专利名称：测定的制作方法
测定本发明涉及前列腺癌的诊断性/预后性的测定，并且包括所述测定中使用的试剂盒。癌症是一种非正常的疾病状态，其中一种或多种细胞群体的不受控制的增殖干扰正常的生物学功能。增殖性改变通常伴随细胞特性的其他改变，包括回归到缺乏组织的状态。癌细胞通常称为“转化的”。转化细胞通常表现出一些以下特性球形形态、胎儿抗原的表达、生长因子独立、接触抑制的缺乏、贴壁不依赖、以及生长至高密度。癌细胞形成肿瘤，并被称为“原发性”或“继发性”肿瘤。原发性肿瘤导致癌细胞在原始转化细胞发育的器官中生长。继发性肿瘤由癌细胞从原发性肿瘤中逃逸，并在另一器官中建立继发性肿瘤引起。这一过程被称为转移，并且这一过程可以是侵袭性的，例如在肝细胞瘤或肺癌的情况下。前列腺癌可以相对无害或具有极端的侵袭性。一些前列腺肿瘤生长缓慢并且导致很少的临床症状。侵袭性前列腺肿瘤向淋巴结或其他器官，尤其是骨转移非常迅速。本领域技术人员已知前列腺癌的生长可以通过阻断雄性激素如睾酮而受到抑制。但是，前列腺癌最终发展并变为不依赖于雄性性激素(即它们变为不依赖雄激素型前列腺细胞)。这些细胞与侵袭性、恶性前列腺癌相关联。只有两个物种，狗和人类患前列腺癌。先前的研究将微型染色体维持蛋白(MCM)鉴定为上皮组织的细胞周期过程中的关键调节因子(见 W099/21014 和 Gonzalez 等人，Nature Reviews/Cancer,第 5 卷第135-141页，2005年2月)。MCM被鉴定为“细胞周期状态”的有用的生物标记物，S卩，细胞是否能够增殖而不是静止或衰老。所有6种MCM(MCM 2-7)的表达见于细胞周期的所有时期，而在退出细胞周期进入静止期、分化或衰老期之后表达被下调。雄激素受体(AR)是一种结合雄激素睾酮和双氢睾酮的核蛋白。AR是一种转录因子，并且涉及到男性性别决定涉及的控制基因。AR的克隆和测序在W089/09791中公开，W089/09791描述了 AR在原核和真核表达系统中的表达以及其在单克隆抗体的开发中的应用。作为用于检测前列腺癌的诊断测验的PSA的检测得到了很好的建立。PSA是由前列腺细胞分泌的一种蛋白酶。血液样本中PSA的检测被认为是受试者的前列腺癌的征兆。这具有与清楚鉴定受试者是否需要进一步 研究相关的重要问题。具有高血清水平的PSA的一些受试者最终却没有发现患前列腺癌。这既引起心理上的压力又造成不必要的生理检查。我们公开了这样的测定，该测定为在来自生物样本的分离细胞样本中前列腺癌的检测提供了可靠的测验同时去除了与男性受试者血清样本中前列腺特异性抗原的检测相关的当前问题。根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测生物样本中前列腺癌细胞的诊断性或预后性的方法，该方法包括以下步骤i)从所述生物样本中获得分离的细胞样本，并使所述分离的细胞样本与特异性结合至少一种MCM多肽的结合试剂(binding agent)接触；ii)使分离的细胞样本与另一个特异性结合核受体多肽的结合试剂接触；任选地iii)使分离的细胞样本与又一个特异性结合前列腺特异性抗原(PSA)的结合试剂接触；
iv)检测两种或多种结合试剂的结合；v)确定阳性结合两个或多个结合试剂的所述分离的细胞样本中细胞的数量，其中阳性细胞的数量是生物样本中前列腺癌细胞的存在的指示剂。在本发明的优选测定中，所述的核受体多肽是雄激素受体多肽(AR)。在本发明的优选测定中，所述的MCM多肽选自MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6或MCM7多肽。在本发明的优选测定中，所述的MCM多肽是MCM2和/或MCM7。在本发明的优选测定中，所述的MCM多肽是MCM2。 在本发明的可选的优选测定中，所述的MCM多肽是MCM7。在本发明的进一步优选测定中，所述的MCM多肽是MCM2和MCM7。在本发明的优选测定中，将所述的细胞样本与特异性结合AR的结合试剂或特异性结合PSA的结合试剂接触。在本发明的优选测定中，所述测定检测MCM多肽、AR和PSA中的至少一种。在本发明的优选测定中，所述测定检测MCM2和/或MCM7，AR和PSA。在本发明的优选测定中，将第(i i )步和第(i i i )步颠倒。在本发明的优选测定中，所述的结合试剂是单克隆抗体或其活性结合片段。很明显，所述的测定提供了用于确定受试者是否具有患前列腺癌的倾向的诊断工具。还提供了用于确定已诊断或正接受如化疗或放射性治疗的受试者是否对治疗发生反应或是否需要其他的或可选择的治疗方案的手段。因此，本发明为受试者更好地管理其疾病提供了治疗方案。在本发明的优选方法中，所述的生物样本是分离的体液，如尿液、精液(semen)或精液(seminal fluid)的样本。通常，快速处理生物样本，以减少样本的降解并提供选择性标记物表达的可靠措施。例如，样本获取后在至少一个小时内经过冷藏(如4°C)并处理。在本发明的优选测定中，所述的生物样本是经过过滤的，其中所述过滤的样本提供所述分离细胞样本。本发明操作中使用的过滤设备的实例在W02009087375中由申请人公开，将其引入作为参考。