专利名称：弥漫性大b细胞淋巴瘤分子病理分型方法及试剂盒和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及血液肿瘤学和医学领域，尤其涉及弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分 型方法及试剂盒和应用。
背景技术：
弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常见的非 霍奇金淋巴瘤，约占每年初发非霍奇金淋巴瘤的40%左右。我国目前非霍奇金淋巴瘤的发 病率约为3-4/10万，并以每年2-3%的速度增长，其中弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)最为 常见，约占每年所有淋巴瘤的50%，因此，每年全国新发病例约为2-3万。DLBCL具有显著的生物学异质性，病人对治疗的反应差异显著，常规的CHOP联合 化疗方案(环磷酰氨、阿霉素、长春新碱和泼泥松)只能使约40%的患者获得长期缓解。随 着人-鼠嵌合性抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗，Rituximab)联合化疗(R-CHOP)的应用， 进一步提高DLBCL的临床疗效，但仍有30-40%的患者对治疗无效或治疗后迅速复发，疾病 进展快，预后差。因此，加强DLBCL生物学特性的研究，制定相应的治疗方案成为目前DLBCL 的研究热点。当前临床对DLBCL进行危险分层，主要是通过国际预后指数(International Prognostic Index, IPI)，包括年龄，体力状态，临床Ann Arbor分期，节外病灶数目，乳酸 脱氢酶水平。由于这种评价只是临床参数的组合，不能反映肿瘤发生过程中内在的分子生 物学异质性，因此对于相当一部分病例的预后不能进行准确评价，一些被分在低危、低中危 组的病人5年生存率仍仅有32%。基因芯片技术的应用为阐明DLBCL潜在的生物学异质性提供了一个高通量平台， 通过DLBCL基因表达谱分析，鉴别出了三种DLBCL亚型，提示肿瘤性B细胞处在不同的分 化阶段一种称为生发中心 B 细胞样 DLBCL(germinal center B cell-like DLBCL, GCB)， 此亚型因与正常生发中心B细胞表达的基因标志相同而得名；另一种亚型称为活化B细 胞样DLBCL (activated B cell-like DLBCL，ABC)，此亚型表达的基因型与促有丝分裂刺 激后外周血B细胞相似，GCB与ABC之间有数千基因表达差异。除以上两型之外，仍有 17% -40%的DLBCL无法用细胞起源来分型，被统称为3型(type3)，ABC和type3统称为非 GCB(non-GCB)。DLBCL亚型是独立于IPI的预后评价指标，各亚型对传统的联合化疗CHOP 方案的反应性和疗效各不相同，ABC和GCB的五年生存率分别为31%和59%，GCB的生存率 明显好于ABC，而3型本身具有异质性，无确定的生存率，但其总体预后情况与ABC亚型相 似。通过20例弥漫大B细胞淋巴瘤基因芯片表达谱分析，检测到一些与弥漫大B细 胞淋巴瘤分子病理分型及预后相关的特定基因，如Bcl-2，Bcl-6, CCND2, MYC, SCYA3，FNl, FOXP1, PKC-β，HGAL，⑶10，和MUMl等等。从中筛选出三个代表着B细胞分化不同阶段的 基因⑶10，Bcl-6和MUM1，其中⑶10和Bcl_6为生发中心B细胞标志，而MUMl为后生发中 心B细胞标志。基因芯片技术加深了对DLBCL生物学特性的理解，但因其对标本的要求较高(新鲜标本、适宜的冷冻保存等)、操作复杂、且基因芯片检测代价较高，故制约了 其临床实用性。申请号为200710173600.8的发明专利申请是利用普通免疫组织化学 (immunohistochemistry, IHC)的方法，对 DLBCL 标本进行 CD10、Bcl_6 和 MUMl 蛋白的表达 情况检测，并通过结果分析对弥漫大B细胞淋巴瘤进行分子病理分型。但是，这种常规免疫 组化的方法基本上是通过显色的手段来进行结果判断，三种指标的检测就意味着同一个样 本最少需要三张切片，每张切片进行一次免疫组化实验，然后对三张切片的结果分别进行 判读。整个过程存在很多重复步骤，操作繁琐、效率低。
发明内容
