专利名称：一种基于矩阵分析的荧光光谱解谱方法
技术领域：
本发明涉及荧光颜料作为标记物质的荧光光谱解谱方法，属于微量分析技术领域。
背景技术：
DNA测序是现代分子生物研究中的重要技术，而电泳技术是DNA测序中必不可少的技术手段。由于毛细管具有良好的散热效能，允许在毛细管两端加上高至30kV的电压， 分离毛细管的纵向电场强度可达到400V/cm以上，因而分离操作可以在很短的时间内完成，达到非常高的分离效率(理论塔板数达到400000/m以上，最高达107/m数量级)。毛细管电泳技术达到了仪器分析所要求的高效，快速，样品用量少等最基本和最优异的特点。为了提高毛细管检测的通量，毛细管阵列作为高通量电泳分析手段被广泛应用于生物化学分析中。对于单个毛细管中多色荧光染料的同时检测或毛细管阵列中多色荧光染料的同时检测，由于荧光标记物的荧光谱带比较宽，造成不同荧光光谱之间的很大重叠，通过普通的分光很难将它们很好的区分开，若采用把光谱展得很宽以获得较高的分辨能力的方法，会使荧光强度随之降低，探测灵敏度和信噪比就成为了难题，造成了毛细管电泳分析的很大误差。在生物识别技术中也常需用到荧光颜料作为标记物质，目前发现和使用的荧光颜料的光谱带宽都在20nm以上，在荧光颜料选择与组合设计中，尽管不同颜料的受激发射波长各不相同，但在目前常用的颜料组合中其受激发射光波长范围之间相互重叠的现象是避免不了的，这使得在采集一种颜料的荧光信息号时必然含有另一种或多种其它颜料的荧光信息。为实现对荧光颜料检测信号的特异性分析，必需进行校正处理。目前尚没有解决这一问题的方法
发明目的有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种兼顾荧光强度和分辨能力的基于矩阵分析的荧光光谱解谱方法，以实现对荧光颜料检测信号的特异性分析，。本发明提供的一种基于矩阵分析的荧光光谱解谱方法，包括激光束照射毛细管激发毛细管中荧光染料产生荧光光谱，所述荧光光谱经过成像装置成像在电荷耦合元件面阵CCD上，将所用η种荧光标记物分别在所述面阵CCD上成像，得到η种荧光在所述CCD上的光谱分布，将每种荧光落在象素为m的面阵CCD每个象素上的荧光强记录下来，得到mXη 的矩阵P，对矩阵P进行归一得到矩阵Q = (Qij)mXn，通过Q矩阵对所用荧光染料在CXD上的成像组合进行光谱解谱，其中n、m均为自然数。进一步，所述对矩阵P进行归一是设定每种荧光落在各个象素上光强最大值为1， 其他各个象素上的光强对最大值约化归一进一步，所述象素为象素组合bin，整个面阵CXD分成m个bin，m >如。进一步，所述bin大小为14像素X 3像素。进一步，所述荧光在CXD上的成像组合为用于单根毛细管中多种荧光检测的线阵 CCD。
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进一步，所述荧光在CXD上的成像组合为用于毛细管阵列荧光检测的面阵(XD。本发明方法实现的前提是所使用的标记物之荧光特性是已知的，就是在进行荧光探测前要对荧光谱进行光谱定标，即要知道每种所用标记颜料受激发射荧光光谱在CCD上单独成像的光谱分布，根据这种光谱分布得到荧光光谱的分布矩阵，对矩阵归一后就可以用归一矩阵对所探测的组合荧光谱进行解谱，以得到所期望的荧光谱图。荧光颜料的受激发射荧光光谱带较宽且强度很弱，通过一次分光并聚焦在面阵 CCD上很难使多条荧光谱线很好的区分开，为了获得更高的分辩率可以把光谱展得很宽，但是荧光分布在CCD上的照度会严重减弱，所采集信号的灵敏度和信噪比会下降很多。如果光谱展开的过窄，在CXD面上的荧光照度就会很强，则荧光光谱重叠就会更加严重，甚至无法判读光谱峰位，解谱成为难题。为了兼顾以上两个方面，一般仪器都采用光电倍增管来代替CCD。这就要同时采用多个光电倍增管，使得分光系统变得很复杂。