过滤设备包括收集预定大小的细胞所采用的过滤器、将流体传送给过滤器并由过滤器传送所布置的流体路径以及提供推动流体沿流体路径到过滤器的正压和沿着流体路径从过滤器吸取流体的负压的泵。根据本发明的另一个方面，提供了用于确定受试者中前列腺癌的诊断性或预后性的测定i)获得第一分离的生物样本，并将该样本与特异性结合PSA的结合试剂接触；任选地ii)检测所述样本中PSA的存在；iii)从受试者获得第二生物样本，制备分离的细胞样本，并将所述细胞样本与特异性结合至少一种MCM多肽和雄激素受体多肽的第一结合试剂和第二结合试剂接触；iv)测定所述MCM多肽和雄激素受体的存在；和v)确定阳性结合MCM和雄激素受体两者的所述分离的细胞样本中细胞的数量，其中所述阳性细胞的数量是前列腺癌细胞的存在的指示剂。在本发明的优选测定中，所述的第一生物样本包含血清。在本发明的另一个优选测定中，所述的第二生物样本是尿液或精液。在本发明的优选测定中，所述的MCM多肽是MCM2和/或MCM7。在本发明的优选测定中，所述的MCM多肽是MCM2。本发明的可选的优选测定中，所述的MCM多肽是MCM7。在本发明的优选测定中，所述结合试剂的检测是通过荧光发射检测。在本发明的可选的优选测定中，所述结合试剂的检测是通过酶方法检测。 特异性结合试剂如抗体与正常样本和测试样本的结合可以通过任何合适的方法进行测定。标记包括具有光谱分离的吸收和发射特性的荧光染料、磷光体或激光染料。合适的荧光染料包括荧光黄、罗丹明、藻红素和德克萨斯红(Texas Red)。合适的显色染料包括二氨基联苯胺。其它的标记包括大分子胶体颗粒或颗粒物，所述颗粒物如为有色的、磁性或顺磁性的乳胶珠和可以直接或间接产生要视觉观察、电子检测或以其它方式记录的可检测信号的生物或化学活性剂。这些分子可以为酶，所述酶催化显示颜色或改变颜色或导致例如电特性的变化的反应。它们可以为可分子刺激的，使得能量状态间的电子转移导致特有的光谱吸收或发射。它们可以包括与生物传感器相连使用的化学实体。在下文所描述的实例中，使用了碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。根据本发明的另一方面，提供了包括第一、第二和第三结合试剂的试剂盒，其中所述试剂分别与MCM多肽、雄激素受体多肽和前列腺特异性抗原多肽结合。在本发明的优选实施方案中，所述结合试剂是单克隆抗体。在本发明的更优选实施方案中，所述试剂盒还包括与所述第一、第二和第三单克隆抗体结合的第二抗体，其中每一个所述第二抗体提供有促进检测所述多肽的荧光标记。在本说明书的整个说明书和权利要求书中，词语“包含”(comprise)和“含有” (contain)以及这些词的变化,如“包含(comprising) ”和“包含(comprises) ”,意为“包括但不限于”，并且无意于(和不)排除其它的部分、添加物、成分、整数或步骤。在本说明书的整个说明书和权利要求中，单数涵盖复数，除非上下文中另有要求。尤其是，如果使用冠词，说明书应理解为涵盖复数和单数，除非上下文中另有要求。结合本发明的特定方面、实施方案或实例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团要理解为适用于本文描述的任何其它方面、实施方案或实例，除非与其不相容。定义如本文所使用的“结合试剂(binding agent)”为彼此具有结合特异性的一对分子的试剂。特异性结合对的成员可以为自然来源或者完全或部分合成产生。所述分子对的一个成员在其表面具有可以为突出或凹陷的区域，这个区域与分子对的另一个成员的特定空间和极性组织特异性结合并因此与其互补。因此，所述对的成员具有彼此特异性结合的特性。特异性结合试剂对的类型的例子为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物、DNA-DNA(如寡核苷酸)。本发明一般涉及抗原-抗体类型的反应，尽管其也涉及与此处定义的抗原结合的小分子。如本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，不论是天然的或者部分或全部合成产生的。该术语也涵盖具有为抗体结合结构域的结合结构域的任意多肽或蛋白，或者具有与抗体结合结构域同源的结合结构域的任意多肽或蛋白。这些可以来源于天然来源，或者它们可以是部分或全部合成产生。抗体的例子为免疫球蛋白同种型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其同种型亚类；包含抗原结合结构域的片段，如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ；以及双价抗体。抗体可以为多克隆的或单克隆抗体。由于抗体可以以多种方式进行修饰，所以术语“抗体”应解释为覆盖具有结合结构域的任意特异性结合试剂或物质，所述结合结构域具有所需要的特异性。因此，这个术语涵盖抗体片段、衍生物、抗体的功能等价物和同系物、人源化抗体，术语“抗体”包括包含免疫球蛋白结合结构域的任意多肽，不论是天然的或者全部或部分 合成的。对于目标靶特异性的抗体，例如MCM或AR或PSA，可以采用本领域的标准技术获得。