专利名称：一种用于快速检测农产品、食品中真菌毒素的蛋白芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片技术领域，主要涉及一种用于快速检测农产品、食品中真菌 毒素的蛋白芯片及其制备方法。
背景技术：
我国是农产品生产和消费大国，农产品中真菌素素的检测直接关系到我国农产品 生产、出口和居民食品消费安全。真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，通常存在于霉变的 谷物中，一旦通过食物链进入人体后，将可能造成致畸、致突变和致癌等严重危害，由于真 菌的寄生和真菌毒素的产生，严重影响农作物的产量，降低农产品和饲料品质，造成巨大经 济损失。因此在全球食品安全问题中备受关注。目前，食品安全问题已成为国家关注的重 点内容之一，并连续启动了无公害农产品及食品中各种有害物质的快速检测技术及产品成 为一项重要的需求。生物芯片技术迅速成为目前生命科学研究领域发展最快的技术之一。生物芯片有 两种主要类型基因芯片和蛋白芯片。蛋白质芯片(proteinchip)是继基因芯片之后又一 对人类健康具有重大应用价值的生物芯片。蛋白质芯片由固定于不同支持介质上的抗原或 抗体微阵列组成，阵列中固定分子的位置及组成是已知的，用标记(荧光物质、酶或化学发 光物质等)的抗体或抗原与芯片上的探针进行反应，然后通过特定的扫描装置进行检测， 结果由计算机分析处理。蛋白质芯片的应用领域包括蛋白质表达的检测；蛋白质一蛋白质、 蛋白质一 DNA和蛋白质一小分子等之间相互作用的鉴定；抗体的鉴定。这种新技术使得研 究人员可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度。蛋白质芯片与传 统的研究方法相比其优越性主要体现在高通量、高灵敏度和高准确性。现有的蛋白芯片主 要应用于医学领域，在农产品检验领域的应用研究尚处于空白状态。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于解决现有技术所用的蛋白芯片存在 特异性弱、灵敏度低、应用范围窄、操作复杂的缺点，提供一种结构简单、操作方便、价格便 宜、检测分析过程连续化、集成化、微型化、高通量的用于快速检测农产品、食品中真菌毒素 的蛋白芯片；本发明的另一目的是提供一种上述蛋白芯片的制备方法。为实现上述目的，本发明一种用于快速检测农产品、食品中真菌毒素的蛋白芯片， 包括芯片、真菌毒素人工抗原、抗真菌毒素单克隆抗体、荧光标记二抗，其中，真菌毒素人工 抗原按照微阵列点在固相载体上。进一步，所述抗真菌毒素单克隆抗体用稀释液稀释为浓度0. 3-0. 9μ g/ml。进一步，所述稀释液为0. Olmol的PBS溶液，其PH为7. 4。进一步，所述固相载体上所要点制的所述真菌毒素人工抗原溶于CBS缓冲液中， 然后用芯片自动点样系统将这些蛋白质点样在固相载体上，点样密度为16点/cm2，点样量为50nl/点。进一步，所述固相载体为表面醛基化的玻片。一种上述蛋白芯片的制备方法，具体为1)利用芯片点样仪将缓冲液稀释的抗原液和空白稀释液按微阵列点于芯片上；2)点样干燥后的芯片置于BSA溶液中封闭，之后用PBST清洗；3)选定其中设定个数微矩阵，在每个微矩阵中分别加入PBS溶液稀释的桔青霉 素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素Bl标准品混合液，另外的亚微阵列中，各加入提前处 理好的饲料阴性样品稀释液和分别添加不同浓度的三种真菌毒素样品混合稀释液；将抗桔 青霉素抗体、抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体、抗伏马菌素Bl抗体用PBS进行稀释，并将抗体稀 释混合液加入到每个亚芯片中进行反应；4)将荧光标记的二抗加入芯片的每个亚矩阵中进行避光孵育，之后用PBST避光 清洗；5)芯片荧光扫描仪读取信号，采用PerkinElmer荧光扫描显微镜对采集图象进行 数据处理，以结合率为纵坐标、桔青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素标准品浓度为横 坐标，采用RIDAWIN软件分别绘制竞争抑制曲线，利用所得回归方程计算三种真菌毒素结 合率为50%时的浓度；6)根据竞争抑制曲线计算样品中真菌毒素的含量将测得样品的荧光值代入竞 争抑制曲线即的样品中的添加浓度或样品中所含真菌毒素的含量。