针对荧光信号灵敏度和光谱解谱两个相互制约的难题，采用了光谱定标的方法进行CCD信号处理。采用该方法无需关注光谱的展宽程度，只要所用荧光光谱形状不完全重合，强度分布存在差异，就可以通过光谱定标的方法得到各种荧光的相对强度，同时把CCD上所有的感光信号都有效利用起来，从而增加CCD的灵敏度，提高荧光信号的信噪比。用光谱定标对面阵CCD上荧光信号进行解谱的步骤如下。首先了解所用荧光标记物有几种，设定为η种。使得η种标记荧光分别分光后在面阵CCD上聚焦成像，得到这η种荧光在CCD上的光谱分布，设线阵CCD上的象素为m。把每种荧光落在CXD每个象素上的荧光强记录下来，得到一个mXn的矩阵P。由于每种标记物被激发的荧光强度差别很大，为了后期进行信号处理的方便，对矩阵P进行归一，如设定每种荧光落在各个象素上光强最大值为1，其他各个象素上的光强对最大值约化归一，可以得到矩阵Q = (Qij)mxn通过Q矩阵可以对所用荧光在CXD上的成像组合进行光谱解谱了。如某时刻从 CCD各个象素上采的荧光光强分布为一 mX 1矩阵B，每种荧光的相对强度是一个ηX 1矩阵 X，则QX = B(1)进行矩阵变换得到X = (QtQ) — (QtB)(2)从上式可以得知，当得到了光谱定标矩阵Q后，只要得到任意时刻荧光落在面阵 CCD上各个象素的强度分布矩阵B，就可以通过光谱定标得到各种荧光的相对强度分布，从而得到所用荧光的光谱信息。在下面的实验中可以看出，即使CCD上的荧光光谱重叠很严重，峰位判读出现困难，在这种情况下也可以通过这种方法得到很好的荧光谱图。CXD上得到的荧光数据在没有峰形和分辨率非常差的情况下，通过光谱定标的方法也能很好的得到四种荧光强度分布的相对值。另外，CCD上荧光强度很弱的一帧数据，通过光谱定标，把每种荧光落在各个bin上的信号收集起来，得到的荧光强度有了很大的改善。综合以上两个优点，用荧光光谱定标的方法进行荧光光谱数据处理可以大大降低对荧光检测前分光系统的苛求。通过四种荧光在CCD上的分布像特征来得到四种荧光的强度分布，也就是说不需要通过峰值和峰位的准确判读来得到每种荧光的强度分布，所有落到CCD上的荧光都得到有效利用，使得光谱解谱对荧光强度的依赖程度降低了近一个数量级。本发明的有益效果(1)采用荧光染料组合矩阵实现单个毛细管中多色荧光染料的同时检测；(2)可以回收荧光染料分散在线阵CCD上所有象素上的有效光，光谱利用率高；(3)可以采用象素组合的方式提高分布矩阵的稳定性，减少计算量，提高检测的稳定性；(4)可以应用与线阵C⑶检测实现单根毛细管的荧光检测，也可以应用于面C⑶上实现毛细管阵列的荧光分光处理；(5)本发明方法实现装置结构简单，易操作。
图1是光谱定标示意图；图2是四色荧光校正矩阵图；图3是某时刻CCD上一帧荧光光谱图(a和b各为一帧荧光光谱图)；图4是图3经过光谱校正矩阵2定标后的相对荧光光强分布图。1-激光束，2-荧光染料，3-毛细管，4-荧光光谱，5-线阵(XD。
具体实施例方式现结合附图及实施例对本方法作进一步详细说明。参考图1是本发明方法的实现示意图。当荧光染料2通过毛细管3的检测窗口时被激光束1激发，荧光光谱4经过成像装置成像在线阵(XD5上。用光谱定标对面阵CCD上荧光信号进行解谱的步骤如下。首先了解所用荧光标记物有几种，设定为η种。使得η种标记荧光分别分光后在面阵CXD上聚焦成像，得到这η种荧光在C⑶上的光谱分布，为了数据处理方便，把整个面阵CXD分成若干个小块(如每14像素X 3像素为一块)，标记为bin，假定总共用到m个 bin, 一般m >如。把每种荧光落在CXD每个bin上的荧光强记录下来，得到一个mXn的矩阵P。由于每种标记物被激发的荧光强度差别很大，为了后期进行信号处理的方便，对矩阵 P进行归一，如设定每种荧光落在各个bin上光强最大值为1，其他各个bin上的光强对最大值约化归一，可以得到矩阵(如图2所示)，Q = (Qij)mxn通过Q矩阵可以对所用荧光在CXD上的成像组合进行光谱解谱了。