专利名称：一种呼出气采样盒和采样方法
技术领域：
本发明涉及一种简易、高效的呼出气采样盒和采样方法，主要应用于临床疾病检测、防范控制流感疫情等。
背景技术：
2003年的SARS和2009年Hmi的大型流感的爆发造成了巨大的社会恐慌与经济损失。在流感爆发时通常采用体温初筛、然后隔离确诊等手段来防范流感的进一步扩散。可是，被流感病毒感染的病人有一定的潜伏期，虽然临床上没有症状，但也是病毒的携带者， 极具感染性。呼出气冷凝液(Exhaled breath condensate简称EBC)越来越多地被用来诊断疾病，研究对象包括细胞因子，过氧化氢(H2O2)，亚硝酸盐(nitrite)等。最近一项研究显示对于原发性乳腺癌的病人，呼出气中的过氧化氢明显偏高。此外，研究也发现在病人的呼出气里有普通甲型流感病毒，这样为通过检测呼出气中的生物成分来诊断感染人群提供了理论依据。然而，常用的呼出气冷凝器，如RTube collection system (Respiratory Research, Inc, Charlottesville, VA)禾口 EcoScreen condenser(Erich Jaeger GmbH, ffurzburg,Germany)存在构造复杂、笨重、效率低、携带不便等缺陷，这些缺陷极大地限制了呼出气冷凝液在医学上的应用。
发明内容
本发明的目的为克服目前传统的呼出气采样器笨重、庞大和重复利用率低等缺点，本发明提供了一种便携的简易呼出气采样盒以及采样方法。本发明的技术方案如下方案1 一种呼出气采样盒，包括采样盒底座，采样盒盖，所述采样盒盖上有一呼出气入口，其特征在于，采样盒底座上放置冰层，冰层之上放置一张超低温处理的超疏水膜。所述超低温为-70°C。方案2 作为方案1的一种优选实现，其特征在于，所述采样盒盖和采样盒底座无缝接合。例如，可以使用螺扣或者卡扣等方式进行扣接。这样可以保证在采样过程中无水蒸气污染。方案3 作为方案1的一种优选实现，其特征在于，所述采样盒的材料为聚四氟乙烯。可以减少呼出气在装置内部的吸附。方案4 作为方案1的一种优选实现，其特征在于，所述采样盒形状为下部为长方体，上部为四棱台，所述采样盒底座的长宽高尺寸为IOOmmX 50mmX 30mm，采样盒盖上、下部的尺寸为 50mmX50mmX25mm 和 IOOmmX 50mmX 25mm。方案5 作为方案1或3或4的一种优选实现，其特征在于，所述采样盒盒壁的厚度为3mm。这样整个采样盒的尺寸很小，重量可以做到小于50g，非常便携。本发明同时提供了利用方案1所述的采样器进行呼出气采样的方法，如下
方案6 —种利用方案1所述的采样盒进行呼出气采样的方法，其特征在于，包括如下步骤a)将一层无菌水加入到采样盒底座上；b)将采样盒底座进行超低温处理，直至所述无菌水凝结为固态；c)将合适大小的无菌的超低温(_70°C )处理后的超疏水膜放置于采样盒底座内的冰上；d)将一根无菌导气管插入到呼出气入口中，使得导气管下端与超疏水膜保持一定间距；e)呼出气的被采者将口放到导气管上，用鼻子吸气，再用嘴将呼出气吹到导气管中；f)反复执行上一步，在达到指定次数或者指定时间后，停止采样；g)在无菌环境下，将超疏水膜取出；h)使用移液枪在超疏水膜表面滴加一定量不含有核酸的水，用移液枪的枪头拨动液珠，使其在超疏水膜表面上都能有接触并来回滚动；i)将液珠用移液枪吸取并转移到无菌离心管中，收集到的液体即含有呼出气的成分，采样结束。方案7 作为方案6的一种优选实现，其特征在于，所述步骤b)中，所述超低温处理为把采样盒底座置于超低温冰箱中保存。