本发明要解决普通免疫组化方法对弥漫性大B细胞淋巴瘤进行分子病理分型时 操作繁琐、效率低的技术问题，提供一种结合量子点技术的弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病 理分型方法，显著提高了实验的工作效率。此外，还需要提供一种弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型的试剂盒及其应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法，包 括以下步骤将三种不同波长的量子点标记物作为荧光探针，检测生物样品中⑶10、Bcl-6和 MUMl蛋白的表达；依据检测结果进行分子病理分型，若CDlO (+)、或CDlO (_)/Bcl-6 (+)/MUMl (_)， 则表明该弥漫性大B细胞淋巴瘤为GCB型；若CDlO (-)/Bcl-6 (-)、或CDlO (-)/Bcl-6 (+)/ MUMl (+)，则表明该弥漫性大B细胞淋巴瘤为非GCB型。所述三种不同波长的量子点标记物，用于分别标记生物样品中⑶10、Bcl-6和 MUMl蛋白，使得在同一张切片上能同时检测该三种蛋白。优选的，所述检测通过免疫组织化学或组织芯片的方法实现。优选的，免疫组织化学所用的三种单克隆抗体，其至少包括两种不同种属来源，即 在选择该三种单克隆抗体时，至少选用两种种属来源的单克隆抗体进行组合，例如三种单 克隆抗体两种鼠源、一种兔源。在本发明的另一方面，还提供了一种用于弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型的 试剂盒，所述试剂盒包含针对CDlO蛋白的特异性抗体及量子点标记物；针对Bcl-6蛋白的特异性抗体及量子点标记物；针对MUMl蛋白的特异性抗体及量子点标记物。优选的，所述针对CDlO蛋白、Bcl-6蛋白和MUMl蛋白的量子点具有不同的波长， 适于在同一张切片上同时检测该三种蛋白。所述试剂盒采用免疫组织化学或组织芯片的方法对生物样品进行检测。在本发明的另一方面，还提供了一种上述试剂盒的应用，用于指导医生对弥漫性 大B细胞淋巴瘤患者选择适宜的治疗方案，当试剂盒的检测结果是CDlO (+)、或CDlO (_)/Bcl-6 (+)/MUMl (-)时，表明该弥漫 性大B细胞淋巴瘤为GCB型，宜对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者采用CHOP方案治疗；
当试剂盒的检测结果是CDlO㈠/Bcl-6㈠、或CDlO㈠/Bcl_6⑴/MUMl (+)时，表 明该弥漫性大B细胞淋巴瘤为非GCB型，宜对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者采用R-CHOP方案 治疗。采取上述治疗方案的选择，是因为在以往研究中发现，弥漫性大B细胞淋巴瘤患 者采用传统CHOP方案，GCB型患者预后明显优于非GCB型患者；采用R-CHOP方案治疗，GCB 型患者与非GCB型患者预后无明显差异；GCB型患者采用CHOP方案治疗与采用R-CHOP方 案治疗预后无明显差异。因此，采用传统的CHOP方案，GCB型患者预后优于非GCB型患者； 利妥昔单抗(Rituximab)联合化疗(R-CH0P方案)可以使非GCB型患者受益，而并不能提 高GCB型患者的疗效。利妥昔单抗每个疗程治疗费用为10-15万元，对于国内大部分患者来说是沉重经 济负担。利用本发明试剂盒对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者进行分子病理分型后，选择合理 的治疗方案，有利于节约GCB型患者的医疗支出。在本发明的另一方面，还提供了一种上述试剂盒的应用，用于对弥漫性大B细胞 淋巴瘤患者作预后评价。本发明弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法，具有以下有益效果(1)本发明将三种不同波长发射光的量子点应用到⑶10、BCL6与MUMl的免疫组 化检测中，在一张切片上进行免疫组化实验，同时完成三种指标的检测，显著提高了实验的
工作效率。(2)本发明解决了基因芯片技术在进行DLBCL分型过程中对标本要求高、操 作复杂、代价高的问题，具有很好的临床实用性。使用基因芯片的检测费用为每例患者 7000-9000元，而使用DLBCL分子病理分型诊断试剂盒检测为每例患者200-300元，费用明 显降低，且检测效果相似、重复性好。(3)利妥昔单抗每个疗程治疗费用为10-15万元，对于国内大部分患者来说是沉 重经济负担，因为利妥昔单抗并不能提高GCB型患者的疗效，故鉴定患者的分子病理分型 后，选择合理的治疗方案，有利于节约GCB型这部分患者的医疗支出。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明DLBCL免疫组化分子分型树示意图；图2是本发明DLBCL量子点分子分型图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物 学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京 科学出版社，2004)中所述的方法进行。