进一步，所述步骤1)中缓冲液稀释为0. 05mol PH9. 6的CBS缓冲液稀释，所述芯 片上共设置有12个微矩阵，每个微矩阵点16个点，点样量为50nl/点，常温过夜固定；其中 前三排分别为桔青霉素抗原、脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原、伏马菌素Bl抗原，最后一排为空 白稀释液。进一步，所述步骤2)中BSA溶液浓度为3%，在BSA溶液中封闭时间为30min，PBST 溶液浓度为0. 1 %，用其洗三次，每次5min。进一步，所述步骤3)中所述抗桔青霉素抗体、抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体、抗伏 马菌素Bl抗体用0. Olmol PH7. 4的PBS进行稀释，并取25 μ L抗体稀释混合液加入到每个 亚芯片中，37°C反应30min，并用0. Olmol PH7. 4 PBST洗液冲洗3次，每次5min。进一步，所述步骤4)中的二抗用0. Olmol, PH7. 4的PBS稀释。本发明采用微阵列技术，将预先制备的几种待检测目的真菌毒素抗原以矩阵形式 固定于固相载体上，采用竞争法原理检测样品中真菌毒素含量，通过荧光扫面显微镜识别、 阅读和判定结果，具有检测分析过程连续化、集成化、微型化、高通量和快速检测等功能。
附图1为本发明蛋白芯片中包被桔青霉素抗原浓度在0. 35 μ g/ml通过RIDAWIN 软件分析不同浓度真菌毒素标准品和荧光值之间的拟合曲线；附图2为为本发明蛋白芯片中包被脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原浓度在0. 8 μ g/ml通 过RIDAWIN软件分析不同浓度真菌毒素标准品和荧光值之间的拟合曲线；附图3为本发明蛋白芯片中包被伏马菌素抗原浓度在0. 6 μ g/ml通过RIDAWIN软 件分析不同浓度真菌毒素标准品和荧光值之间的拟合曲线；
附图4为三种真菌毒素同时检测的微阵列点样图。
具体实施例方式下面实施例进一步说明本发明，但所述实施例仅用于描述本发明的内容而不限制 本发明。如图1至图4所示，本发明一种用于快速检测食品、农副产品中真菌毒素的蛋白芯 片包括芯片、真菌毒素人工抗原、抗真菌毒素单克隆抗体、荧光标记二抗，其中，真菌毒素人 工抗原按照微阵列点在固相载体上。本发明采用微阵列技术，将预先制备的几种待检测目的真菌毒素抗原以矩阵形式 固定于固相载体上，采用竞争法原理检测样品中真菌毒素含量，通过荧光扫面显微镜识别、 阅读和判定结果。本发明采用竞争法的原理采用免疫竞争法检测多种真菌毒素，其工作原理是利 用样品中污染的真菌毒素与固定在载体上的真菌毒素抗原共同对抗体进行竞争免疫反应， 在加入荧光标记二抗可以定量分析样品中真菌毒素的含量。在抗真菌毒素抗体的量一定 时，固定在基片上的真菌毒素和被测真菌毒素与其抗体的结合的量取决于二者浓度比，被 测的真菌毒素印制固定在基片上的真菌毒素抗原与抗体的结合，二抗标记荧光，通过荧光 扫描显微镜获得相应的荧光值，也就是荧光值越高则待测样品中真菌毒素的含量就越低。 反之，则越高。以下为本发明的应用指标稳定性芯片和试剂的保存时间大于6个月回收率85%-96%特异性无任何交叉反应精密性CV<10%1.样品前处理方法(1)添加桔青霉素样品处理方法①称取饲料4份，每份2g，一份做为阴性，另外三份分别添加lOng/mlUOOng/ml、 300ng/ml桔青霉素标准品。②每份样品中加入IOml含10%的甲醇PBS(0. Olmol PH7. 4)，振荡30分钟。③振荡之后，1500g离心20分钟。④离心之后取上清，上清用PBS(0.02mol PH7. 4) 1 4稀释。稀释之后即可用于检测。(2)添加脱氧雪腐镰刀菌烯醇样品处理方法①称取饲料4份，每份2g，一份做为阴性，另外三份分别添加lOng/mlUOOng/ml、 300ng/ml脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品。②每份样品中加入IOml水，振荡3分钟。③振荡之后，1500g离心20分钟。④离心之后取上清，上清用PBS(0.02mol PH7. 4) 1 4稀释。稀释之后即可用于 检测。(3)添加伏马菌素Bl样品处理方法
