稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase及其编码基因和应用的制作方法

专利名称：稀有鮈鲫α型Na⁺/K⁺-ATPase及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学及环境生物学领域，涉及一种稀有鉤鲫a型Na+/K+-ATPase及其编码基因和应用，以及基于所述编码基因的引物对及其在辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物中的应用。
背景技术：
NaVK+-ATPase又称钠泵，它能催化ATP水解供能，驱动Na+和K+于细胞膜两侧的对向运输，维持着细胞膜两侧的膜电位、调节细胞渗透压，为营养物质的吸收提供动力，并在神经和肌肉细胞的冲动传导等方面起着重要作用。鱼类终生生活在水环境中，其体液与外界往往是不等渗的，因此必须进行渗透压调节，以维持生命所需的水盐平衡。Na+A+-ATPase是评价鱼类渗透压调节功能的一个重要指标。鱼类Na+/K+-ATPase的基本结构包括一个a亚基和一个3亚基，通过这两个亚单位异构型的变化调控Na+A+-ATPase的生物活性。目 前已经证实a和0亚基由不同基因编码，其中a亚基分子量较大(约IlOkD),含有功能酶的酶促反应结构域，而P亚基分子量较小(约55kD)，其作用目前不十分明确，现有的研究表明，它可能是维持钠钾泵稳定性及正确膜定位的必要组成部分。硬骨鱼类下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPI)不仅在调控对环境胁迫的应激反应中占主导地位，而且在渗透压调节方面也有至关重要的作用。近年来随着对环境中内分泌干扰物研究的不断扩展和深入，越来越多的研究表明，除已受到广泛关注的生殖系统和甲状腺系统外，鱼类肾上腺系统也是内分泌干扰物的重要作用靶之一。皮质醇是鱼类应激反应的重要指标之一，同时也是硬骨鱼类体内最重要的肾上腺皮质激素，具有调节鱼体内碳水化合物的新陈代谢和离子平衡的功能。有研究表明当血液皮质醇水平的变化时，鱼体内Na+/K+_ATPase活性及离子浓度均会发生变化[Waring, C. P.和Moore, A. , The effectof atrazine on Atlantic salmon(Salmo salar)smolts in fresh waterand after seawater transfer. Aquat Toxicol, 66 :93-104 (2004)]。因此,有必要对鱼类肾上腺调节的分子机制进行深入研究，并寻找合适的肾上腺激素干扰物的检测方法。稀有鉤鲫(Gobiocypris rarus)属担尼亚科,鉤鲫属，是中国特有的稀有鱼类,分布于四川省汉源县、石棉县、双流县、都江堰市和彭县等地。我国学者对其生物学背景进行了大量研究，发现其不仅具有性成熟周期短，繁殖季节长，连续产卵，温度适应范围广，二氧化碳和溶解氧耐受力高等作为实验鱼类的优良特征，而且在水生化学品毒性测试上有极高的敏感性[Zhong, X.，Xu, Y.，Liang, Y.，Liao, T.，Wang, J. ；Zha, J.，Wang, Z.，Wang, N.，Ingersoll, C. Histological alternation andvitellogenin induction in adult rareminnow (Gobiocypris rarus)after exposureto ethynyIestradiol and nonylphenol.Chemosphere 66:488-95(2007)]。但在分子生物学和毒理学方面，尤其关于肾上腺系统应激机制方面，仍需要大量的工作。因此，鉴定和检测稀有鉤鲫a型Na+A+-ATPase基因及其所编码的蛋白，并将其应用于环境内分泌干扰物作用机制研究中具有重要意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种稀有鉤鲫a型Na+A+-ATPase及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质,来自稀有鉤鲫(Gobiocypris rarus),是如下(a)或(b)
(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有Na+A+-ATPase活性的由序列I衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有Na+A+-ATPase活性的由序列I衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下(I)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子 (1)序列表中序列2自5’末端第I至93位核苷酸所示的DNA分子； (2)序列表中序列2所示的DNA分子； (3)在严格条件下与(I)或(2)限定的DNA序列杂交且编码具有Na+A+-ATPase活性的蛋白的DNA分子； (4)与(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有Na+A+-ATPase活性的蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.扩增权利要求2或3所述基因或其片段的引物对。
6.如权利要求5所述的引物对，其特征在于所述引物对由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
7.一种辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物的方法，包括如下步骤 (1)分别在水环境甲和水环境乙中养殖稀有鉤鲫；所述水环境甲为不含有肾上腺激素和肾上腺激素干扰物的水环境；所述水环境乙为待检测水环境； (2)分别提取步骤(I)的两种水环境中的稀有鉤鲫的总RNA，反转录为cDNA； (3)分别检测步骤⑵的两种cDNA中权利要求2或3所述基因或其片段的含量，如果两者具有显著差异待测水环境中疑似含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物，如果两者没有显著差异待测水环境中疑似不含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于检测步骤⑵的两种cDNA中权利要求2或3所述基因或其片段的含量的方法为荧光定量PCR;所述荧光定量PCR所用的引物为权利要求5或6所述的引物对；所述肾上腺激素为皮质醇；所述肾上腺激素干扰物为五氯酚。
9.权利要求2或3所述基因、扩增权利要求2或3所述基因或其片段的引物对在辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素或肾上腺激素干扰物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述肾上腺激素为皮质醇；所述肾上腺激素干扰物为五氯酚。
全文摘要
本发明公开了一种稀有鮈鲫α型Na+/K+-ATPase及其编码基因和应用。本发明提供的稀有鮈鲫α型Na+/K+-ATPase，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有Na+/K+-ATPase活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明还提供了所述蛋白质的编码基因，并设计了基于所述基因的特异引物对。在含有肾上腺激素干扰物的水环境中养殖，稀有鮈鲫的稀有鮈鲫α型Na+/K+-ATPase基因的表达量发生了变化，且具有剂量-效应关系，从而所述特异引物对可应用于辅助检测水环境中是否含有肾上腺激素干扰物。本发明的方法具有简便、快捷、准确的优点。
文档编号G01N21/64GK102757946SQ201110108639
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者杨丽华, 査金苗, 王子健 申请人:中国科学院生态环境研究中心