专利名称：合欢皮中抗肿瘤新生血管活性组分总皂苷的一种测定方法
技术领域：
利用HPLC检测合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的含量。本发明涉及从中药合欢皮中提取、水解总皂苷为齐墩果酸和HPLC检测齐墩果酸含量，以齐墩果酸含量代表总皂 苷含量，并且以齐墩果酸的含量为指标，采用L9(34)正交试验，考察酸的用量、水解时间、 酸的浓度、水解温度四个因素对水解程度的影响，确定合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的最佳水解条件。
背景技术：
HPLC(High-performance liquid chromatography (or high-pressure liquid chromatography))，即高压液相色谱法，是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4. 9X IO7Pa)色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。其具有高压、高速、高效和高灵敏度等特点，与经典液相色谱相比具有以下优点检测速度快，分辨率高，灵敏度高，柱子可反复使用，样品量少，容易回收等，并且最新的药典也要求对于合欢皮中皂苷类物质的检测必须使用HPLC，取代了之前的紫外分光光度法。正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均勻分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。 是一种高效率、快速、经济的实验设计方法，正交实验设计在很多领域的研究中已经得到广泛应用。本研究采用了四因素三水平的正交实验，以齐墩果酸的含量为考察指标，确定最优的水解工艺路线。目前，从合欢皮植物中分离得到的皂苷的结构类型均为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，且大多数具有3、16、21位羟基和28位羧基，皂苷多是苷元与几个单糖分子，最多的为10个单糖，以及二分子单萜烯酸(辛二烯酸衍生物)相结合。糖苷有单糖链，双糖链和三糖链，尚未发现在3、16、21及28位同时具有糖链的皂苷。所连接的单糖除常见葡萄糖、 阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、呋糖外还有少见的鸡纳糖及2-去氧-2-乙酰氨基葡萄糖。而从文献查阅可知，可以利用一定浓度的酸将齐墩果酸与单糖连接的酯键水解，从而得到苷元齐墩果酸[1、蔚冬红，乔善义，赵毅民.中药合欢皮研究概况.中国中药杂志.2004，29 (7) 6196-6201]合欢皮是合欢树的树皮，是我们常用的传统中药，具有解郁安神、活血消肿之功效 [2、国家药典委员会。中国药典第一部，中国医药科技出版社，北京，pp34]。现阶段，人们对合欢皮不同化学组分进行药理学研究，发现合欢皮有抗肿瘤作用其茎皮醇提取液中能有效地抑制血管内皮细胞，体外具有较强的肿瘤细胞毒活性。在以抗肿瘤新生血管的生理活性指标下，分离纯化得到了合欢皮提取物，定性鉴别分析确定了该活性组分群为皂苷类化合物。前期实验成果已经表明合欢皮中总皂苷为齐墩果烷型皂苷[3、李海涛，徐东铭，吕刚.合欢皮中三萜皂苷类化学成分的研究.长春中医药大学学报.2006,03(1) =62-64], 而我们实验室分离得到了单体合欢皂甙julibroside J8[4、Hui Hua, Lei Feng, Lian-fen Zhang and Jian Jin. Anti-angiogenic activity of julibroside J8,anatural product isolated from Albizia julibrissin. 2009,16(8) :703-711] 有报道称可以通过酸水解将总皂苷水解成苷元，即齐墩果酸[5、李梦.HPLC法测定女贞子中齐墩果酸的含量.安徽农业科学，2008，36 04) :10519-10526. 6、刘成红，魏萍，张淑兰.高效液相色谱法测定山茱萸中马钱苷的含量.解放军药学学报，2007，21 O) 144] 0由于目前尚未有通过国家鉴定的合欢皮总皂苷标准品，本实验选用齐墩果酸为参照标准品，通过酸水解合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷，得到齐墩果酸苷元，建立合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的HPLC含量测定方法，以齐墩果酸的含量标定总皂苷的含量，同时对该方法进行可行性分析。
发明内容