方案8 作为方案6的一种优选实现，其特征在于，所述步骤b)中，导气管下端与超疏水膜的间距为2mm。注意，导气管下端一定不能与超疏水膜接触。方案9:作为方案6的一种优选实现，其特征在于，所述步骤f)中，指定时间为 5-10分钟。方案10 作为方案6的一种优选实现，其特征在于，所述步骤h)中，所述不含有核酸的水的量为5-10 μ L。本发明的有益效果本发明提供的装置采用简单的超疏水膜和特制的微型采样盒实现对病人呼出气的快速、高效采样，总重小于50克。主要特点是(1)利用经超低温处理后的超疏水膜不但可以实现对呼出气的快速、高效冷凝，而且也实现了对冷凝液的便捷采样，大大缩短了呼吸采样时间；(2)利用特制的呼出气采样盒，可以防止呼出气的损失、交叉污染；(3)该呼出气装置简易、低廉，可重复使用。
图1呼出气简易装置结构示意图。图2呼出气样品中总细菌的基因扩增(PCR)的初步结果。
具体实施例方式装置的设计如图1所示，呼出气采集装置主要包括采样盒底座1、采样盒盖4、呼出气入口 5和冰层2、超疏水膜3组成。采样盒底座的长宽高尺寸为IOOmmX50mmX30mm。 采样盒盖上、下面的尺寸为50_X50_X25_和100_X50_X25mm，在盒盖的顶面上，钻有直径约为4mm的通孔，为呼出气入口。整个结构的厚度在3mm左右，为了确保采样盒底座和盒盖接触紧密，在采样盒底座1与采样盒盖4接触的边界制作了 2mm的凹槽；相应地，在采样盒盖4的边界制作了 2mm的突槽。整个装置的材料使用的是聚四氟乙烯，可以减少呼出气在装置内部的吸附。只要不妨碍便携式采样，采集装置的尺寸和形状可根据情况而变化。关键技术由于所用的超疏水膜具有很强的疏水作用，呼出气在经过超低温处理的超疏水膜上很快成水珠状，而没有损耗，使用移液枪头(含有微量无核酸的水)在超疏水膜上拖动，这样自动将冷凝在超疏水膜上的呼出气形成一个大的水珠，从而得到呼出气的高效率采样；同时采用密封盒技术防止了室内水蒸气的污染。使用说明首先将无菌水加入到采样盒底座上，使水深度达到5mm即可，放入-70°C超低温冰箱(Thermo Fisher Scientific Co. Marietta,OH)中保存。待底座中的无菌水已经凝结为固态时，将无菌的超疏水膜(Parafilm Co. Menasha,WI)制作成长宽尺寸为 80mmX 40mm，放置于采样盒底座内的冰上。将采样盒盖盖到采样盒底座上，即如图1所示。 将一根无菌导气管(直径为4mm)插入到呼出气入口中，导气管下端与超疏水膜保持2mm左右的间距，下端不要触到膜的上表面。呼出气的被采者将口放到导气管上，用鼻子吸气，再用嘴将呼出气吹到采样盒，经导气管输送到超疏水膜的表面，由于膜表面和盒体的内环境温度在零度以下，呼出气很快冷凝到超疏水膜上，形成微小的液珠(肉眼不可见)，本呼出气采样操作持续5-10分钟之后，在无菌环境下，将超疏水膜取出，使用移液枪(Eppendorf， Hauppauge,NY)在膜表面滴加5_10 μ L不含有核酸的水，用移液枪的枪头拨动液珠，使其在超疏水膜表面上都能有接触并来回滚动，该操作完毕后，将液珠用移液枪吸取并转移到无菌离心管中，收集到的液体即含有呼出气的成分。图2显示的是对4名实验室志愿者采样到的呼出气中总细菌的基因扩增图，图中样本表示利用该专利采样到的实验室参与者的呼出气冷凝液，其中采样膜空白，是在同样情况下但没有采样呼出气时得到的空白样品。从图中可以看出，对四位测试者，有三位的呼出气中检测到一定量的细菌DNA，而空白样品呈阴性。本发明提供的采样器和采样方法克服了目前传统的呼出气采样器笨重、庞大和重复利用率低等缺点，实现了便携化。本装置和方法采集到的呼出气样品可供各项生化分析， 是一种无创的样品采样方法和装置，该操作简便、成本低廉。本发明可以用于医学实验，采样的样品可供后续疾病的早期检测和诊断。