①称取饲料4份，每份2g，一份做为阴性，另外三份分别添加lOng/mlUOOng/ml、 300ng/ml伏马菌素标准品。②每份样品中加入IOml含70%的甲醇氯化钠溶液，振荡30分钟。氯化钠的浓度 为 0. lg/ml。③振荡之后，1500g离心20分钟。④离心之后取上清，上清用PBS(0.02mol PH7. 4) 1 4稀释。稀释之后即可用于 检测。2.蛋白芯片的制备①利用芯片点样仪将0. 05mol PH9. 6的CBS缓冲液稀释的抗原液和空白稀释液按 微阵列点于芯片上，共12个微矩阵，每个微矩阵点16个点。即为4排，每排4个点，点样量 为50nl/点，常温过夜固定。其中前三排分别为桔青霉素抗原、脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原、 伏马菌素Bl抗原，最后一排为空白稀释液。②点样干燥后的芯片置于3%的BSA溶液中封闭30min，之后用0. 的PBST洗三 次，每次5min。③选定其中6个微矩阵，在每个微矩阵中分别加入25 μ L 0. 02molPH7. 4的PBS溶 液稀释的桔青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素Bl标准品混合液(0/0/0，10/10/1. 9， 30/30/7. 6，90/90/31，270/270/62，810/810/125ng/ml)，另外六个亚微阵列，各加入 25 μ L 提前处理好的饲料阴性样品稀释液和分别添加不同浓度的三种真菌毒素样品混合稀释液。 将抗桔青霉素抗体、抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体、抗伏马菌素Bl抗体用0. Olmol ΡΗ7. 4 的PBS进行稀释，取25 μ L抗体稀释混合液加入到每个亚芯片中，37 °C反应30min，用 0. 01molPH7. 4PBST 洗液冲洗 3 次，每次 5min，④将荧光标记的二抗用0. Olmol PH7. 4的PBS稀释为0. lmg/ml，加入芯片的每个 亚矩阵中，每个亚矩阵50 μ L。37°C，避光孵育30min。之后用0. 1 %的PBST避光洗三次，每 次 5min。⑤芯片荧光扫描仪读取信号，采用PerkinElmer荧光扫描显微镜对采集图象进行 数据处理，以结合率(％)为纵坐标、桔青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素标准品浓度 为横坐标，采用RIDAWIN软件分别绘制竞争抑制曲线，利用所得回归方程计算三种真菌毒 素结合率为50%时的浓度(IC50)。⑥根据竞争抑制曲线计算样品中真菌毒素的含量将测得样品的荧光值代入竞争 抑制曲线即得样品中的添加浓度或样品中所含真菌毒素的含量。上述使用的溶液如下封闭液3%BSA溶液PBS缓冲液0. Olmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7. 4NaCl8. OgKCl0. 2gKH2PO40. 2gNa2HPO4 · 12H202. 9g双蒸水(ddH20)IOOOmL PBS缓冲液0. 02mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7. 4
NaCl8. 5g
Na2HPO4 · 12H205. 16g
NaH2PO4 · 2H200. 87g
双蒸水(ddH20)IOOOmL
CBS缓冲液0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9. 6
Na2CO3IOg
NaHCO3IOg
ddH20IOOOmL
PBST冲洗液1倍磷酉堯盐缓冲液，PH 7. 4
NaCl8. Og
KCl0. 2g
KH2PO40. 2g
Na2HPO412H202. 9g
吐温20ImL
NaN30. 2g
双蒸水(ddH20)IOOOmL
权利要求
1.一种用于快速检测农产品、食品中真菌毒素的蛋白芯片，其特征在于，该蛋白芯片包 括芯片、真菌毒素人工抗原、抗真菌毒素单克隆抗体、荧光标记二抗，真菌毒素人工抗原按 照微阵列点在固相载体上。
2.如权利要求1所述的用于快速检测农产品、食品中真菌毒素的蛋白芯片，其特征在 于，所述抗真菌毒素单克隆抗体用稀释液稀释为浓度0. 3-0. 9 μ g/ml。
