专利名称：用延迟荧光光谱检测作物逆境生理与抗逆性鉴定的方法
技术领域：
本发明涉及光谱测试，尤其涉及一种用延迟荧光光谱检测作物逆境生理及抗逆性 鉴定的方法。
背景技术：
影响植物生长发育及农作物产量的逆境胁迫有很多，例如干旱、水涝、冷胁、热胁、 冻胁、盐胁、辐射、水污染、土壤污染、大气污染、农药、病虫害等。开展植物尤其是农作物逆 境生理检测及抗逆性鉴定技术的研究，对于准确判断作物的抗性大小，快速筛选抗性新品 种，进而实现作物品种改良，保障农作物高产稳产，确保农业可持续发展具有重要的理论意 义和应用价值。目前在植物逆境生理检测中应用得较广泛的主要有两种方法，一种为检测 光合能力大小的红外线气体分析法，另一种为检测荧光诱导动力学曲线参数的叶绿素荧光 分析法。除此而外，还有一些传统的逆境生理检测及抗性鉴定的理化分析方法。红外线气 体分析法是利用二氧化碳对红外线的吸收率检测红外光能量的被吸收量的多少来实现逆 境胁迫下光合能力检测的方法，由于其检测方法的特殊性，存在受外界环境因素影响大、测 量时间长等问题。而叶绿素荧光分析法是利用激光诱发荧光技术进行逆境下荧光参数检测 及分析的方法，虽然是现今用得最多的逆境生理检测法，但存在着信号微弱、参数混杂、参 数波动性较大(荧光参数易受外界环境与植物自身生理状况等因素的影响)等问题。传统 的理化分析方法也存在着实验周期长、实验步骤繁琐、工作量大、灵敏度不高等缺点。可见， 现有的进行植物逆境生理检测及抗逆性鉴定的方法都有着各自不同的缺点，因此在实际应 用中存在一些问题，不利于在农业生产中的推广和普及。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种操作简单、可控性 好、受外界环境因素影响小，可以准确侦断作物逆境胁迫损伤程度及抗逆性大小的方法。本发明的技术解决方案是这样实现的一种用延迟荧光光谱检测作物逆境生理与抗逆性鉴定的方法，其特征在于包括下 述步骤1. 1选择生长状态相似的作物和/或该作物叶片不同生长部位的若干组叶片，一 般为5 10组，每组选择5 8片相似的叶片进行逆境生理检测与抗逆性鉴定的样品；1. 2将整株作物和/或样品进行逆境胁迫处理；所述逆境胁迫系指对作物和/或 样品创造的诸如干旱、水涝、冷胁、热胁、冻胁、盐胁、辐射、水污染、土壤污染、大气污染等环 境因子；1. 3在室温下测量作物叶片的延迟荧光发射光谱，其工艺过程为1. 3. 1将作物叶片置于室温下具有磷光或延迟荧光检测功能的荧光光谱仪的样品 室中暗适应30min ；1. 3. 2光谱的激发光源选择波长为蓝光470 500nm与红光650 680nm范围，强度为 0 2500 μ mol · m2 · s-1；1. 3. 3激发光源均勻辐照叶片的时间为0 1min ；1. 3. 4停止激发到采集叶片延迟荧光光谱的间隔时间为0. 01 Is ；1. 3. 5延迟荧光光谱采集的接收波长范围为185 900nm，放大增益为IXlO8 ；1. 4对逆境胁迫条件下作物叶片的延迟荧光发射光谱进行分析，采用商用化 ORIGIN软件对所述光谱仪输出的数据进行分析，寻找发射光谱特征峰685nm和730nm附近 的最高峰值，分别记录为F685与F730，由此计算得到F730/F685 ；1. 5测量作物在不同逆境胁迫下的延迟荧光发射光谱峰值比F730/F685的值；1. 6将健康生长条件下作物的F730/F685值记录为最适宜比值F。p，逆境胁迫生理 条件下的F730/F685值记录为Fsteess ；1. 7比较F。p与Fstress的差异，对作物遭受逆境胁迫后光合功能的损伤状况进行判 断；1. 8比较不同作物在相同逆境胁迫下F。p与Fstress的差异，即可对不同作物的抗逆 性大小进行鉴定。