专利名称：用叶表皮细胞死亡率鉴定黄瓜耐盐潜力的方法
技术领域：
本发明属于生物技术的植物检测，是一种用叶表皮细胞死亡率鉴定黄瓜耐盐潜力 的方法。
背景技术：
黄瓜别名王瓜、胡瓜，葫芦科甜瓜属一年生攀援性草本植物。黄瓜是我国种植范围 最广，设施栽培面积最大的蔬菜作物之一，在农业生产中具有重要的经济价值。随着设施栽 培土壤盐渍化的日益加重，给黄瓜的周年生产带来巨大损失。因此，寻找简单易行的方法， 尤其是早期能进行植物耐盐性筛选的方法，以期加速黄瓜的耐盐育种进程。盐胁迫影响了植物不同水平组织结构的生理过程，包括植物器官、组织、细胞等。 植物对盐胁迫的耐受是许多机制共同作用的结果，而且由于植物耐盐的生理和组织结构不 同，因此利用何种方法鉴定耐盐植物十分困难。目前，植物耐盐性的鉴定方法众说不一，归 纳起来可分为直接鉴定法和间接鉴定法。直接鉴定是对植物在盐渍条件下所受的直接伤害 程度进行耐盐性评价，主要有发芽率、死亡率、田间存活指数、产量和盐害指标等。间接鉴定 是是用生理生化分析手段研究作物在盐渍条件下生理代谢过程中的物质变化而进行的耐 盐性评价。主要的生理生化指标有脯氨酸、细胞质膜透性、叶绿素、酶活性、植物体内K+/ Na+等等。以上这些方法均存在操作步骤繁杂、对仪器的要求高、鉴定时间长等缺点，且难以 用于植物发育早期的鉴定。对研究者来说，寻找简单、便捷且高效的鉴定方法，已成为耐盐 育种中的瓶颈问题。我们通过对叶表皮细胞死亡率鉴定黄瓜耐盐潜力，以染料中性红为指 示剂，对黄瓜的叶表皮细胞进行染色，再放到盐溶液中，黄瓜的叶表皮细胞在高盐环境中， 发生质壁分离，不同耐盐能力的细胞发生质壁分离的程度不同，质壁分离程度大的不能恢 复，即死亡。通过细胞着色数目不同，从而判断耐盐能力不同的黄瓜品种。此方法操作简单， 只需一台光学显微镜即可。在20-30min就可完成鉴定，省时省工。在高渗环境中，植物细胞由于液泡失水而使原生质层与细胞壁分离的现象，叫做 质壁分离。质壁分离是植物生活细胞所具有的一种特性。可以用来区别细胞的死活，也可用 来测定细胞液的渗透压，以及原生质的透性、弹性、粘滞性等。造成质壁分离的原因是当外 界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分会由细胞液中渗出到外界溶液中， 通过渗透作用失水。由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层 性较大，从而使二者分开；反之，外界溶液浓度小于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水， 分离后的质和壁又复原。对黄瓜而言，盐胁迫首先是通过渗透势的改变引起细胞内容物的外流，出现质壁 分离现象。在相同的盐胁迫环境中，耐盐基因型的质壁分离情况和不耐盐的基因型应该有 明显的区别。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种叶表皮细胞死亡率鉴定黄瓜耐盐潜力的 方法。只需20-30分钟就能准确判断基因型的耐盐潜力，省工省时，工作效率高。本发明的技术方案是一种叶表皮细胞死亡率鉴定黄瓜耐盐潜力的方法1)以对植物无毒的活体染料中性红(3-氨基-6甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐，分子 SC15H16N4 · HCl)为指示剂，对黄瓜植株的叶表皮细胞进行染色，活细胞的液泡被染成樱桃 红色，原生质层和细胞壁一般不着色；死细胞由于液泡已消失因而不产生液泡着色现象。2)耐盐能力不同的黄瓜基因型，其叶表皮细胞在盐溶液中的死亡率有很大的差 异；在高盐溶液中处理一定的时间，叶表皮细胞的死亡率，能快速准确地反映基因型的耐盐 能力。细胞死亡率高的耐盐能力低，细胞死亡率低的耐盐能力高。所述的用叶表皮细胞死亡率快速鉴定黄瓜耐盐植株方法，其特征在于选择对植 物无害的中性红染料，染液浓度以0. 