3.如权利要求1所述的用于快速检测农产品、食品中真菌毒素的蛋白芯片，其特征在 于，所述稀释液为0. Olmol的PBS溶液，其PH为7. 4。
4.如权利要求1所述的用于快速检测农产品、食品中真菌毒素的蛋白芯片，其特征在 于，所述固相载体上所要点制的所述真菌毒素人工抗原溶于CBS缓冲液中，然后用芯片自 动点样系统将这些蛋白质点样在固相载体上，点样密度为16点/cm2，点样量为50nl/点。
5.如权利要求1所述的用于快速检测农产品、食品中真菌毒素的蛋白芯片，其特征在 于，所述固相载体为表面醛基化的玻片。
6.一种上述蛋白芯片的制备方法，其特征在于，该方法具体为1)利用芯片点样仪将缓冲液稀释的抗原液和空白稀释液按微阵列点于芯片上；2)点样干燥后的芯片置于BSA溶液中封闭，之后用PBST清洗；3)选定其中设定个数微矩阵，在每个微矩阵中分别加入PBS溶液稀释的桔青霉素、脱 氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马菌素Bl标准品混合液，另外的亚微阵列中，各加入提前处理好的 饲料阴性样品稀释液和分别添加不同浓度的三种真菌毒素样品混合稀释液；将抗桔青霉素 抗体、抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体、抗伏马菌素Bl抗体用PBS进行稀释，并将抗体稀释混合 液加入到每个亚芯片中进行反应；4)将荧光标记的二抗加入芯片的每个亚矩阵中进行避光孵育，之后用PBST避光清洗；5)芯片荧光扫描仪读取信号，采用PerkinElmer荧光扫描显微镜对采集图象进行数据 处理，以结合率为纵坐标、桔青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马菌素标准品浓度为横坐标， 采用RIDAWIN软件分别绘制竞争抑制曲线，利用所得回归方程计算三种真菌毒素结合率为 50%时的浓度；6)根据竞争抑制曲线计算样品中真菌毒素的含量将测得样品的荧光值代入竞争抑 制曲线即的样品中的添加浓度或样品中所含真菌毒素的含量。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中缓冲液稀释为0.05mol PH9. 6的CBS缓冲液稀释，所述芯片上共设置有12个微矩阵，每个微矩阵点16个点，点样量 为50nl/点，常温过夜固定；其中前三排分别为桔青霉素抗原、脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原、 伏马菌素Bl抗原，最后一排为空白稀释液。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤幻中BSA溶液浓度为3%，在 BSA溶液中封闭时间为30min，PBST溶液浓度为0. 1%，用其洗三次，每次5min。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤⑴中所述抗桔青霉素抗体、 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体、抗伏马菌素Bl抗体用0. Olmol PH7. 4的PBS进行稀释，并取 25 μ L抗体稀释混合液加入到每个亚芯片中，37°C反应30min，并用0. Olmol PH7. 4PBST洗 液冲洗3次，每次5min。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中的二抗用O.Olmol、 PH7. 4的PBS稀释。
全文摘要
本发明公开了一种用于快速检测农产品、食品中真菌毒素的蛋白芯片及其制备方法，该蛋白芯片包括芯片体、真菌毒素人工抗原、抗真菌毒素单克隆抗体、荧光标记二抗，真菌毒素人工抗原按照微阵列点在固相载体上。本发明采用微阵列技术，将预先制备的几种待检测目的真菌毒素抗原以矩阵形式固定于固相载体上，采用竞争法原理检测样品中真菌毒素含量，通过荧光扫面显微镜识别、阅读和判定结果，具有检测分析过程连续化、集成化、微型化、高通量和快速检测等功能。
文档编号G01N33/68GK102095873SQ20101057008
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月2日 优先权日2010年12月2日
发明者任香夫, 李娇, 田世民, 金涌 申请人:中国检验检疫科学研究院综合检测中心