专利名称：一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒和方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种试剂盒，特别涉及采用LAMP方法快速检 测卫氏并殖吸虫成虫、囊蚴、虫卵的技术，具体来说是一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒 和方法。
背景技术：
卫氏并殖吸虫，是人体并殖吸虫的重要虫种之一，是引起肺型并殖吸虫病为主的 并殖吸虫。卫氏并殖吸虫的致病，主要是童虫或成虫在人体组织与器官内移行、寄居造成的 机械性损伤，及其代谢物等引起的免疫病理反应。根据病变过程可分为急性期及慢性期。 它潜伏期不易确定，感染后急性发病。症状随虫体寄生的部位不同而异。以胸、腹、脑损害 的表现为多见。卫氏并殖吸虫的终宿主除人外，主要为肉食哺乳动物如犬、猫。第一中间宿 主为生活于淡水的川卷螺类。第二中间宿主为淡水蟹和蜊蛄。生活史过程包括卵、毛蚴、胞 蚴、母雷蚴、子雷蚴、尾蚴、囊蚴(脱囊后称后尾蚴)、童虫及成虫等阶段。成虫主要寄生于 肺，所形成的虫囊往往与支气管相通，虫卵经气管随痰或吞入后随粪便排出。卵入水后，在 适宜条件下约经3周左右发育成熟并孵出毛蚴。毛蚴在水中活动，如遇川卷螺，则侵入并发 育，经过胞蚴、母雷蚴、子雷蚴的发育和无性增殖阶段，最后形成许多具有小球形尾的短尾 蚴。成熟的尾蚴从螺体逸出后，侵入淡水蟹或蜊蛄，或随螺体一起被吞食而进入第二中间宿 主体内。在蟹和蜊蛄肌肉、内脏或腮上形成球形或近球形囊蚴。囊蚴直径约300-400 μ m，具 两层囊壁。人吃了含有囊蚴的淡水蟹或蜊蛄而感染。该病的诊断主要采用病原学检查痰或 粪便中的虫卵，以及免疫学实验，但以上技术操作起来需要PCR仪等比较昂贵的仪器，所以 在大批量样本检测和虫卵及囊蚴样本分型时比较费时费力。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是 Notomi等在2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域 设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65°C 左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁 琐的电泳、紫外观察等过程。鉴于以上原因，环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)这种高效，方便快捷的检测技术可用于卫氏并殖吸虫的鉴定，进而可 为卫氏并殖吸虫病的快速检测和防控等提供有效的检测手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒和方法，所述的这种 快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒和方法要解决现有技术中检测卫氏并殖吸虫成虫、囊蚴、 虫卵的方法复杂，又费时又费力的技术问题。本发明提供了一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，包括DNA裂解液、LAMP反应 液、SYBR green I显色液和卫氏并殖吸虫DNA阳性对照液。
进一步的，还包括Bst大片段聚合酶。进一步的，所述的DNA裂解液由细胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液四个 试剂配制而成，配制好后，在所述的DNA裂解液中，所述的细胞裂解液的终浓度为7-10 μ Μ, 所述的EDTA的终浓度为0. 5Μ，所述的蛋白酶K的终浓度为18-20mM，所述的RNase A溶液 的终浓度为3-5 μ Μ。进一步的，所述的LAMP反应液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜碱、引物FIP、引物 BIP、引物F3、引物B3、环引物Loop F、环引物LoopB和MgSO4溶液十二个试剂配制组成，所述 的引物FIP的序列如SEQ ID No :1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No :2所示，所述 的引物F3的序列如SEQ ID No 3所示，所述的引物B3的序列如SEQID No 4所示，所述的 环引物LoopF的序列如SEQ ID No 5所示，所述的环引物LoopB的序列如SEQ ID No 6所 示，配制好后，所述的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的终浓度均为200 μ M，引物FIP、BIP、F3、B3的 终浓度均为0. 2mM,环引物Loop F.LoopB的终浓度均为0. 8 μ M，甜菜碱的终浓度为10 μ Μ, MgSO4的终浓度为10mM。进一步的，所述的SYBR green I显色液为1 10倍稀释液。进一步的，卫氏并殖吸虫DNA阳性对照液的浓度为32. 0-45. Ong/μ L0进一步的，所述的Bst大片段聚合酶的浓度为SU/μ L。本发明还提供了一种快速检测卫氏并殖吸虫的方法，包括如下步骤(1)对被检测的成虫、囊蚴、虫卵的DNA进行提取；(2)采用恒温加热器技术，利用LAMP反应液进行扩增，；(3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察；(4)扩增产物经SYBR green I显色液显色后，在凝胶成像系统下观察。