专利名称：一种基于化学发光原理的活细胞检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基于化学发光原理的活细胞检测方法。
背景技术：
细胞活性检测的常规方法有MTT法、荧光染色法和ATP生物发光法等。MTT法是根据活细胞的线粒体脱氢酶能使四噻唑盐MTT裂解为蓝紫色的结晶物i^rmazan，其生成量与存活细胞数呈正比，根据颜色的深浅，用比色法进行检测。MTT法操作简便，敏感度高，可重复性比较好，给细胞培养技术带来了很大的方便。但是MTT法有无法克服的弱点=Formazan 的生成受作用时间的影响，样品较多时测定的A值随时间而变，会增加实验误差。对悬浮细胞来说，经MTT染色后，用DMSO溶解后，必须将每孔中的细胞吸出，离心去除上清，沉淀用 DMSO溶解后再测定A值，操作繁琐。ATP生物发光法是20世纪80年代发展起来的一种检测技术，ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，每种微生物细胞中的ATP含量是恒定的。通过测定样品中的ATP浓度，即可推算出活菌数。ATP 生物发光法的检测过程无需细胞培养，操作简便，在短时间内即可得到检测结果，是目前检测微生物最快的方法之一。但是ATP生物发光法存在非菌类的“游离ATP”和其他成分干扰的问题，如何简易可靠地去除这个本底信号而又不影响“微生物ATP”检测的灵敏度目前还没有得到有效解决。此外，由于细胞表层有细胞膜和细胞壁包裹，样品未经处理是不能测定 ATP的，如果ATP提取过程处理不当的话也会产生假阳性信号。综上所述，目前微生物快速检测方法均存在一定的局限性，还没有一种方法能够真正达到检测速度快、检测的准确率高并且检测限低的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于化学发光原理的快速检测细胞活力的方法。本发明采用的技术方案是一种基于化学发光原理的活细胞检测方法，所述方法包括以结构如式(I)所示的1，2-二氧环乙烷类化学发光剂为酶反应底物，加入待测细胞，于pH 8. 0 8. 5的缓冲液中室温下孵育10 20分钟后，取细胞液测定化学发光强度，根据发光强度大小判断细胞活力高低；
权利要求
1. 一种基于化学发光原理的活细胞检测方法，所述方法包括以结构如式(I)所示的 1，2_ 二氧环乙烷类化学发光剂为酶反应底物，加入待测细胞，于pH 8.0 8.5的缓冲液中室温下孵育10 20分钟后，取细胞液测定化学发光强度，根据发光强度大小判断细胞活力高低；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括(1)用DMSO溶解式(I)所示的1，2-二氧环乙烷类化学发光剂，制备成lmmol/1的底物储备液，2 8°C下密闭冷冻保存；将底物储备液加至pH 8. O 8. 5的Tris缓冲液中，配制成2μπι01/1的底物溶液；(2)吸取待测菌液样品0.anl，移至96孔聚苯乙烯微孔板中；加入0. 2ml上述底物溶液，搅勻后在室温下孵育15 20分钟，用微孔板发光仪测定477nm处的化学发光强度，根据发光强度大小判断细胞活力高低。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的标准菌液于相同条件下测定化学发光强度，以发光强度为纵坐标、标准菌液浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据样品细胞的发光强度，对照标准曲线，计算获得待测样品中活细胞的浓度。
全文摘要
本发明以活细胞的胞内酶作为检测靶点，以化学发光作为胞内酶活性的检测信号，设计一种非培养、快速的活细胞检测的新方法。本发明方法以能穿过细胞膜的1，2-二氧环乙烷类化学发光剂为酶底物，该底物进入细胞内部后与胞内活性水解酶发生水解反应并产生化学发光，化学发光的强度取决于活细胞的数量和新陈代谢强度，因此可作为检测细胞活力的指标。
文档编号G01N21/76GK102183512SQ201110038439
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月15日 优先权日2011年2月15日
发明者何睿, 李霞, 梁媛媛, 焦艳华, 陈森林, 陈灿玉, 黄志坚 申请人:杭州师范大学