本发明是结合量子点技术的弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型，提供了一种 弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型的量子点免疫组化检测方法，其原理是不同大小的 量子点能被单一波长的光激发而发出不同颜色的光，且光化学稳定性高，适于用作荧光探 针。本发明采用三种不同粒径大小的量子点(同一波长的光激发时能发出三种不同波长的光)，分别标记生物样品中⑶10、Bcl-6和MUMl蛋白，通常这种标记是间接标记，如量子点 标记物与特异抗体结合，特异抗体与生物样品中CD10、Bcl-6或MUMl抗原蛋白结合。间接 标记也可以是量子点标记物与二抗结合，二抗与单克隆抗体(特异一抗)结合，单克隆抗体 与生物样品中⑶10、Bcl-6或MUMl抗原蛋白结合，即形成“抗原-单克隆抗体-二抗-量 子点标记物”，在这种情况下，所用的三种单克隆抗体，至少选用两种种属来源的单克隆抗 体进行组合。在本发明实施例中，针对需要检测的三个指标，其分别分布在细胞膜(CDlO)、细 胞核(BCL6、MUM1)中，因此选择两种鼠源的单克隆抗体(CD10、MUM1)与兔源的单克隆抗 体(BCL-6)进行组合，将量子点标记的链霉亲和素复合物(QDs-SA)作为量子点标记物，该 QDs-SA能与生物素化二抗相结合，当特异一抗与相应靶抗原结合后，生物素化二抗与特异 一抗结合，最后形成“抗原-特异一抗-生物素化二抗-QDs-SA”。本发明采用量子点标记 物作为荧光探针，能在同一切片上同时检测⑶10、Bcl-6和MUMl三种蛋白的表达情况，与普 通免疫组化方法相比，效率明显提高，有利于为弥漫性大B细胞淋巴瘤患者及时给出合理 的治疗方案。实施例1弥漫性大B细胞淋巴瘤量子点免疫组化检测1.标本收集DLBCL标本均以10%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色， 由专门从事淋巴瘤研究的医生按新的WHO分类诊断。2.标本处理将已在烤箱中干燥过的石蜡切片浸于二甲苯中15分钟，二次。取出切片置于 100%无水乙醇中10分钟两次；依次置入90% -70%各级酒精各10分钟。取出置于蒸馏水 中。取出蒸馏水中的切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加过氧化 物酶阻断剂-3%甲醇-H2O2于组织上避光孵育20分钟。蒸馏水冲洗，再将切片置入TBS缓 冲液中，浸泡5分钟，三次。取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体，平放于湿盒中。医用微波炉抗原修复20分钟，取出后自然冷却30分钟，抗原修复液选用Tris/ EDTA(50mMTris,2mM EDTA,PH9.0)。1 %牛血清白蛋白(BSA)室温封闭20分钟。3.量子点免疫组织化学检测针对需要检测的三个指标，其分别分布在细胞膜(CDlO)、细胞核(BCL6、MUM1)中， 因此选择两种鼠源的单克隆抗体(⑶10、MUM1)与兔源的单克隆抗体(BCL-6)进行组合。滴加用抗体稀释液稀释的一抗(⑶10和BCL6混合液)，37°C湿盒孵育2hr转4°C 过夜；TBS-T洗涤(3 X 5min)，滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育封闭IOmin ；滴加用抗体稀释液稀释的生物素化羊抗兔IgG，37°C湿盒孵育30min ；TBS-T洗涤(3 X 5min)，滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育封闭20min ；滴加用抗体稀释液稀释的由量子点(quantum dots, QDs)标记的链霉亲和素复合 物(QDs-SA，545nm)和由量子点(QDs)标记的二抗(QDs_G/M IgG，605nm，购自武汉珈源量子 点技术开发有限责任公司)37°C孵育Ihr ；TBS-T洗涤(3 X 5min)，滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育封闭IOmin ；