制备抗体的方法包括用蛋白或蛋白的片段或表达所述蛋白或片段的细胞或病毒免疫哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔子)。抗体可以使用本领域已知的多种技术中的任一种从被免疫的动物获得，并进行筛选，例如使用抗体与目标抗原的结合。抗原结合结构域是抗体的部分，所述抗体包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。如果抗原很大，抗体可以只与抗原的特定部分结合，这部分称为表位。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗原结合结构域可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区。“特异性”一般用于指特异性结合对的一个成员不表现与除了其特异性结合对(specific binding partner)之外的分子的任何显著性结合的情形,例如，与任意其它分子的交叉反应性小于约30%，优选20%、10%或1%。按照本发明，本发明的所述特异性结合试剂优选为“分离”的形式。各成员一般游离于或基本上游离于它们天然相关的物质，例如与它们一起在它们的自然环境或制备它们的环境(如细胞培养)中(当该制备在体外或体内通过重组DNA技术进行时)中发现的其它多肽。因此本发明中的特异性结合试剂优选为抗体或其片段。因此，例如特异性结合试剂可以为对PSA或AR具有特异性的抗原结合结构域的抗体或其片段。例如，特异性结合试剂可以是对MCM，例如MCM2或MCM7具有特异性的抗原结合结构域的抗体或其片段。所述抗体可以为多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体或前述抗体的片段。优选地，所述特异性结合试剂是单克隆抗体。对MCM、AR和PSA特异性的单克隆抗体在本领域中是已知的。现将仅通过实例并结合以下的附图描述本发明中的实施方案图I :培养的C4_2b前列腺癌细胞系的DAKO比色染色，a)抗-PSA (褐色，细胞质)，b)抗PSA (褐色，细胞质)和抗MCM2 (红色，细胞核)。图a)显示了抗PSA抗体标记前列腺细胞的细胞质(I)和将细胞核极大地放大(蓝色苏木精染色)。图b)显示了抗PSA抗体的细胞质褐色(I)以及抗MCM2抗体的细胞核红色的双染色。图2 :使用载体染色ImmPRESS (Vector Stain ImmPRESS)试剂对C4_2b细胞系进行比色染色。对图进行标记如下a) N-末端特异性抗AR抗体的仅细胞核的DAB染色(I)和对比染色的细胞质的DAB染色(2) ;b)用C末端特异性抗AR抗体对细胞的非定位的DAB染色；c)用抗PSA抗体的细胞质(箭头)的DAB染色；d)用抗MCM2抗体的细胞核(箭头)的novaRED染色；和e)用抗MCM2抗体的细胞核(箭头)的novaRED染色。图3 :使用载体染色ImmPRESS试剂对C4_2b细胞系进行比色双染色。图显示了DAB-Ni (灰色)标记的抗PSA细胞质(I )，及novaRED (红色)抗MCM2抗体标记的细胞核(2)。图4 :培养的C4_2b前列腺癌细胞系的荧光(Alexafluor)染色。图a)抗PSA抗体(绿色，细胞质)；b)抗MCM7抗体(红色，细胞核)；c)合并的，显示可两个细胞位置的明显独立染色和d)使用显示独立位置的抗PSA抗体(绿色，细胞质)和抗MCM2 (红色，细胞核)抗体的合并的图像。图5 :培养的C4_2b前列腺癌细胞系的荧光(Alexafluor)染色。图a)抗AR抗体(绿色，细胞核)；b)抗MCM7抗体(红色，细胞核)；和c)合并的，显示了 AR和MCM7抗体的细胞核的共定位。图6 :分离自来自患有确认的前列腺癌的患者的临床尿液样本的C4_2b前列腺癌细胞的双荧光染色，用抗AR (绿色)和抗MCM7 (红色)抗体。 图7 :受损细胞和细胞碎片的去除。分离自尿液样本的苏木素染色的膀胱内皮细胞，a)不经过Immunosolv DeadCert颗粒的预处理,和b)去除已死亡或正发生死亡的细胞以及其他一些细胞碎片的处理后。图8 :4小时以上的尿液中培养的C4_2b细胞的细胞核的存活以及健康。清晰的红色细胞核染色表面细胞状况良好。较低的红色染色强度，染色缺失、以及细胞质染色增强表明这些细胞正失去活性，并且不能被清楚地鉴定为患者样本的前列腺癌细胞。图9 :分离自来自患有确认的前列腺癌的患者的临床尿液样本的前列腺癌细胞的双荧光染色，(a)抗AR (绿色)抗体，和(b)抗MCM7 (红色)抗体，以及(c) AR和MCM双染色的合并图像。实施例I用抗PSA和MCM抗原的DAKO双染试剂盒对培养的前列腺癌细胞进行的比色标记。在T75烧瓶中，在37°C和5%C02下，用含有10%FBS和2%链霉素的RPMI培养基将C4-2b细胞培养至90%汇合。移液管吸去培养液，并用温PBS清洗细胞两次。通过在IOml胰蛋白酶中于37°C条件下孵育2-3分钟，接着温和搅拌，从烧瓶表面分离细胞。将细胞悬液转移到50ml离心管中并通过计数血球计数器上的样本来确定存在的细胞的数量。然后，通过离心颗粒化细胞并用温PBS将其重悬至密度为IxlO6细胞/ml。将150 u I等份加入到含有20ml PreservCyt溶液的小瓶中，并转移至Thinpr印-T2000处理器中。