本发明的目的是发明建立合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的一种测定方法。本发明的技术方案所述合欢皮提取物的制备方法，取合欢皮，粉碎，加乙醇溶液，加热回流，冷却过滤，旋转蒸发至干，去离子水复溶，冻干，取冻干粉，加水溶解，水饱和正丁醇萃取三次，旋干，加水复溶，真空干燥，得提取物。所述总皂苷水解方法，取一定量样品加硫酸，水浴加热，过滤，将沉淀水洗至中性， 再于烘箱中烘干。石油醚回流提取，合并回流液，旋干，加甲醇溶解旋干，最后用甲醇定容，所述建立HPLC测定齐墩果酸的方法，用甲醇配制一定浓度的齐墩果酸对照品，进不同体积对照品，以齐墩果酸进样量(yg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并进行回归分析，得到同归方程。所述正交实验因素和水平的选择，考察酸的用量、水解时间、酸的浓度、水解温度四个因素，每个因素选择三个水平进行L9 (34)正交实验。所述HPLC测定的条件考察，分别进行精密度实验、稳定性实验、重现性实验和加样回收率实验。所述的最佳工艺路线，将测得的样品含量结果进行方差分析，确定最佳的一条工艺路线。本发明的有益效果本发明齐墩果酸作为参照标准品，通过酸水解合欢皮中抗肿瘤新生血管活性的总皂苷，得到齐墩果酸苷元，建立合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的HPLC含量测定方法，以齐墩果酸的含量标定总皂苷的含量，而已报道的一些研究均是利用紫外分光光度法定量分析合欢皮中的总皂苷，该方法虽操作简便、灵敏度准确度高，但专属性较差，并且未能通过中药的新药申报审批，由于在中药新药申报过程中的成品含量测定中，需要采用专属性强的方法测定制剂中的具体指标成分。因此建立合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的HPLC含量测定方法，是中报中药新药的必须条件，但是由于市场上还没总皂苷标准品， 所以此方法是测定合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的可靠方法。
图丨齐墩果酸标准品图2水解样品
具体实施例方式实施例1 合欢皮中抗肿瘤新生血管活性有效部位的提取工艺50g合欢皮用500mL75%乙醇回流两次，每次池，冷却后，过滤，滤液旋转蒸发至干，去离子水复溶，冻干，后取冻干粉lg，IOOml水溶解，等体积水饱和正丁醇萃取三次，合并正丁醇相。旋转蒸发至干，加水复溶，真空干燥，得干粉，备用。实施例2 合欢皮中抗肿瘤新生血管活性总皂苷的水解工艺首先进行单因素实验选择水解能力最好的酸，分别选择乙酸、盐酸和硫酸进行水解，结果显示硫酸的水解效果最好。再分别从酸的用量、水解时间、酸的浓度、水解温度四个因素，每个因素选择三个水平，以齐墩果酸含量为指标，考察水解工艺，即进行L9 (34)正交实验，L9 (34)因素水平见下表。
权利要求
1.权利要求合欢皮中抗肿瘤新生血管活性组分总皂苷含量的测定方法。
2.权利要求1所述的抗肿瘤新生血管活性组分总皂苷，其特征是所述的活性成分来源于合欢皮 AlbizziaJulibrissin Durazz0
3.根据权利1所述的合欢皮中抗肿瘤新生血管活性组分总皂苷含量测定，其特征是利用HPLC检测合欢皮中抗肿瘤新生血管活性组分总皂苷的含量。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征是将用一定浓度的酸将皂苷水解为齐墩果酸，建立HPLC齐墩果酸标准品的检测方法，以齐墩果酸含量代表抗肿瘤新生血管活性组分总皂苷的含量。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述测定方法可以用于来自于合欢皮中与新生血管有关的活性组分总皂苷的测定，与血管新生有关的疾病癌症和/或癌症转移， 血管瘤，血管纤维瘤，新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞，视网膜变性，晶体后纤维组织增生，颗粒性结膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黄斑和黄斑变性，牛皮癣，老年盘状斑变性及风湿性关节炎，银屑病，毛细管扩张，脓性肉芽肿，伤口愈合中抑制斑痕形成，动脉粥样硬化，脂溢性皮炎和痤疮。
全文摘要
本发明涉及合欢皮中抗肿瘤新生血管活性组分总皂苷的HPLC测定方法，通过前期提取合欢皮中抗肿瘤新生血管活性组分，然后将其中的总皂苷酸解为苷元齐墩果酸，最后利用HPLC检测所得齐墩果酸苷元的含量，以齐墩果酸含量代表合欢皮中抗肿瘤新生血管活性组分总皂苷含量，再进行L9(34)正交试验筛选最佳工艺路线。本发明以齐墩果酸含量为指标，选择一条齐墩果酸苷元得率最高的水解工艺路线。本发明对于测定合欢皮中抗肿瘤新生血管活性组分总皂苷的含量具有很高的专属性和灵敏度，可用于检测该组分制剂中总皂苷的含量。
文档编号G01N30/02GK102331457SQ20111011603
公开日2012年1月25日 申请日期2011年5月6日 优先权日2011年5月6日
发明者冯磊, 施建军, 谭莹, 邱丽颖, 金坚 申请人:江南大学