本发明人的研究发现，植物叶片的延迟荧光发射光谱能有效地反映出逆境胁迫下 植物光合功能受到伤害的程度以及抗逆性的大小；在不同的胁迫环境下，延迟荧光发射光 谱发生明显改变，尤其是685nm与730nm附近的特征峰的最大峰值F685与F730 ；两个最 大峰值的比值F730/F685随胁迫情况的变化更为显著，且与净光合速率及叶绿素荧光参数 Fv/Fm有很好的正相关性；植物的净光合速率和叶绿素荧光参数Fv/Fm与植物生长发育的 环境有直接关系，是逆境胁迫下植物生理检测的有效表征。总的来说当植物生长在胁迫环 境中时，叶片的净光合速率和Fv/Fm要比最适宜生长环境中对应的值要低，且随着胁迫的 加深，降低的程度加剧，相应地，叶片的延迟荧光发射光谱特征峰值比F730/F685也随之降 低，其下降程度可以有效反应作物遭受逆境胁迫伤害的程度，通过分析不同作物在相同逆 境胁迫下特征峰值比F730/F685的变化差异，从而可以判定作物的抗逆性大小。室温下延迟荧光发射光谱的685nm附近特征峰被公认为来自于光系统II，而 730nm附近的特征峰被认为是光系统I与II共同贡献的结果，因此特征峰值比F730/F685 是植物叶片两大光系统光合效能的直观体现。它取决于植物的类型、生长发育状况、体内与 体外环境状况。在一致的测量条件(如激发波长、激发时间、激发光强度、测量时间长度、暗 室内温度)下，通过检测同品种、同生长发育状况的植物叶片在不同胁迫环境下的延迟荧 光发射光谱，计算其特征峰值比F730/F685，与健康环境下特征峰值比进行比较，可以准确 而有效地反应出植物的逆境生理状况及损伤程度，并可进行植物抗逆性大小的鉴定。与现有技术相比，本发明具有如下的优点及效果(1)由于植物的光合作用被认为是对逆境胁迫最敏感的生理过程，因此通过光合 作用或光合器官活性的检测是判定植物逆境生理的一个有效方法。在植物体内的两大光合 作用系统(光系统I与光系统II)遭受不同的逆境胁迫时会产生相应的变化，引起发射光 谱发生改变，尤其是延迟荧光光谱中来自于光系统II的685nm谱峰与光系统I(PSI)与光 系统II (PSII)共同作用产生的730nm谱峰的峰值强度发生了明显的变化，从而导致特征峰 值比F730/F685随着逆境胁迫的影响升高或降低。所以本发明方法通过测量植物延迟荧光 光谱特征峰值比F730/F685来检测逆境胁迫的损伤程度以及进行抗逆性鉴定具有直观、简单、有效的特点。(2)本发明方法是从检测植物受激后发出延迟荧光的光谱变化尤其是特征峰值比 变化的角度进行光合功能强弱的分析，是对植物体内光合能力大小的一种判断，这就避免 了传统方法易受外界环境干扰，参数波动性大等缺点。另一方面，对植物进行的光诱导是由 暗室内的激发光源产生，激发光源的强度可以调节，激发波长可以选择，且是在停止激发后 才进行延迟荧光光谱信息的采集，因此，本发明方法具有不受外界环境干扰、稳定、可控性 好、高信噪比、快速等优点。(3)本用延迟荧光光谱检测作物逆境生理及抗逆性鉴定的方法操作过程简单、容 易实现、参数直观。
本发明有附图4幅，其中图1为本发明的实施流程图。图2为利用本发明实现大豆与玉米样品在不同温度胁迫下的F730/F685值的统计表。图3为利用本发明方法实现温度胁迫下大豆作物光合功能损伤判断及抗逆性鉴定。图4为利用本发明方法实现温度胁迫下玉米作物光合功能损伤判断及抗逆性鉴定。
具体实施例方式如图1所示，一种用延迟荧光光谱检测作物逆境生理与抗逆性鉴定的方法，包括 选择生长状态相似的作物和/或该作物不同部位的若干组叶片作为进行逆境生理检测与 抗逆性鉴定的样品和将整株作物或叶片进行逆境胁迫处理的步骤，其特征在于还包括下述 步骤(1. 1)测量作物在不同逆境胁迫下的延迟荧光发射光谱峰值比F730/F685的值；(1. 2)比较健康生长条件与逆境胁迫条件下作物的F730/F685，对作物遭受逆境 胁迫后光合功能的损伤状况进行判断；(1. 3)通过对不同作物相同逆境胁迫后F730/F685的变化差异，判断作物的抗逆