滴加用试剂C稀释的MUM1，37°C湿盒孵育2hr ；TBS-T洗涤(3 X 5min)，滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育封闭IOmin ；滴加用抗体稀释液稀释的生物素化马抗鼠IgG，37°C湿盒孵育30min ；TBS-T洗涤(3 X 5min)，滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育封闭20min ；滴加用抗体稀释液稀释的量子点标记链霉亲和素复合物(QDs-SA，705nm) 37°C湿 盒孵育30min ；TBS-T洗涤(3X5min)，TBS洗涤(2X5min)；缓冲甘油封片，荧光显微镜下紫外光 激发观察成像。4.结果判定与分析⑶10阳性定位于细胞膜，Bcl-6、MUM1阳性定位于细胞核，大于30%的肿瘤细胞着 色判为阳性。实施例1病理切片量子点检测结果是50例弥漫大B细胞淋巴瘤标本中，⑶10、 Bcl-6、MUM1 的阳性率分别为 34%,34%,56%05.弥漫大B细胞淋巴瘤分子分型(免疫组化法)及病理切片分子分型结果CD10、Bcl-6作为生发中心细胞来源的标志物，CDlO (+)或CDlO (-)/Bcl_6 (+)/ MUMl (-)，为GCB类；CDlO (-) /Bcl-6 (-)，为非GCB类。MUMl作为后生发中心细胞来源的标志 物，若 CDlO (-) /Bcl-6 (+)，则以 MUMl 来分类MUM1 (+)为非 GCB 类，MUMl (-)为 GCB 类(见 图 1)，即 CDlO (-)/Bcl-6 (+)/MUMl (+)为非 GCB 类，CDlO (-)/Bcl_6 (+)/MUMl (-)为 GCB 类。简而言之，当⑶10⑴、或⑶10㈠/Bcl-6⑴/MUMl㈠，则表明该弥漫大B细胞淋 巴瘤为GCB类；当CDlO (-) /Bcl-6㈠、或CDlO㈠/Bcl-6 (+) /MUMl (+)，则表明该弥漫大B细 胞淋巴瘤为非GCB类。DLBCL量子点分子分型图像如图2所示。实施例1病理切片分子分型结果如下总的50例弥漫大B细胞淋巴瘤标本中，GCB18例(36% ),非GCB32例(64% )。在 18 例 GCB 中，17 例(94. 4% )CD10(+)，1 例(5. 6% ) CDlO (-)/Bcl_6 (+)/MUMl (-)。在 32 例 非 GCB 中，12 例(27.5% ) CDlO (-)/Bcl_6 (-)/MUMl (+)，7 例(21.9% ) CDlO (-)/Bcl_6 (+) / MUMl (+)，13 例(40. 6% ) CDlO (-) /Bcl-6 (-) /MUMl (-)。实施例2组织芯片弥漫性大B细胞淋巴瘤量子点免疫组化检测1.标本处理脱蜡前将组织芯片放在60恒温箱中烘烤30分钟；置于二甲苯I中浸泡10分钟， 在二甲苯II中浸泡10分钟，在二甲苯III中浸泡10分钟，在二甲苯IV中浸泡10分钟；无 水乙醇I中浸泡5分钟，在无水乙醇II中再浸泡5分钟；95%乙醇中浸泡5分钟；85%乙醇 中浸泡5分钟；70%乙醇中浸泡5分钟；蒸馏水中浸泡5分钟。抗原热修复取一定量的0. OlM柠檬酸盐缓冲液pH6. 0于压力锅中大火加热至沸腾，将脱蜡水 化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖扣上压力阀继 续加热至喷气，从喷气开始计时1-2分钟后将压力锅离开热源冷却至室温，取出玻片先用 蒸馏水洗两次后用PBS洗5分钟。2.量子点免疫组织化学检测
针对需要检测的三个指标，其分别分布在细胞膜(CDlO)、细胞核(BCL6、MUM1)中， 因此选择两种鼠源的单克隆抗体(⑶10、MUM1)与兔源的单克隆抗体(BCL-6)进行组合。滴加用抗体稀释液稀释的一抗(⑶10和BCL6混合液)，37°C湿盒孵育2hr转4°C 过夜；TBS-T洗涤(3 X 5min)，滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育封闭IOmin ；滴加用抗体稀释液稀释的生物素化羊抗兔IgG，37°C湿盒孵育30min ；TBS-T洗涤(3 X 5min)，滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育封闭20min ；滴加用抗体稀释液稀释的量子点(QDs)标记链霉亲和素复合物(QDs-SA，545nm) 和量子点(QDs)标记二抗(QDs-G/M IgG，605nm)37°C孵育 Ihr ；TBS-T洗涤(3 X 5min)，滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育封闭IOmin ；滴加用试剂C稀释的MUM1，37°C湿盒孵育2hr ；TBS-T洗涤(3 X 5min)，滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育封闭IOmin ；滴加用抗体稀释液稀释的生物素化马抗鼠IgG，37°C湿盒孵育30min ；TBS-T洗涤(3 X 5min)，滴加封闭缓冲液，37°C湿盒孵育封闭20min ；滴加用抗体稀释液稀释的量子点标记链霉亲和素复合物(QDs-SA，705nm) 37°C湿 盒孵育30min ；TBS-T洗涤(3X5min)，TBS洗涤(2X5min)；缓冲甘油封片，荧光显微镜下紫外光 激发观察成像。