同一包装内。将待检测样品滴加至样品垫1上，然后驱动显色 剂2向前泳动，流经固相检测膜3及所包被的捕获剂4，并由吸水垫5吸收。此时固相检测 膜3上会呈现出一显色图案，将该显色图案与标准显色图案7比较，就可获得显色与其相邻 的一个或两个标准显色图案及所代表的样品浓度，即为待测样品浓度区间。实施例2-本发明斑点法半定量检测试剂盒的制作如图2所示，本发明斑点法的基本结构由包括显色剂2、固相检测膜3、捕获剂4、支 撑片6、清洗液8、标准显色图案7组成，其中包被有捕获剂4的固相检测膜3附着于支撑片 6上，喷涂有显色剂2的膜垫置于固相检测膜3上，不同浓度的标准显色图案7和盛有清洗 液8管也作为组成成分放置于同一包装内。将待检测样品滴加至显色剂2膜垫1上，然后 驱动显色剂2向下流动，流经固相检测膜3及所包被的捕获剂4，反应一定时间后，移除显色 剂2膜垫，用清洗液8反复冲洗固相检测膜3至本底显色与标准显色图案7相近，弃去全部 情洗液8，与标准显色图案比较，就可获得显色与其相邻的一个或两个标准显色图案及所代 表的样品浓度，即为待测样品浓度区间。实施例3-本发明单一捕获剂心肌肌钙蛋白I胶体金层析法半定量检测试剂盒的制作及实验观察实验材料人心肌肌钙蛋白I、抗人人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、氯金酸、柠檬酸 三钠、碳酸钾、结晶牛血清蛋白、硝酸纤维素膜、PVC底片、多聚酯膜、吸水纸、样品垫、微量加 样器、牛血清上样缓冲液、正常人血清样品、急性心肌梗死病人血清。方法用去离子水将氯金酸配成浓度为0. 01%的溶液，加热至沸腾，每IOOml加 入100ull0%的柠檬酸三钠溶液，迅速搅拌均勻，待颜色变成酒红色、稳定不变时，继续加热 lOmin，冷却至室温，装入试剂瓶中，保存备用。取IOml已制备的胶体金溶液，用碳酸钾 调pH至8. 2，加入lOug/ml (终浓度)抗人人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，混勻，静置30分 钟，加入25ul/ml 10%结晶牛血清蛋白水溶液，静置30分钟，12000rpm，离心20分钟，弃上 清，沉淀溶于100ul/ml含0. 2% BSA的PBS中，制成胶体金标记物，喷于多聚酯膜上，37°C干 燥后，待用，此即显色剂膜垫。在硝酸纤维素膜上分别依次划线包被浓度为0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 8,1. 6mg/ml 的羊抗人心肌肌钙蛋白I多克隆抗体，浓度为1.0mg/ml的羊抗鼠IgG作为检测对照，37°C 干燥后，待用，此即为包被有捕获剂的固相检测膜。测试条的组装依次将样品垫、显色剂膜垫、包被有捕获剂的固相检测膜、吸水纸 粘贴在PVC底片上，用切条机切成4mm宽的测试条，干燥保存备用。检测时取采用免疫化学发光法检测的已知肌钙蛋白I浓度的正常人血清样品8份 和急性心肌梗死病人血清样品8份各lOOul，分别滴加到两个试纸条的样品垫上，经过显色 剂膜垫，向前泳动，流经包被有捕获剂的固相检测膜，待测物被捕获剂特异性捕获而在捕获 剂包被位置显色。点样15分钟后，固相检测膜上会呈现出一显色图案，将该显色图案与标 准显色图案比较，就可获得样品显色图案与其相邻的一个或两个标准显色图案及所代表的 样品浓度，即为待测样品浓度区间。制备标准显色图案分别配置浓度为0. 15,0. 5,1. 0,1. 5,5. 0,7. 5ng/ml的人心肌 肌钙蛋白I的标准溶液，分别点加到已制备的测试条上，15分钟后，对各测试条的显色图案 分别拍照，制成标准显色图案。结果见表1，本发明检测结果与免疫化学发光法检测的血清样品浓度一致。表1、血清心肌肌钙蛋白I浓度检测结果比较(ng/ml)
