专利名称：一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的hplc测定方法
技术领域：
本发明涉及药学领域中质量控制的运用方法，尤其涉及一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法。
背景技术：
在驴胶补血制剂的处方中，阿胶是君药，所占的比例最大，是中国传统的补血药， 其中阿胶中的蛋白质和氨基酸是其补益药效的营养物质基础。在中药部颁标准中，驴胶补血颗粒检查项中有针对阿胶的总氮量的检查。总氮量的测定方法只能粗略地反映样品中含氮的化合物的量，不能很好地反映阿胶中蛋白质和氨基酸的情况。现有文献中，也仅有记载高效液相色谱_蒸发光散射法测定驴胶补血颗粒中黄芪甲苷的含量、高效液相色谱法测定驴胶补血颗粒中阿魏酸含量、驴胶补血颗粒中微量铁的含量测定”，也并没有记载对氨基酸的含量测定。尽管2010版药典中收载了阿胶原料氨基酸的含量测定，但仅限于单方药材，而且样品的处理方法较复杂，只测定了其中L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸4种氨基酸的含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法，其主要包含步骤1)将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，加入5-7mol/l(最佳为6mol/l)盐酸， 130°C -160°C (最佳为150°C )水解，将水解后的溶液移入蒸发皿中，用水洗涤，将洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0. lmol/L盐酸溶液溶解，转移至量瓶中，加入0. 05-0. 15mol/ L(最佳为0. lmol/L)盐酸溶液稀释，摇勻、离心后取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液；幻取6种氨基酸对照品L_谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和 L-脯氨酸，将以上6种氨基酸对照品加入0. lmol/L盐酸溶液溶解，制得氨基酸混合标准品溶液；3)将步骤1)所述驴胶补血制剂待测品溶液和步骤2)所述基酸混合标准品溶液分别加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液中，混勻、静置后分别加入正己烷，再次混勻、静置后分别取其下层溶液，进行过滤，得衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液；4)吸取步骤幻获得的衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液注入液相色谱仪，进行驴胶补血制剂中氨基酸的测定，其中，色谱条件为填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈与醋酸钠、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾三种中的任意一种或两种的组合，流动相B为乙腈-水，检测波长为2Mnm，流速为1. Oml · mirf1，柱
权利要求
1. 一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法，其特征在于，包含步骤1)将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，加入5-7mol/l盐酸，1300C_160°C水解，将水解后的溶液移入蒸发皿中，用水洗涤，将洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0. lmol/L盐酸溶液溶解，转移至量瓶中，加入0. 05-0. 15mol/L盐酸溶液稀释，摇勻、离心后取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液；2)取6种氨基酸对照品L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和 L-脯氨酸，将以上6种氨基酸对照品加入0. lmol/L盐酸溶液溶解，制得氨基酸混合标准品溶液；3)将步骤1)所述驴胶补血制剂待测品溶液和步骤幻所述基酸混合标准品溶液分别加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液中，混勻、静置后分别加入正己烷，再次混勻、静置后分别取其下层溶液，进行过滤，得衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液；4)吸取步骤幻获得的衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液注入液相色谱仪，进行驴胶补血制剂中氨基酸的测定，其中，色谱条件为填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈与醋酸钠、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾三种中的任意一种或两种的组合，流动相B为乙腈-水，检测波长为2Mnm，流速为1. Oml · mirT1，柱温为30°C，按下表中的梯度进行洗脱
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，精密称定，加入5-7mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30分钟使其溶解，130°C -160°C水解，放冷，移入蒸发皿中，用IOml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0. lmol/L盐酸溶液溶解，转移至量瓶中，加入0. 05-0. 15mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇勻，离心后取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为将驴胶补血制剂样品置安瓿瓶中，精密称定，加入6mol/l盐酸5ml，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30分钟使其溶解， 150°C水解1小时，放冷，移入蒸发皿中，用IOml水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干，残渣加入0. lmol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，加入0. lmol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇勻，3000r/min离心5分钟取上清液即得驴胶补血制剂待测品溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤幻具体为取6种氨基酸对照品 L-谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸，将以上6种氨基酸对照品加入0. lmol/L盐酸溶液溶解制成每Iml分别含L-谷氨酸73. 1μ g、L-羟脯氨酸86. 4μ g、 甘氨酸0. 1609mg、L-丙氨酸64. 8 μ g、L-精氨酸59. 3 μ g、L-脯氨酸93. 9 μ g的混合溶液， 即得氨基酸混合标准品。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤幻具体为将步骤1)所述驴胶补血制剂待测品溶液和步骤2、所述基酸混合标准品溶液分别置IOml离心管中，加入0. lmol/L 异硫氰酸苯酯-乙腈溶液1. 0ml, lmol/L三乙胺-乙腈溶液1. 0ml，漩涡混合1分钟，室温放置1小时后，加入細1正己烷，振摇，漩涡混合1分钟后，放置10分钟，取下层溶液，微孔滤膜滤过，即得衍生化的标准品溶液和衍生化的待测品溶液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，流动相A是乙腈-醋酸钠。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)中，流动相A中，醋酸钠的浓度为 0.lmol/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，流动相A中，乙腈与0.lmol/L醋酸钠的比例为3 97。
9.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，流动相B中，乙腈与水的比例为4 1。
全文摘要
本发明涉及一种同时测定驴胶补血制剂中六种氨基酸含量的HPLC测定方法，其包含步骤提供驴胶补血制剂样品；提供氨基酸标准品；将驴胶补血制剂样品和氨基酸标准品分别加入异硫氰酸苯酯-乙腈溶液中，混匀静置后分别加入正己烷，再次混匀静置后分别取其下层溶液，过滤得衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液；吸取衍生化后的驴胶补血制剂样品溶液和衍生化后的氨基酸标准品溶液注入液相色谱仪，进行氨基酸的测定。本发明通过采用反相高效液相测定了驴胶补血制剂中6种主要氨基酸的含量，样品处理方法较简单，测试方法的专属性、重复性、准确度都较好，能很好地控制驴胶补血颗粒的内在质量。
文档编号G01N30/06GK102406749SQ20101055545
公开日2012年4月11日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者张妮瑜, 朱丽, 欧金秀, 王威, 王实强, 谷陟欣 申请人:九芝堂股份有限公司