这温和地打碎任何细胞碎片，并提供了均匀的细胞悬液。通过收集细胞的均匀层的过滤器吸取细胞悬液。通过监测流动阻力，仪器防止收集过少或过多的细胞层。将截留细胞以直径为IOmm的圆环转移至UroCyte载玻片上。然后将载玻片浸没于酒精(spirit) (Cell Path Ltd. EGK-019500A)中，浙干，以IOcm的距离喷洒Surgipath涂层固定液一次，并置于平整表面上风干。细胞染色用DAKO G/2双染色试剂盒(K5631)对细胞进行染色如下将载玻片在50%甲醇中浸没5min，并用蒸馏水漂洗，然后用TBS (Tris-HCl缓冲盐，DAKO试剂)漂洗。然后，用蒸馏水漂洗，接着用DAKO清洗缓冲液(S3006)漂洗，并转移至自动染色仪(DAKO)中。用20iil DAKO双内源性酶封闭液(product code (K5361)封闭载玻片5min,然后用PBS漂洗两次。以0. 3 y g/ml应用200 U I 一抗A0562兔抗人PSA多克隆抗体(或对照兔抗体)，并孵育30min。除非另外说明，所有的孵育步骤均在室温下进行。用TBS漂洗载玻片两次，并加入200 u I Envision (抗兔)聚合物辣根过氧化物酶聚合物(HRP)的共轭物(DAKO K5361)并孵育30min。用TBS再漂洗载玻片2次，使用DAKO DAB底物，并将载玻片孵育5min。最后从自动染色仪上移除载玻片，并用自来水漂洗3min。为了使MCM抗原接近抗体，接着进行热修复步骤将载玻片浸没于ImM pH值为7. 8的EDTA热修复缓冲液(DAKO)中，全功率进行微波处理(800W，IOmin)。补充热修复缓冲液，并重复微波lOmin。以该种方式制备载玻片10批次。如果制备的样本数量较少，为达到热处理的一致性，将空白载玻片包括在内以达到总数量为10。允许载玻片冷却5min，并返回至自动染色仪。用DAKO双染色封闭液(辅助试剂)对载玻片再次封闭3min，然后用TBS缓冲液漂洗两次。加入 200iil I u g/ml 的第二一抗、小鼠抗 MCM2D1. 12A3 (MRC，Cambridge, UK)或对照小鼠抗体，并孵育60min。TBS漂洗载玻片2次，并加入200 u I Envision聚合物碱性磷 酸酶共轭物(DAKO K5361)，保持15min。用TBS进一步漂洗两次后，加入200 液态的永固红碱性磷酸酶底物(vol, DAKA代码)7min。使用前30min新鲜制备该试剂,并加入到自动染色仪中。补充I滴/ml的DAKO X3021左旋咪唑(DAKO X3021)以阻断内源性碱性磷酸酶活性。染色后，用蒸馏水漂洗载玻片，并浸没于CuSO4溶液(10克CuSO4,17克NaCl的2L水溶液)中，浸没5min，然后用水再次漂洗。然后用苏木精复染色10s，并用水漂洗。最后将载玻片浸没于二甲苯中，浸没5min,风干,并加上盖玻片准备分析。用DAKO抗体稀释剂(S0809或S2022)将抗体由储备液稀释至想要的浓度。使用配备有Prog Res C14彩色照相机的Zeiss AxioSKOP 40显微镜,于白光下观察载玻片。除了在白光下观察后，用于标记MCM抗原的碱性磷酸酶底物发射荧光。这使用具有黑白照相机Axiocam MRm和红色滤光器的Zeiss-Imager M2进行观察。采用Axiovision软件分析图像(图I)。在可选择的测定模式中，0. 3 ii g/ml的DAKO兔抗PSA多克隆抗体A0562由以下中的一种替代i) 0. 3 U g/ml Insight BiotechnologyN-20兔抗雄激素受体N末端特异性多克隆抗体(sc816)。ii)以 1/50 稀释的 Genetex 抗 PSGR 抗体(GTX72749)iii)0. g/mlAbcam 小鼠单克隆抗 PSA 表位 3 抗体 PS2 (abl0189)。iv) 0. 3 U g/ml Abcam 小鼠单克隆抗 PSA 表位 4 抗体 5G6 (abl0186)。v) 0. 3 u g/ml Abcam 兔抗 PSA 多克隆抗体(ab9537)。此外，I. Ou g/ml的Dl. 12A3小鼠抗人MCM2单克隆抗体由以下中的一种替代i) 3. 0 U g/ml Santacruz 141. 2小鼠抗MCM7单克隆抗体sc-9966 (特异性结合于细胞质而不是细胞核的N末端或C末端标记MCM7的抗体，因此仅适于在比色测定中与抗AR抗体联合使用。)。ii)以 1/200 稀释的 Vision Biosystems (Novocastra)的来自 JCC07 细胞系的小鼠抗人MCM3单克隆抗体(NCL-MCM3)iii)以 1/20 稀释的 Vision Biosystems (Novocastra)的来自 CRCT5. I 细胞系的小鼠抗人MCM5单克隆抗体(NCL-MCM5)