性大小。下面结合附图，对其工艺过程进行具体描述图1为本发明方法检测作物逆境生理与抗逆性鉴定的流程图。根据图1，先对需要 鉴定的作物进行选取，目的在于对作物进行相似生长状态的逆境生理检测及抗逆性评价， 以保证鉴定结果的合理性；对生长状态相似的多株作物分别进行健康生长条件培养与逆境 (高温、低温、盐、大气污染、紫外辐射等)胁迫处理；将健康的或处理后的作物叶片置于具 有延迟荧光光谱检测功能的光谱仪中进行延迟荧光发射光谱采集；对延迟荧光发射光谱数 据用商用化ORIGIN软件进行特征峰值F685与F730的提取；计算特征峰值比F730/F685 ； 记作物在健康生理下的F730/F685为F。p，逆境生理下F730/F685的为Fsteess ；比较不同逆境 胁迫下同一作物的Fstass与F。p的差异，即可对作物在相应逆境下光合功能的受损程度进行检测分析；比较不同作物在相同逆境胁迫下Fstress与F。p的差异，即可对不同作物的抗逆性 大小进行判断鉴定。实施例1本实施例旨在对一种大豆品种和一种玉米品种在高温和低温胁迫下光合生理的 受损程度进行检测，并对这两个品种的抗逆性大小进行判断。实验选择京黄大豆品种(苗 期)与晋单36号玉米品种(苗期)，选取8组不同生长部位，每组5片相似生长状态的叶片 为样品。温度的处理范围为5 50°C，温度处理间隔为5°C。测量时，将活体作物置于设置 好胁迫温度(5 50V )的植物培养箱中适应2小时，植物培养箱保持自然光照，湿度保持 在75%。经不同温度处理后再将叶片置于具有磷光检测功能的商用化荧光-磷光光谱仪 LS55的暗室内暗适应10分钟(暗室内温度为室温25°C )，用波长为660nm的激发光源对 叶片进行光激发0. ^，延迟0. ^，接收延迟荧光光谱信号。将延迟荧光发射光谱数据传给 PC机，用商用化软件ORIGIN进行发射光谱分析，寻找发射光谱的685nm和730nm附近的两 个特征峰值值F685与F730，并计算F730/F685。分析数据时，计算玉米或大豆样品8组各 5片共40片叶片的延迟荧光发射光谱F730/F685的平均值和标准差，以平均值作为F730/ F685的数据点，而标准差作为数据的偏差，两种实验样品的F730/F685值与温度的变化如 统计表附图2和变化曲线图3，图4所示。对图2及图3的进一步分析可知京黄大豆样品的最适宜生长温度为25°C，F730/ F685为0. 67476，记为该作物的F。p。在大豆植株适宜的生长温度20 30°C范围内，20°C 时F730/F685值5优是0. 65062，降低为Fop的96. 4%。相应地，当温度为15°C时F15o降低 为F。p的92. 4%，表现出显著的低温损伤(*)，当温度低于15°C，10°C时的Fltrc降低为F。p的 吕^^，^降低为？㈤的？？^^，可见，样品出现了极显著低温损伤(**)。高温情况也有类 似的规律，相较于最适宜生长温度，30°C时的F3trc降低为F。p的97. 9%，F35O降低为96. 0%, 当温度为40°C，相应的F4crc降低为91.8%，表现出显著的高温损伤(+)，超过40°C，样品表 现出极显著高温损伤(++)，F45o降低为F。p的85. 3%，F5crc降低为F。p的76. 7%。由此可以判断20 35°C是该大豆样品的适宜生长温度范围，最适宜温度为 25°C，在最适宜生长温度处延迟荧光光谱峰值比F730/F685比值最高记为F。p ；当温度低于 20°C时该大豆样品表现出明显的低温逆境伤害，当温度高于35°C时该大豆样品表现出明显 的高温逆境伤害；随着逆境伤害的加剧，延迟荧光光谱峰值比F730/F685比值显著下降。对图2及图4的进一步分析可知晋单36号玉米样品的最适宜生长温度为35°C， F730/F685为0. 601，记为该作物的F。p。在玉米植株适宜的生长温度25 40°C范围内，F4crc 为F。p的98. 3%，F3trc* F。p的98. 1%，F25o降低为F。p的93. 2%。当温度为20°C时，相应 的F2trc降低为F。p的80. 5%，可见，相较于最适宜生长温度情况，20°C时作物表现出显著的 低温损伤㈩。当温度低于20°C, F15o降低为20°C的71. 0%, Fltrc降低为65. 