如某时刻从 CXD各个bin上采的荧光光强分布为一 mX 1矩阵B，每种荧光的相对强度是一个nX 1矩阵 X，则QX = B(1)进行矩阵变换得到X= (QTQ)^1(QTB)(2)从上式可以得知，当得到了光谱定标矩阵Q后，只要得到任意时刻荧光落在面阵 CCD上各个bin的强度分布矩阵B (如图3所示)，就可以通过光谱定标得到各种荧光的相对强度分布(如图4所示)，从而得到所用荧光的光谱信息。在下面的实验中可以看出，即使CCD上的荧光光谱重叠很严重，峰位判读出现困难，在这种情况下也可以通过这种方法得到很好的荧光谱图。CXD上得到的荧光数据在没有峰形和分辨率非常差的情况下，通过光谱定标的方法也能很好的得到四种荧光强度分布的相对值。另外，CCD上荧光强度很弱的一帧数据，通过光谱定标，把每种荧光落在各个bin上的信号收集起来，得到的荧光强度有了很大的改善。综合以上两个优点，用荧光光谱定标的方法进行荧光光谱数据处理可以大大降低对荧光检测前分光系统的苛求。通过四种荧光在CCD上的分布像特征来得到四种荧光的强度分布，也就是说不需要通过峰值和峰位的准确判读来得到每种荧光的强度分布，所有落到CCD 上的荧光都得到有效利用，使得光谱解谱对荧光强度的依赖程度降低了近一个数量级。尽管通过参照发明的某些优选实施例，已经对发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.一种基于矩阵分析的荧光光谱解谱方法，包括激光束照射毛细管激发毛细管中荧光染料产生荧光光谱，所述荧光光谱经过成像装置成像在电荷耦合元件面阵CCD上，其特征在于，将所用η种荧光标记物分别在所述面阵CCD上成像，得到η种荧光在所述CCD上的光谱分布，将每种荧光落在象素为m的面阵CCD每个象素上的荧光强记录下来，得到mXn 的矩阵P，对矩阵P进行归一得到矩阵Q = (Qij)mXn，通过Q矩阵对所用荧光染料在CXD上的成像组合进行光谱解谱，其中n、m均为自然数。
2.按照权利要求1所述一种基于矩阵分析的荧光光谱解谱方法，其特征在于，所述对矩阵P进行归一是设定每种荧光落在各个象素上光强最大值为1，其他各个象素上的光强对最大值约化归一
3.按照权利要求1所述一种基于矩阵分析的荧光光谱解谱方法，其特征在于，所述象素为象素组合bin，整个面阵CXD分成m个bin，m >如。
4.按照权利要求2所述一种基于矩阵分析的荧光光谱解谱方法，其特征在于，所述bin 大小为14像素X 3像素。
5.按照权利要求1所述一种基于矩阵分析的荧光光谱解谱方法，其特征在于，所述荧光在CXD上的成像组合为用于单根毛细管中多种荧光检测的线阵(XD。
6.按照权利要求1所述一种基于矩阵分析的荧光光谱解谱方法，其特征在于，所述荧光在CXD上的成像组合为用于毛细管阵列荧光检测的面阵(XD。
全文摘要
本发明提供一种基于矩阵分析的荧光光谱解谱方法，包括激光束照射毛细管激发毛细管中荧光染料产生荧光光谱，所述荧光光谱经过成像装置成像在电荷耦合元件面阵CCD上，将所用n种荧光标记物分别在所述面阵CCD上成像，得到n种荧光在所述CCD上的光谱分布，将每种荧光落在象素为m面阵CCD每个象素上的荧光强记录下来，得到m×n的矩阵P，对矩阵P进行归一得到矩阵Q＝(Qij)m×n，通过Q矩阵对所用荧光染料在CCD上的成像组合进行光谱解谱，其中n、m均为自然数。本发明方法可以回收荧光染料分散在线阵CCD上所有象素上的有效光，光谱利用率高；采用象素组合的方式提高分布矩阵的稳定性，减少计算量，提高了检测的稳定性。
文档编号G01N21/64GK102262081SQ20111018963
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者张涛, 李彬, 贾二惠, 赵怡鹤, 陈学亮 申请人:公安部第一研究所, 北京中盾安民分析技术有限公司