对于评估细胞质抗原(PSA)的单抗原染色，省略热修复和第二次染色步骤。对于评估细胞核抗原((AR，MCM/ )的抗原单染色，省略第一次染色步骤。发现细胞质PSA在培养的前列腺细胞中可以用Dl. 12. A3抗体标记(图Ia)。PSA也使用抗‘表位’ 3和4的抗体，而不使用抗‘表位’ I的抗体(未显示)进行检测。类似地，针对前列腺特异性酸性磷酸酶的抗体标记前列腺细胞质，然而针对前列腺特异性G偶联受体(PSGR)的抗体没有作用。此外，核抗原微型染色体维持蛋白MCM2和MCM7以及雄激素受体(AR)提供了很强的标示，而MCM3和MCM5作用较小(未显示)。当与双染色测定联合使用时，PSA和MCM5(图Ib)以及PSA和MCM7 (未显示)可以标记前列腺细胞，并且由于它们不同的细胞定位而被独立的鉴定出来。实施例2用Vector Laboratories的抗PSA雄激素受体(AR)和MCM抗原的ImmPRESS试剂对培养的C4-2b前列腺癌细胞系进行比色标记 用Thinprep T2000仪器按照实施例I中所述准备载玻片。所有的标记和清洗步骤均为手工操作进行。首先将载玻片浸没于50%甲醇中，保持5min，并加入200 DAKO双内源酶阻断剂(产品编号(K5361))，保持5min。然后用蒸馏水漂洗载玻片3次，并用DAKO清洗缓冲液(S3006)漂洗5次。将2. 5%准备使用的ImmPRESS正常马血清(NHS)施用于载玻片上，保持20min用于封闭，接着加入0. 3iig/m 200 u I DAKO A0562兔抗人PSA多克隆抗体(或者对照的兔抗体)，并孵育lOmin。除非另外说明，所有的孵育步骤均在室温下进行。用DAKO清洗缓冲液漂洗载玻片5次，并加入200 u I ImmPRESS试剂(通用的HRP标记的抗兔和抗鼠)，保持30min。用DAKO清洗缓冲液漂洗载玻片5次，并加入200 U IImmPRESS 底物，保持 5min。所使用的底物是 Vector VIP (SK-4600,紫色),DAB (SK-4100，褐色)、DAB-Ni(SK-4100、灰色/ 黑色)或 Vector NovaRED (SK-4800，红色)中的任意一种。用清洗缓冲液漂洗载玻片5次。为了使MCM抗原接近抗体，接着进行热修复步骤将载玻片浸没于ImM pH值为7. 8的EDTA热修复缓冲液(DAKO)中，全功率进行微波处理(800W，IOmin)。补充热修复缓冲液，并重复微波lOmin。采用这种方式制备载玻片10批次。如果制备的样本的数量较少，为达到热处理的一致性，将空白载玻片包括在内以达到总数量为10。允许载玻片冷却5min。用2. 5%正常马血清再次封闭载玻片20min。加入200 U I浓度为I y g/m的第二一抗、小鼠抗MCM2D1. 12A3(MRC，Cambridge, UK)或对照小鼠抗体，并孵育lOmin。用清洗缓冲液漂洗载玻片5次，并加入200 u I ImmPRESS试剂(如上所述)，保持30min。进一步漂洗5次之后，加入200 u I ImmPRESS底物，保持5min。底物为以上所列四种中的任意一种，但与上一步骤中所用的不同。染色后，将载玻片用蒸馏水漂洗，并置于CuSO4溶液(10克CuS04、17克NaCl的2L水溶液)中，保持5min，然后用水再次漂洗。然后，用苏木精或甲基绿复染色10s，并用水漂洗。最后将载玻片浸没于二甲苯中，保持5min，风干，并加上盖玻片准备分析。用DAKO抗体稀释液(S0809或S2022)和稀释的2. 5%NHS将抗体由储备液稀释至想要的浓度。使用配备有Prog Res C14彩色照相机的ZeissAxioSKOP 40显微镜,于白光下观察载玻片。对于评估核染色抗原(AR，MCM’s)的单染色测定，省略最初的染色步骤。对于评估细胞质抗原(PSA)的单抗原染色测定，省略热修复和第二个染色步骤。在可选择的测定模式中，0. 3 ii g/ml的DAKO兔抗PSA多克隆抗体A056由0. 3 ii g/ml Insight Biotechnology的N-20兔抗雄激素受体N末端特异性多克隆抗体(sc816)或0. 3u g/ml抗雄激素受体C末端特异性多克隆抗体(sc815)替代。l.Oy g/ml的Dl. 12A3小鼠抗人MCM2单克隆抗体由3. 0 ii g/m Santacruz 141. 2小鼠抗MCM7单克隆抗体sc-9966替代。染色使用以下不同的I_PRESS底物来实现DAB (褐色)、DAB-Ni (灰色.黑色)、novaRED (红色)或VIP (紫色)单染色或联合染色，并且使用或不使用复染色。发现，当对N末端特异性的AR抗体能够清楚地标记细胞核时(图2a),对C末端特异性的抗体没有显示任何清楚的细胞定位，因此不适合(图2b)。在细胞的细胞质中还检测到PSA抗原(图2c)。抗细胞周期抗原MCM2和MCM7的抗体都能够标记细胞核(图2d和2e)。发现所有不同的底物在用于单染色时都是有效的(未显示)。对于双染色，一些组合由于它们的相似性表现，因此与其他相比不太适合。发现DAB-Ni与novaRED以及DAB和vectaVIP生成良好的图像(图3)。在这种测定模式中，PSA与一种或多种MCM抗原联合， 必须用作前列腺细胞特异性标记物。由于它的细胞核定位，AR不适合这种模式。实施例3C4_2b前列腺细胞系的荧光标记。培养前列腺癌细胞系C4-2b，并按照实施例I中所述细节制备“Thinpr印”载玻片。细胞染色将载玻片浸没于50%甲醇中，保持5min，用蒸馏水清洗5min，并用DAKO清洗缓冲液漂洗一次。