3.结果判定与分析⑶10阳性定位于细胞膜，Bcl-6、MUM1阳性定位于细胞核，大于30%的肿瘤细胞着 色判为阳性。实施例2组织芯片量子点检测结果是组织芯片上共计30例弥漫大B细胞淋巴瘤标本，其中1例掉片，⑶10(15)、 Bcl-6 (8), MUMl (15)的阳性率分别为 51. 7%,27. 6%,51. 7%04.组织芯片分子分型结果总的30例弥漫大B细胞淋巴瘤标本中，GCB17例(58. 6% )，非GCB12例(41.4%)。 在 17 例 GCB 中，15 例(88. 2% ) CDlO (+)，2 例(11. 8% ) CDlO (-) /Bcl-6 (+) /MUMl (-)。在 12 例非 GCB 中，8 例(66. 7% ) CDlO (-) /Bcl-6 (-) /MUMl (+)，4 例(33. 3% ) CDlO (-) /Bcl-6 (-) / MUMl(-)。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
一种弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法，其特征在于，包括以下步骤将三种不同波长的量子点标记物作为荧光探针，检测生物样品中CD10、Bcl 6和MUM1蛋白的表达；依据检测结果进行分子病理分型，若CD10(+)、或CD10( )/Bcl 6(+)/MUM1( )，则表明该弥漫性大B细胞淋巴瘤为GCB型；若CD10( )/Bcl 6( )、或CD10( )/Bcl 6(+)/MUM1(+)，则表明该弥漫性大B细胞淋巴瘤为非GCB型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测通过免疫组织化学或组织芯片 的方法实现。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，免疫组织化学所用的三种单克隆抗体，其 至少包括两种不同种属来源。
4.一种用于弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 包含针对CDlO蛋白的特异性抗体及量子点标记物；针对Bcl-6蛋白的特异性抗体及量子点标记物；针对MUMl蛋白的特异性抗体及量子点标记物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述针对CDlO蛋白、Bcl-6蛋白和MUMl 蛋白的量子点具有不同的波长，适于在同一张切片上同时检测该三种蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用免疫组织化学或组 织芯片的方法对生物样品进行检测。
7.权利要求4所述试剂盒的应用，其特征在于，用于指导医生对弥漫性大B细胞淋巴瘤 患者选择适宜的治疗方案，当⑶10 (+)、或⑶10 (-) /Bcl-6 (+) /MUMl (-)时，宜对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者采用 CHOP方案治疗；当 CDlO (-) /Bcl-6 (-)、或 CDlO (-) /Bcl-6 (+) /MUMl (+)时，宜对弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 患者采用R-CHOP方案治疗。
8.权利要求4所述试剂盒的应用，其特征在于，用于对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者作预 后评价。
全文摘要
本发明公开一种弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法，将三种不同波长的量子点标记物作为荧光探针，检测生物样品中CD10、Bcl-6和MUM1蛋白的表达。本发明还公开了用于弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型的试剂盒及其应用。本发明弥漫性大B细胞淋巴瘤分子病理分型方法，显著提高了工作效率，且对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者采取合理的治疗方案，有利于节省医疗费用。
文档编号G01N33/68GK101968491SQ20101029647
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者宋凯, 张庆华, 李军民 申请人:上海生物芯片有限公司;上海交通大学医学院附属瑞金医院