进一步的，所述步骤(2)中，采用恒温加热器技术扩增条件为在55-65°C恒温下反 应40-50分钟。进一步的，所述的LAMP反应液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜碱、引物FIP、引物 BIP、引物F3、引物B3、环引物Loop F、环引物LoopB和MgSO4溶液十二个试剂配制组成，所 述的引物FIP的序列如SEQ ID No :1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No :2所示，所 述的引物F3的序列如SEQ ID No :3所示，所述的引物B3的序列如SEQ ID No :4所示，所述 的环引物LoopF的序列如SEQ IDNo :5所示，所述的环引物LoopB的序列如SEQ ID No :6所 示，配制好后，所述的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的终浓度均为200 μ M，引物FIP、BIP、F3、B3的 终浓度均为0. 2mM,环引物Loop F.LoopB的终浓度均为0. 8 μ M，甜菜碱的终浓度为10 μ Μ, MgSO4的终浓度为IOmM的。本发明采用环介导等温扩增技术(LAMP)技术扩增了核糖体内转录间隔区_2基因 (The second internal transcribed spacers (ITS-2) ofnuclear ribosomal DNA)，发现了 该段基因能特异的区分卫氏并殖吸虫和其他常见感染人的寄生虫。本申请人根据卫氏并殖 吸虫ITS-2基因的特性并结合LAMP技术的检测特点，设计一种采用LAMP方法快速区检测 卫氏并殖吸虫方法。本发明同时提供所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤(I)DNA的提取虫体材料置于1. 5mL的离心管中，用双蒸水反复吹打冲洗3次，移 去离心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白质释放基因组DNA，56°C过夜消化15_18h ；消化好的虫体悬液按 Promega 试剂盒Wizard SV Genomic DNA purification system 使用说明 提取虫体DNA，直接使用或于-20°C冰箱保存备用。囊蚴DNA的提取参照MUller (2007)的方法，将溪蟹或蜊蛄去壳，捣碎，加入Iml人 工胃液，37°C摇床中消化1小时。取出瞬时离心，去上清；加入Iml的双蒸水，摇勻，重复以 上步骤反复清洗两次，最后离心去上清保留30 μ 1左右液体。加入液体体积一半的玻璃珠， 旋涡震荡Imin后离心，沸水中煮5min，最后IOOOOrpm离心lmin，取3μ 1上清进行PCR扩
+飽
+曰ο虫卵DNA的提取方法参照MUller (2007)提纯虫卵的方法并加以改良，取0. 1克阳 性粪便于1. 5ml Eppendorf管中，加入含有2%的Triton X-100和0. IM的氢氧化钾的溶 液Iml室温下作用lOmin，其间不断摇勻。然后IOOOOrpm离心2min，去上清，重复前面的步 骤清洗两次。离心去上清后加入1. 2ml饱和硫代硫化钠溶液，混勻，HOOOrpm离心5min。 此时虫卵主要分布于液面，小部分分布于液体中。分别吸取200 μ 1上清到另一个1. 5ml Eppendorf管中，加入1. 2ml双蒸水，12000rpm离心2min。去上清，保留100 μ 1左右液体， 用移液器吹打使沉淀与液体混勻。然后把各管的液体都移到同一管中，离心管内加满双蒸 水，12000rpm离心2min。去上清，再加入1. 2ml双蒸水，如此重复3 5次。最后离心去上 清，保留30 μ 1液体。在显微镜下操作，用移液器从纯化的虫卵中分别吸取1个、3个、5个虫卵到含有 30 μ 1双蒸水的1. 5ml Eppendorf管中，做好标记，以检测虫卵特异PCR检测方法的敏感性。加入液体体积一半的玻璃珠，旋涡震荡Imin后瞬时离心，沸水中煮5min，最后 IOOOOrpm离心lmin，取3 μ 1上清PCR扩增。(2) LAMP扩增按照扩增样品数η (η =样品数+2)取LAMP反应液、Bst酶混合于一 离心管中，混勻，分装；将阳、阴性对照液分别加入一个分装管中，取各样品的DNA加入对应 反应管中；各反应管标记后离心混勻，置于恒温加热器上反应；(3)LAMP产物观察取扩增后的产物加样于2. 0%琼脂糖凝胶上，电泳后置于紫外 透射仪下观察结果并拍照分析。(4) LAMP显色反应将上述LAMP产物各加入1 μ L SYBR greenl在室温放置5min， 进行显色。(5)显色反应观察肉眼观察阳性反应呈绿色，阴性不变色；在紫外灯下，阳性反 应发出荧光，阴性反应无荧光。步骤(2)所述Bst酶按每个PCR反应含1. 25U加入。步骤⑵所述LAMP扩增条件为肝片吸虫LAMP检测为61°C，大片吸虫LAMP检测 为62V，各反应45分钟。本发明试剂盒LAMP反应条件的优化过程为根据反应体系优化策略，对MgS04、Betaine、Bst DNAPoLymerase、dNTP、引物浓度 等分别进行了优化。根据引物Tm值，将温度按59°C、60°C、61。C、62。C、63°C、64。C、65。C依 次递增，从多次重复试验中确定最佳退火温度。反应时间按30min、45min、60min、90min、 120min优化，多次重复试验确定最佳反应时间。经试验确定，LAMP反应最佳反应温度为 600C ；添加环引物后反应最快可在45min内完成。本发明的有益效果是