为了渗透细胞，将200ml的0. l%Triton X-100施用到载玻片上，保持5min。然后用清洗缓冲液漂洗3次，并用水漂洗一次。使用IOOml的Image-IT FX信号增强剂(Invitrogen 136933)，并在室温下孵育30min。用清洗缓冲液漂洗载玻片3次，随后用蒸馏水漂洗一次。将一抗混合物或对照抗体(0. 3 u g/ml兔抗PSA和I y g/ml小鼠抗MCM2)施用于载玻片上(每张载玻片上施用lOOiil)，并孵育90min。混合物包含以下组合中的一种i)DAK0 兔抗-PSA 多克隆抗体 A0562 (0. 3 u g/ml)和小鼠抗 MCM2D1. 12A3 (I. Oug/ml) ;ii)DAKO兔抗PSA多克隆抗体A0562和Santacruz 141. 2小鼠抗MCM7单克隆抗体sc-9966 (I. 0 V- g/ml) ；iii) Insight Biotechnology N_20 兔抗雄激素受体 N 末端特异性多克隆抗体 sc816(0. 3 u g/ml)和小鼠抗MCM2D I. 12A3 ;*iv) Insight Biotechnology N-20兔抗雄激素受体N末端特异性多克隆抗体sc816和Santacruz 141. 2小鼠抗MCM7单克隆抗体 sc-9966。用清洗缓冲液漂洗载玻片3次，并用水漂洗I次。将200 U I两种Alexafluor 二抗(1/1000稀释)的混合物应用到载玻片上并孵育30min。所用的混合物如下并与以上所述的一抗混合物相关联，i)和iii) Alexafluor 488 (绿色)抗兔抗体(Invitrogen A11034)和Alexafluor 594(红色)抗小鼠 IgG2b 抗体(Invitrogen A21145) ；ii)和 iv)Alexafluor488(绿色)抗兔抗体(Invitrogen A11034)和Alexafluor 594(红色)抗小鼠IgGl抗体(Invitrogen A21125)。实施例4来源于患者尿液的前列腺细胞的荧光标记。
尿液样本由两名患有确认的前列腺癌的患者提供，并且迅速地进行以下处理。将样本在50m I离心管中以600g离心5min,从而沉淀细胞,并弃去上清液。通过温和搅拌，将细胞沉淀重悬浮于小体积的Cytolyt (Cytyc Corp)中，管中充满30ml CytoLyt0将悬液润旋5min并再次离心。将细胞沉淀重悬浮于100 y I PreservCyt溶液中，然后转移至含有20ml PreservCyt的小瓶中。将小瓶放置于Thinprep T2000中，并按照上面的实施例3制备载玻片。用LOug/ml Santacruz 141. 2 小鼠抗 MCM7 单克隆抗体 sc-9966 和 0. 3 u g/mlDAKO 兔抗 PSA 多克隆抗体 A0562 或 0. 3 ii g/ml Insight BiotechnologyN_20 兔抗雄激素受体N-末端特异性多克隆抗体(sc816)标记细胞(图6)。在两个样本中均鉴定到前列腺细胞。它们均有不规则形状，并且由于长时间暴露于尿液中后状态不佳，从而展现出细胞质染色程度的变化。实施例5
从尿液样本中去除碎片的效果。将尿液样本在600g下离心IOmin从而沉淀细胞。将细胞在ImlPBS中重悬。利用血球计数仪确定总的细胞数。细胞悬液的体积调整至每100 U I中含有5xl06个细胞(通过添加PBS，或通过重沉淀和重悬于适合体积的PBS中)。将Immunosolv Dead Cert 纳米颗粒(Imunosolv Ltd. , Edinburgh, UK)的存忙小瓶涡旋30s。将25 ill的纳米颗粒转移至含有Iml PBS的Eppendorf管中。将管置于提供的磁性分选仪中，保持3-5min，直到颗粒抗磁性而聚集。由移液管去除缓冲液，并移除管。将颗粒在100 ill PBS中通过涡旋重悬。将100 ill细胞(5xl06细胞)加入到颗粒悬液中，并4°C下孵育混合物40min。在该孵育过程中，磁性纳米粒子选择性地与在已死亡或者正在死亡的细胞表面上表达的抗原结合。向管中再加入800 ill PBS并温和混合，然后将管重新置于磁性分选仪中，保持5min。用移液管将含有活的健康细胞的上清液去除，并加入到一小瓶的PreservCyt (20ml)中。第二个IOOii I等份的未伴随DeadCert颗粒预耗尽 (pre-depleted)的细胞加入到另一小瓶的PreservCyte中。然后,按照实施例I中所述，将两份样本均在Thinprep T200中处理。载玻片用苏木精染色,从而进行可视化,见图7。在未处理的样本中，存在大量的主要由于无活性细胞产生的碎片的颗粒。这些碎片颗粒常可以非特异性地被标记，并且由于频繁观察到真正癌细胞的可变化的细胞形态，通常不能将这些碎片颗粒与真正的癌细胞区分开。相反，处理后的样本含有较少的碎片颗粒，使得对患者做出更准确和更稳健的评估成为可能。实施例6尿液中前列腺癌细胞的存活率。按照实施例I中所述，培养前列腺细胞系C4_2b。当培养瓶中达到80%汇合时，通过离心收集细胞，在PBS液(磷酸盐缓冲液)中重悬，并计数。