权利要求
1.一种呼出气采样盒，包括采样盒底座(1)，采样盒盖G)，所述采样盒盖(4)上有一呼出气入口(5)，其特征在于，采样盒底座(1)上放置冰层O)，冰层( 之上放置一张超低温处理的超疏水膜(3)。
2.如权利要求1所述的呼出气采样盒，其特征在于，所述采样盒盖(4)和采样盒底座 (1)无缝接合。
3.如权利要求1所述的呼出气采样盒，其特征在于，所述采样盒的材料为聚四氟乙烯。
4.如权利要求1所述的呼出气采样盒，其特征在于，所述采样盒形状为下部为长方体， 上部为四棱台，所述采样盒底座⑴的长宽高尺寸为IOOmmX50mmX30mm，采样盒盖(4)上、 下部的尺寸为 50mmX50mmX25mm 和 IOOmmX 50mmX 25mm。
5.如权利要求1或3或4所述的呼出气采样盒，其特征在于，所述采样盒盒壁的厚度为3mm ο
6.一种利用权利要求1所述的采样盒进行呼出气采样的方法，其特征在于，包括如下步骤a)将一层无菌水加入到采样盒底座(1)上；b)将采样盒底座(1)进行超低温处理，直至所述无菌水凝结为固态；c)将合适大小的无菌的超低温处理的超疏水膜C3)放置于采样盒底座(1)内的冰上；d)将一根无菌导气管插入到呼出气入口中，使得导气管下端与超疏水膜保持一定间距；e)呼出气的被采者将口放到导气管上，用鼻子吸气，再用嘴将呼出气吹到导气管中；f)反复执行上一步，在达到指定次数或者指定时间后，停止采样；g)在无菌环境下，将超疏水膜取出；h)使用移液枪在超疏水膜表面滴加一定量不含有核酸的水，用移液枪的枪头拨动液珠，使其在超疏水膜表面上都能有接触并来回滚动；i)将液珠用移液枪吸取并转移到无菌离心管中，收集到的液体即含有呼出气的成分， 采样结束。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述超低温处理为把采样盒底座(1)置于超低温冰箱中保存。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，导气管下端与超疏水膜的间距为2mmο
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤f)中，指定时间为5-10分钟。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤h)中，所述不含有核酸的水的量为 5-10 μ L。
全文摘要
本发明公布了一种简易高效的呼出气采样盒以及使用该采样盒进行呼出气采样的方法。采样盒包括采样盒底座(1)，采样盒盖(4)，采样盒盖上一呼出气入口(5)，采样盒底座上放置的冰层(2)，冰层之上放置的一张超疏水膜(3)。被采样者的呼出气经导气管输送到低温处理后的超疏水膜的表面，然后冷凝到超疏水膜上，形成微小的液珠，使用移液枪在超疏水膜表面滴加一定量不含有核酸的水，用移液枪的枪头拨动液珠，使其在超疏水膜表面上都能有接触并滚动，最后将液珠转移到无菌离心管中，采样结束。本发明克服了现有呼出气采样器笨重、庞大和重复利用率低等缺点，实现了便携化和可重复利用，可以用于临床疾病检测、防范控制流感疫情等方面。
文档编号G01N1/22GK102175493SQ20111002011
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者徐振强, 朱彤, 要茂盛 申请人:北京大学