6%, Frc降低 为61.8%，可见，在5 20°C的低温逆境下，样品出现了极显著低温损伤(**)。高温情况 也有类似的规律，相较于最适宜生长温度，F45o降低为F。p的91. 8%，表现出显著的高温损伤 ⑴，F5crc降低为88. 3%，样品表现出极显著高温损伤(++)。由此可以判断25 40°C是该玉米样品的适宜生长温度范围，最适宜温度为 35°C，在最适宜生长温度处延迟荧光光谱峰值比F730/F685比值最高，记为F。p ；当温度低于 25°C时该玉米样品表现出明显的低温逆境伤害；当温度高于40°C时该玉米样品表现出明显的高温逆境伤害；随着逆境伤害的加剧，延迟荧光光谱峰值比F730/F685比值显著下降。
综合对大豆与玉米样品的温度胁迫光合损伤检测结果的分析，可明显发现大 豆实验样品的最适宜生长温度低于玉米实验样品；大豆样品出现显著低温伤害的温度 (15°C )高于玉米样品(20°C )；大豆样品出现显著高温伤害的温度(40°C )低于玉米样品 (45°C )；大豆样品抗高温胁迫的能力低于玉米样品；大豆样品抗低温胁迫的能力高于大豆 样品。
权利要求
1. 一种用延迟荧光光谱检测作物逆境生理与抗逆性鉴定的方法，其特征在于包括下述 几个步骤1.1选择生长状态相似的作物和/或该作物叶片不同生长部位的若干组叶片，一般为 5 10组，每组选择5 8片相似的叶片进行逆境生理检测与抗逆性鉴定的样品；1. 2将整株作物和/或样品进行逆境胁迫处理；所述逆境胁迫系指对作物和/或样品 创造的诸如干旱、水涝、冷胁、热胁、冻胁、盐胁、辐射、水污染、土壤污染、大气污染等环境因 子；1. 3在室温下测量作物叶片的延迟荧光发射光谱，其工艺过程为 1. 3. 1将作物叶片置于室温下具有磷光或延迟荧光检测功能的荧光光谱仪的样品室中 暗适应30min ；1. 3. 2光谱的激发光源选择波长为蓝光470 500nm与红光650 680nm范围，强度为 0 2500 μ mo 1 · πΓ2 · ；1. 3. 3激发光源均勻辐照叶片的时间为0 Imin ； 1. 3. 4停止激发到采集叶片延迟荧光光谱的间隔时间为0. 01 Is ； 1. 3. 5延迟荧光光谱采集的接收波长范围为185 900nm，放大增益为IX IO8 ； 1. 4对逆境胁迫条件下作物叶片的延迟荧光发射光谱进行分析，采用商用化ORIGIN软 件对所述光谱仪输出的数据进行分析，寻找发射光谱特征峰685nm和730nm附近的最高峰 值，分别记录为F685与F730，由此计算得到F730/F685 ；1. 5测量作物在不同逆境胁迫下的延迟荧光发射光谱峰值比F730/F685的值； 1. 6将健康生长条件下作物的F730/F685值记录为最适宜比值F。p，逆境胁迫生理条件 下的F730/F685值记录为Fsteess ；1. 7比较F。p与Fstress的差异，对作物遭受逆境胁迫后光合功能的损伤状况进行判断； 1. 8比较不同作物在相同逆境胁迫下F。p与Fstass的差异，即可对不同作物的抗逆性大 小进行鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种用延迟荧光光谱检测作物逆境生理与抗逆性鉴定的方法，包括选择生长状态相似的作物不同部位的若干组叶片作为进行逆境生理检测与抗逆性鉴定的样品和将整体操作物或叶片样品进行逆境胁迫处理的步骤，其特征在于还包括检测逆境胁迫下活体作物叶片光诱导延迟荧光发射光谱特征峰值比F730/F685，来反映逆境胁迫下作物生理变化情况，结合最适生长环境下作物的峰值比F730/F685特性，由此判断出作物逆境胁迫损伤状况及抗逆性大小。本发明操作简单、可控性好、受外界环境因素影响小，可以准确侦断作物温度胁迫损伤程度及抗逆性的大小。
文档编号G01N21/64GK102147367SQ20101061368
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者李瑛 , 董丽丽, 许文海 申请人:大连海事大学