将含有大约2xl07个细胞的5ml PBS加入到由健康供体提供的25ml尿液中并于4°C保存。lh、2h、3h和4h后从冰箱中移除样本，并按照实施例I所述采用Thinprep T2000设备制备载玻片。用实施例I中所述的小鼠抗MCM2D1. 12A3抗体和DAKO抗小鼠碱性磷酸酶试剂对载玻片染色，兵在双白光下观察(图8)。在Ih和2h细胞表现出清楚的强密度的核染色。到第3h染色不清楚的细胞核，并且密度减轻。在这个时间点一些细胞对MCM无染色阳性。到4h时健康细胞的比例明显减少(数据未显示)。染色MCM的细胞具有特别的重要性，表明核完整性可以保持4h，此后到72h逐渐解体(数据未显示)。表明保护细胞膜的消失/解离从Ih开始，其中作为对前列腺特异性细胞的细胞质染色的细胞完整指数的PSA，从Ih开始迅速解体(数据未显示)。实施例7具有雄激素受体(AR)和微型染色体维持蛋白(MCM)抗体的前列腺癌细胞系的染色对前列腺癌患者的早期研究表明，在患者尿液中可以捕获前列腺上皮细胞，同时伴随高血清前列腺特异性抗原(PSA)值。这些细胞数量很少，并且在排泄一小时必须经过处理。我们已经建立了一种利用MCM作为核标记物、而PSA作为细胞质标记物，检测尿液中前列腺细胞的方法。但是尿液中这些细胞的快速解体，尤其是细胞膜，因此细胞的细胞质需 要更加稳健的抗体标记物。注意到，前列腺上皮细胞的核在排泄后高达4h保持完整(见实施例6)。选择并研究了对前列腺组织有特异性亲和力的核标记物。利用雄激素受体抗体、和利用前列腺癌患者或者具有高血清PSA值人群的尿液中的两种前列腺癌细胞系实现了很好的前列腺细胞的定义。具有已建立的前列腺癌细胞系(C42b)的正常尿液在Hologic T2000仪器上用尿酸盐细胞(!Oocyte)载玻片在实验室中进行制备。将载玻片浸没于50%甲醇中，保持5min，用去离子水清洗，然后加入200 ill 0. 2%Triton X-100，保持5min以渗透细胞。用DAKO缓冲液进一步漂洗3次和用去离子水进一步漂洗I次，接着滴加2滴(100 u I) Image-IT Fx信号增强剂或足以覆盖盖玻片或切片的体积，然后于室温下孵育30min。用DAKO缓冲液进一步漂洗3次和用水进一步漂洗I次，接着与200 u I的一抗AR(0. 3 u g/ml的AR-N20，来源于 Santa Cruz 公司，产品编号为 sc-816)和 I. 15 u g/ml MCM(MCM7，来源于 Santa Cruz公司，产品编号为sc9966)在0. 5%奶粉中孵育60min。载玻片用缓冲液漂洗3此和用去离子水漂洗I次，然后与相关的Alexafluor 二抗(alexafluor 488山羊抗兔IgG (H+L ;Invitrogen 产品编号 A-11034,和 Alexafluor 594 山羊抗小鼠 IgGl ( y I) ；Invitrogen 产品编号A-21125)在黑暗中孵育30min。在室温下滴加一滴Prolong GoIdAnti-fade试剂，接着对所有载玻片封片之前，再次用缓冲液漂洗3次和用水漂洗I次。通过将固定的样本放置于平坦干燥的表面上并且于室温下黑暗条件中孵育24小时来处理载玻片。使用在IOs处具有不同荧光滤光器的荧光显微镜检测荧光(图9)。对于雄激素受体和微型染色体维持蛋白，实验均显示了清楚和明确的核染色。使用MCM7(以I : 100稀释)和兔雄激素受体单克隆抗体(AR)(来源于Epitomics公司)进行同样的实验。此外，使用以I : 50稀释的MCM2和兔雄激素受体单克隆抗体(AR)(来源于Epitomics公司)进行另一个实验。采用两种不同的组合方式染色载玻片，使用了采用作为通过MCM2或MCM7评估前列腺细胞核的特异性和固定的阴性对照的C42b前列腺上皮细胞和EJ28膀胱癌细胞的混合群体和雄激素受体的组合。所采用的方法学与合并雄激素受体多克隆抗体(如上所述)和MCM7的C42b细胞系中所用方法相同。该实验中C42b细胞用I : 50稀释的MCM2和I : 100稀释的RabMAb AR染色。使用AF488-1/1000和I : 100稀释的雄激素受体以及AF594-1/1000和I : 50稀释的MCM2在荧光显微镜清楚地鉴别独立的核染色组分(数据未显示)。在这些情况下染色的前列腺细胞系的单独图像显示出在鉴定的前列腺细胞的细胞核中染色特性的清楚鉴定。当雄激素受体和组合有相关Alexafluor突光抗体的MCM2抗体组合,这提供了清楚和确定的核染色模式的证据，从而绿色标记的雄激素受体和红色标记的MCM2核染色一起产生了橘黄色的组合，从而将前列腺上皮细胞和双核染特性的标准化前列腺恶性细胞系区分开来(数据未显示)。进一步的工作中分别单独使用C42b与EJ28前列腺和膀胱恶性细胞系两者的混合群体，当联合使用雄激素受体和MCM7时显示了很好的前列腺细胞核黄色染色的证据。EJ28膀胱癌细胞根本没有被染色。同样，C42b与EJ28细胞系的混合群体当用I : 100稀释的雄激素受体和I : 50稀释的MCM2染色时，显示了 C42b与EJ28染色细胞的合并图像，其中EJ28染色细胞没有雄激素受体染色的证据。 这些实验证实用MAb AR加MCM7的组合具有清楚和确定的核染色，同样用MAb AR和MCM2也具有染色活性。这些数据证实上皮前列腺癌细胞系可以应用MCM2和MCM7联合 雄激素受体抗体，该情况下为MAb AR，进行核水平染色。