03%为宜，染色时间8-10分钟；叶表皮厚度应均勻一 致，否则影响染色效果。所述的用叶表皮细胞死亡率快速鉴定黄瓜耐盐植株方法高盐溶液中处理选择 化学纯的NaCl，溶液浓度一般以3M为宜，处理时间10-15分钟；黄瓜叶表皮细胞对盐胁迫 的灵敏度在基因型间有明显差异。本发明效果是利用叶表皮细胞死亡率鉴定技术，只需20-30分钟就能准确判断基因型的耐盐潜 力，省工省时，提高了工作效率，具有非常广阔的应用前景。对其他植物耐盐潜力的快速鉴 定具有重要参考价值。本发明具有以下优点和特点1.该技术体系以植物细胞的质壁分离 现象和中性红染料的着色原理为依据，只需少量的黄瓜叶片表皮细胞，就能迅速地鉴定出 植株的耐盐能力，具有效率高、重复性好、费用低廉等优点。2.根据叶表皮细胞死亡率试验 淘汰大量不耐盐的基因型，可以有效地压缩田间试验的规模，节约时间和人力，大幅度提高 优良耐盐基因型的筛选效率，加速耐盐植物育种的步伐。
图1. 1 0. 3% NaCl对津春5生长的影响图1. 2 0. 3% NaCl对津优1生长的影响图2. 1津春5叶表皮细胞经3. OM NaCL处理后叶表皮细胞染色图2. 2津优1叶表皮细胞经4. OM NaCL处理后叶表皮细胞染色叶表皮细胞死亡率试验的结果表明，在3M NaCl溶液中放置10-15分钟，耐盐品种 津春5的叶表皮细胞的死亡率，比盐敏感津优1的叶表皮细胞死亡率低很多。津优1表皮 细胞大部分丧失活力。说明黄瓜植株的耐盐能力和叶表皮细胞的耐盐能力高度相关，用3M NaCl溶液进行处理，通过统计叶表皮细胞死亡率，能快速、准确地筛选出耐盐的黄瓜植株。
具体实施例方式针对传统技术鉴定植物耐盐潜力所需时间长、所需材料多、工作效率低的问题，发 明人进行了大量的研究工作，最终建立了利用叶表皮细胞死亡率技术快速鉴定黄瓜耐盐潜力的新方法。以叶表皮细胞的死亡率为依据，可以快速、准确地确定不同基因型的耐盐潜 力，从而筛选耐盐潜力高的优良基因型，在短时间内淘汰大量的无用材料，进而选育出耐盐 的优良黄瓜新品种。本发明旨在提供一种科学高效的耐盐快速鉴定方法，通过该方法淘汰大量不耐盐 的基因型，实现耐盐基因和高产优质基因的结合，加速耐盐黄瓜新品种的选育。本发明的目的通过如下的技术方案来实现黄瓜叶片表皮细胞染色技术的研究中性红(3-氨基-6甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐，分子式C15H16N4 · HCl)是对植物 无害的常用活体染料之一，，用其染色不会影响细胞的生命活动以直引起细胞死亡，它是一 种弱碱性PH指示剂，变色范围在pH6. 4 8. 0之间(由红变黄)。它在酸性及中性范围内 解离度很强，带色的阳离子呈樱桃红色，在pH7以上时，它不解离而以分子态溶解于水，呈 黄色的溶液。当介质呈微碱性时，中性红分子的解离作用很弱，主要以分子状态存在，不易 被细胞壁吸附，但较易透过质膜和液泡膜进入液泡。由于液泡内溶液呈酸性，因此中性红在 液泡中发生解离，将液泡染成红色，此时细胞质和细胞壁不显色。死细胞的液泡已消失因而 不产生液泡着色现象。把经过中性红染色的黄瓜叶表皮放在盐溶液中，经过一段时间后，原生质出现明 显的质壁分离现象。随着盐浓度的提高或盐溶液浸泡时间的延长，液泡浓缩成圆球状。当 盐浓度过高或者在盐溶液中浸泡时间过长时，细胞膜破损，细胞内外成一体，染色浅，观察 不到红色球团。在盖玻片滴加一滴清水，清水能使浓缩成成团状的细胞质重新膨大。质壁 分离复原后的细胞呈粉红色，不能复原的细胞不着色。黄瓜叶表皮细胞质壁分离临界盐浓度的确定把从叶片上剥离下来的叶表皮放在0. 03%中性红溶液中染色10分钟，使细胞质 完全着色，然后把染色后的细胞放到1. 0M,2. 0M,3. OM和4. OM的NaCl溶液中处理10-15分 钟，然后把染色后的表皮放在在15X10倍的光学显微镜下观察。