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(1)本发明通过对来自于我国肺吸虫病疫区广东和福建的卫氏并殖吸虫成虫分离 株、囊蚴、虫卵进行LAMP反应，结果发现LAMP技术能在短时间检测卫氏并殖吸虫感染。(2)本发明通过优化反应体系和反应条件，研制出一种快速检测卫氏并殖吸虫的 试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观，不仅可用于卫氏 并殖吸虫感染的快速检测，还可用于人和动物卫氏并殖吸虫病的诊断与流行病学调查，为 卫氏并殖吸虫病诊断和防治技术等进一步研究奠定基础。
图1为卫氏并殖吸虫LAMP特异性显色图谱，1-10分别为卫氏并殖吸虫成虫，卫 氏并殖吸虫囊蚴，卫氏并殖吸虫虫卵，肝片吸虫，大片吸虫，中华分支睾吸虫，麝猫后睾吸 虫，日本血吸虫，曼氏血吸虫和空白对照。图2为卫氏并殖吸虫LAMP特异性电泳图谱，M，DL2000marker ； 1-9分别为卫氏 并殖吸虫成虫，卫氏并殖吸虫囊蚴，卫氏并殖吸虫虫卵，肝片吸虫，大片吸虫，中华分支睾吸 虫，麝猫后睾吸虫，日本血吸虫，曼氏血吸虫和空白对照。图3为卫氏并殖吸虫LAMP敏感性电泳图谱，管1_6模板DNA的稀释浓度依次为 KT3-IO-9Iig/μ 1，管7为阴性对照。图4为卫氏并殖吸虫LAMP敏感性显色图谱，管1_6模板DNA的稀释浓度依次为 KT3-IO-9Iig/μ 1，管7为阴性对照。图5为卫氏并殖吸虫LAMP成虫分离株、尾蚴、虫卵LAMP检测显色图谱，其中管1 代表卫氏并殖吸虫成虫，管2-4代表感染囊蚴的溪蟹，管5-7代表感染囊蚴的蜊蛄；管8-13 代表肺吸虫病人的痰液，管14-18代表肺吸虫病人的胸水管19-20代表未感染卫氏并殖吸 虫的溪蟹和健康人的痰液，管21代表阴性对照。
具体实施例方式实施例1本发明一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，包括DNA裂解液、LAMP反应液、SYBR green I显色液和卫氏并殖吸虫DNA阳性对照液。进一步的，还包括Bst大片段聚合酶。进一步的，所述的DNA裂解液由细胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液四个 试剂配制而成，配制好后，在所述的DNA裂解液中，所述的细胞裂解液的终浓度为7-10 μ Μ, 所述的EDTA的终浓度为0. 5Μ，所述的蛋白酶K的终浓度为18-20mM，所述的RNase A溶液 的终浓度为3-5 μ Μ。进一步的，所述的LAMP反应液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜碱、引物FIP、引物 BIP、引物F3、引物B3、环引物Loop F、环引物LoopB和MgSO4溶液十二个试剂配制组成，所述 的引物FIP的序列如SEQ ID No :1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No :2所示，所述 的引物F3的序列如SEQ ID No 3所示，所述的引物B3的序列如SEQID No 4所示，所述的 环引物LoopF的序列如SEQ ID No 5所示，所述的环引物LoopB的序列如SEQ ID No 6所 示，配制好后，所述的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的终浓度均为200 μ M，引物FIP、BIP、F3、B3的 终浓度均为0. 2mM,环引物Loop F.LoopB的终浓度为0. 8 μ M，甜菜碱的终浓度均为10 μ Μ,MgSO4的终浓度为10mM。进一步的，所述的SYBR green I显色液为1 10倍稀释液。进一步的，卫氏并殖吸虫DNA阳性对照液的浓度为32. 0-45. Ong/ μ L。进一步的，所述的Bst大片段聚合酶的浓度为SU/μ L。实施例2本发明的一个优选的试剂盒试剂盒内含DNA裂解液，其中含Nuclei lysis solution (终浓度7-10 μ Μ)、 EDTA(终浓度 0. 5Μ)、蛋白酶 Κ(终浓度 18-20mM)和 RNase A solution (终浓度 3-5 μ Μ)； LAMP反应液100个反应(25 μ L/反应)是终浓度为200 μ M的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，终 浓度为 0. 2mM 的引物 FIP、BIP、F3、B3，0. 8 μ M 环引物 Loop F、LoopB, 10 μ M 的 betaine、终 浓度为IOmM的MgSO4的混合溶液；1 10倍SYBRgreen I显色液；25 μ L Bst DNA聚合酶 (8U/ μ L)；卫氏并殖吸虫DNA阳性对照。检测卫氏并殖吸虫成虫、囊蚴、虫卵的特异性检测引物见下表。
权利要求