权利要求
1.ー种用于检测生物样本中前列腺癌细胞的诊断性或预后性的測定，所述诊断性或预后性的測定包括以下步骤 i)从所述生物样本中获得分离的细胞样本，并使所述分离的细胞样本与特异性结合至少ー种MCM多肽的结合试剂接触； ii)使分离的细胞样本与另ー个特异性结合雄激素受体多肽(AR)的结合试剂接触；任选地 iii)使分离的细胞样本与又一个特异性结合前列腺特异性抗原(PSA)的结合试剂接触； iv)检测两种或多种结合试剂的结合；和 v)确定阳性结合两种或多种结合试剂的所述分离的细胞样本中细胞的数量，其中所述阳性细胞的数量是生物样本中前列腺癌细胞的存在的指示剂。
2.根据权利要求I所述的測定，其中所述MCM多肽选自MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6或MCM7多肽。
3.根据权利要求2所述的測定，其中所述MCM多肽是MCM2和/或MCM7。
4.根据权利要求2或3所述的測定，其中所述MCM多肽是MCM2。
5.根据权利要求2或3所述的測定，其中所述MCM多肽是MCM7。
6.根据权利要求3所述的測定，其中所述MCM多肽是MCM2和MCM7。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的測定，其中通过
图1、2、3、4、5或6中的氨基酸序列来表示所述MCM多肽。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的測定，其中将所述细胞样本与特异性结合AR的结合试剂和特异性结合PSA的结合试剂接触。
9.根据权利要求8所述的測定，其中所述测定检测MCM多肽、AR和PSA中的至少ー种。
10.根据权利要求9所述的測定，其中所述测定检测MCM2和/或MCM7、AR和PSA。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的測定，其中将步骤(ii)和(iii)颠倒。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的測定，其中所述结合试剂是单克隆抗体，或其活性结合片段。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的測定，其中所述生物样本是分离的体液样本。
14.根据权利要求13所述的测定,其中所述体液是尿液,精液(semen)或精液(seminalfluid)。
15.根据权利要求13或14所述的測定，其中所述生物样本是经过滤的样本，其中所述经过滤的样本提供所述分离的细胞样本。
16.ー种用于确定受试者前列腺癌的诊断性或预后性的測定，所述诊断性或预后性的測定包括以下步骤 i)获得第一分离的生物样本，并将该样本与特异性结合PSA的结合试剂接触；任选地 ii)測定所述样本中PSA的存在； iii)从所述受试者中获得第二生物样本，制备分离的细胞样本，并将所述细胞样本与特异性结合至少ー种MCM多肽和雄激素受体多肽的第一和第二结合试剂接触； iv)检测所述MCM多肽和雄激素受体的存在；和 V)确定阳性结合MCM和雄激素受体两者的细胞样本中细胞的数量，其中所述阳性细胞的数量是前列腺癌细胞的存在的指示剂。
17.根据权利要求16所述的測定，其中所述第一生物样本包含血清。
18.根据权利要求16所述的測定，其中所述第二生物样本是尿液或精液。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的測定，其中所述MCM多肽是MCM2和/或MCM7。
20.根据权利要求19所述的測定，其中所述MCM多肽是MCM2。
21.根据权利要求19所述的測定，其中所述MCM多肽是MCM7。
22.根据权利要求19所述的測定，其中所述MCM多肽是MCM2和MCM7。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的測定，其中所述结合试剂的检测是通过荧光发射进行。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的測定，其中所述结合试剂的检测是通过酶法进行。
25.—种试剂盒,包括第一、第二和第三结合试剂,其中所述试剂分别结合MCM多肽、雄激素受体多肽和前列腺特异性抗原多肽。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述结合试剂是单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及一种用于前列腺癌的诊断性/预后性测定，并且包括在该测定中使用的试剂盒。
文档编号G01N33/574GK102782497SQ201080056888
公开日2012年11月14日 申请日期2010年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者R·A·拉斯基 申请人:赛托系统有限公司