IM NaCl溶液处理的表皮 细胞质壁分离程度较轻；盐浓度越高，相同处理时间内的细胞质壁分离程度程度越严重。死 亡细胞因膜丧失选择透性而无法被中性红染色，耐盐品种的表皮细胞死亡率明显较低。3M NaCl处理时，津优1比津春5细胞死亡率明显增加，而且对时间长短的灵敏性较低，可重复 性较好。因此，我们把3M作为NaCl胁迫的临界盐浓度。叶表皮细胞死亡率与耐盐性的相关性研究叶表皮细胞死亡率试验的结果表明，在3M NaCl溶液中放置10-15分钟，耐盐品种 津春5的叶表皮细胞出现明显的质壁分离现象，盐胁迫引起的细胞死亡率在50%以内；津 优1的叶表皮细胞大部分丧失活力，死亡率达到85%以上。说明黄瓜植株的耐盐能力和叶 表皮细胞的耐盐能力相关，用3M NaCl溶液进行叶表皮细胞死亡率试验，能快速、准确地筛 选出耐盐的黄瓜植株。施例1津春5和津优1是天津科润黄瓜所育成的品种，津春5耐盐能力强，津优1是盐敏 感品种。通过水培实验进一步鉴定津春5和津优1的耐盐性。当第1片真叶展开后，分别 挑选津春5和津优1生长一致的幼苗移入l/aioagland营养液中，预培养3d后，在营养液 中添加分析纯NaCl，使营养液中NaCl浓度分别达到0(为对照，CK)和0. 3%，观察生长情况。结果表明津优1的耐盐性较差，津春5具有较强的耐盐性。(图1. 1，图1. 2)。
选取黄瓜幼苗的第一片真叶，把从叶片上剥离下来的叶表皮放在0. 03%中性红溶 液中染色10分钟，然后置于浓度分别为3M的NaCl溶液中处理10分钟，然后把染色后的表 皮放在10倍和40倍的光学显微镜下观察。结果表明叶表皮细胞死亡率试验在3M NaCl溶 液能够把耐盐基因型鉴别出来。
权利要求
1.一种用叶表皮细胞死亡率鉴定黄瓜耐盐潜力的方法，其特征在于1)以对植物无毒的活体染料中性红(3-氨基-6甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐，分子式 C15H16N4 · HCl)为指示剂，对黄瓜植株的叶表皮细胞进行染色，活细胞的液泡被染成樱桃红 色；死细胞由于质膜破裂，胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。2)耐盐能力不同的黄瓜基因型，其叶表皮细胞在盐溶液中的死亡率有很大的差异；在 高盐溶液中处理一定的时间，叶表皮细胞的死亡率能快速准确地反映基因型的耐盐能力 细胞死亡率高的耐盐能力低，细胞死亡率低的耐盐能力高。
2.根据权利要求1所述的用叶表皮细胞死亡率快速鉴定黄瓜耐盐植株方法，其特征在 于选择对植物无害的中性红染料，染液浓度以0. 03%为宜，染色时间8-10分钟；叶表皮厚 度应均勻一致，否则影响染色效果。
3.根据权利要求1所述的用叶表皮细胞死亡率快速鉴定黄瓜耐盐植株方法，其特征在 于高盐溶液中处理选择化学纯的NaCl，溶液浓度一般以3M为宜，处理时间10-15分钟； 黄瓜叶表皮细胞对盐胁迫的灵敏度在基因型间有明显差异。
全文摘要
一种用叶表皮细胞死亡率鉴定黄瓜耐盐潜力的方法。以对植物无毒的活体染料中性红(3-氨基-6甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐，分子式C15H16N4·HCl)为指示剂，首先对黄瓜的叶表皮细胞进行染色，再在高盐溶液中处理一定的时间，根据活细胞数目不同，从而判断耐盐能力不同的黄瓜基因型。叶表皮细胞的死亡率，能快速准确地反映不同基因型的耐盐能力。利用此技术，只需20-30分钟就能准确判断基因型的耐盐潜力，省工省时，提高了工作效率，具有广阔的应用前景。
文档编号G01N1/30GK102043041SQ201010515838
公开日2011年5月4日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者刘仲齐, 张越, 聂莉莉 申请人:天津市农业生物技术研究中心