权利要求
1.一种免疫胶体金属检测技术，其特征在于所述的检测技术是将一个以上不同捕获强 度的捕获剂包被在同一检测膜的不同部位，与待测物在同一系统中反应进行的检测方法。
2.根据权利要求1所述的检测技术，包括以下步骤1)将一个以上不同捕获强度的捕获剂包被在同一检测膜的不同部位；2)将待测液体中的待测物与胶体金属显色剂进行特异性结合反应，形成待测物显色剂 复合物；3)将所述的待测物显色剂复合物与所述的已包被的捕获剂在同一系统中进行反应，此 时在不同捕获强度捕获剂的包被位点呈现不同的显色强度，形成一特定的显色图案；4)待测样中待测物的浓度不同，检测时呈现的显色图案不同；5)用不同浓度的标准溶液进行所述的检测反应，得到浓度依赖性的标准显色图案；6)将样品检测所得的显色图案与标准显色图案进行比较，获得待测样品中待测物的浓 度区间范围。
3.根据权利要求1所述的检测技术，其特征在于所述的检测技术由固相检测膜、支撑 片、显色剂、捕获剂和标准显色图案组成，其中1)所述的固相检测膜具有明显的蛋白质结合特性包括硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙 膜、DEAE纤维素膜；2)所述的显色剂为用胶体金属标记的能与待测物特异性结合的检测剂，其中胶体金属 包括胶体金、胶体硒、胶体银、胶体铜、胶体铁；与待测物特异性结合的检测剂包括抗原、抗 体、亲和素、链亲和素；3)所述的捕获剂包括能与所述的待测物特异性结合的抗体、能与所述的待测物特异性 结合的抗原、能通过生物素标记物与待测物特异性结合的亲和素、能通过生物素标记物与 待测物特异性结合的链亲和素中的一种或一种以上的物质；4)所述的标准显色图案为用2-20个不同浓度的标准溶液制备获得的2-20种不同的显 色图案，每种显色图案代表待测样中的一个特定的浓度；5)所述的支撑片为用于固定固相检测膜和其它检测材料的支撑物，以PVC板最为常用。
4.根据权利要求1所述的检测技术，其特征在于所述的不同捕获强度的捕获剂包括下 列方式1)不同剂量的同一捕获剂；2)不同类型的捕获剂及其组合，其中包括用所述的抗体、抗原、亲和素、链亲和素中的 一种以上的成分分别包被检测膜和用所述的抗体、抗原、亲和素、链亲和素中的一种以上的 成分混合制成不同浓度的混合物包被检测膜。
5.根据权利要求1所述的检测技术，其特征在于所述的一个以上不同捕获强度捕获剂 的数量选择2-20个，优选3-10个。
6.根据权利要求1所述的检测技术，其特征在于所述的检测技术包括免疫层析法和斑 点■/去ο
7.根据权利要求1所述的检测技术，其特征在于联合使用多种胶体金属显色信号放大 技术提高检测灵敏度，包括免疫金银染色放大技术、生物素-亲合素放大技术、生物素-链 霉亲合素放大技术、第二抗体结合放大技术。
8.权利要求1所述的检测技术在胶体金属免疫层析检测技术产品开发中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种免疫胶体金属检测技术，是将一个以上不同捕获强度的捕获剂包被在同一检测膜的不同部位，与待测物在同一系统中反应进行的检测方法，由固相检测膜、支撑片、显色剂、捕获剂、标准标准显色图谱组成，可制成多种即用型的待测物含量检测产品，可有效地用于临床检测、食品、药品和实验用品等的待测物含量检测，具有良好的适用价值和市场前景。
文档编号G01N33/544GK102135498SQ20101010043
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者刘凤鸣 申请人:刘凤鸣