一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，其特征在于包括DNA裂解液、LAMP反应液、SYBR green I显色液和卫氏并殖吸虫DNA阳性对照液。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，其特征在于还包括 Bst大片段聚合酶。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，其特征在于所述的 DNA裂解液由细胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液四个试剂配制而成，配制好后， 在所述的DNA裂解液中，所述的细胞裂解液的终浓度为7-10 μ Μ,所述的EDTA的终浓度为 0. 5Μ，所述的蛋白酶K的终浓度为18-20mM，所述的RNase A溶液的终浓度为3_5 μ Μ。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，其特征在于所述的 LAMP反应液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜碱、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、环引 物Loop F、环引物LoopB和MgSO4溶液十二个试剂配制组成，所述的引物FIP的序列如SEQ ID No 1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No 2所示，所述的引物F3的序列如SEQ ID No 3所示，所述的引物B3的序列如SEQ ID No 4所示，所述的环引物LoopF的序列如 SEQ IDNo :5所示，所述的环引物LoopB的序列如SEQ ID No :6所示，配制好后，所述的dATP、 dTTP、dGTP和dCTP的终浓度均为200 μ M，引物FIP、BIP、F3、B3的终浓度均为0. 2mM，环引 物Loop F、LoopB的终浓度均为0. 8 μ Μ，甜菜碱的终浓度为10 μ M5MgSO4的终浓度为10mM。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，其特征在于所述的 SYBR green I显色液为1 10倍稀释液。
6.根据权利要求1或2所述的一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，其特征在于卫 氏并殖吸虫DNA阳性对照液的浓度为32. 0-45. Ong/ μ L。
7.根据权利要求2所述的一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，其特征在于所述的 Bst大片段聚合酶的浓度为8U/ μ L0
8.一种快速检测卫氏并殖吸虫的方法，其特征在于包括如下步骤(1)对被检测的成虫、囊蚴、虫卵的DNA进行提取；(2)采用恒温加热器技术，利用LAMP反应液进行扩增，；(3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察；(4)扩增产物经SYBRgreen I显色液显色后，在凝胶成像系统下观察。
9.根据权利要求8所述的一种快速检测卫氏并殖吸虫的方法，其特征在于所述步骤 (2)中，采用恒温加热器技术扩增条件为在55-65°C恒温下反应40-50分钟。
10.根据权利要求8所述的一种快速检测卫氏并殖吸虫的方法，其特征在于所述的 LAMP反应液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜碱、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、环引 物Loop F、环引物LoopB和MgSO4溶液十二个试剂配制组成，所述的引物FIP的序列如SEQ ID No 1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No 2所示，所述的引物F3的序列如SEQ ID No 3所示，所述的引物B3的序列如SEQ ID No 4所示，所述的环引物LoopF的序列如 SEQ IDNo :5所示，所述的环引物LoopB的序列如SEQ ID No :6所示，配制好后，所述的dATP、 dTTP、dGTP、dCTP的终浓度均为200 μ M，引物FIP、BIP、F3、B3的终浓度均为0. 2mM，环引物 Loop F、LoopB的终浓度均为0. 8 μ Μ，甜菜碱的终浓度为10 μ M5MgSO4的终浓度为IOmM的。全文摘要
本发明一种快速检测卫氏并殖吸虫的试剂盒，包括DNA裂解液、LAMP反应液、SYBR green I显色液和卫氏并殖吸虫DNA阳性对照，DNA裂解液由细胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液四个试剂配制而成；LAMP反应液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜碱、引物FIP、BIP、F3、B3、环引物Loop F、环引物LoopB和MgSO4溶液十二个试剂配制而成。本发明还提供了一种快速检测卫氏并殖吸虫的方法。本发明是一种采用环介导等温扩增技术快速检测卫氏并殖吸虫成虫的方法，可准确地鉴定卫氏并殖吸虫成虫、囊蚴、虫卵。本发明操作简单，方法特异性强，敏感性高，结果客观。
文档编号G01N21/64GK101956013SQ201010298790
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者张仁利, 张永年, 朱兴全, 李鑫, 艾琳, 陈家旭, 陈木新, 陈韶红 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所