专利名称：新疆小麦地方品种鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种新疆小麦地方品种鉴别方法，属于农业技术领域。
背景技术：
应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术，分析小麦品种高分子量麦谷蛋白亚基编码的Glu-Al、Glu-Bl和Glu-Dl，这种鉴定方法能将各亚基很好分离， 明确基因定位，用它的电泳图谱去鉴定小麦品质。此外，还可以利用分子标记技术、高分子量谷蛋白亚基酸性毛细管电泳(A-CE)与高低分子量谷蛋白亚基质谱(MQ等鉴定方法鉴定小麦品质。SDS-PAGE技术在品种鉴定中具有较大的应用潜力，为育种材料评价和杂交后代高分子量谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择，提供了一种简单、准确、快速的实用方法。有样品用量少，提取方法简单，无有毒试剂，分离迅速，分辨率高、检测灵敏度高等特点，但是， 由于电泳图谱上亚基的迁移率与分子量并不总是一致，从而混淆分子量不同而迁移率相似的亚基，因此在精确度上有待进一步提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术不足提供一种新疆小麦地方品种鉴别方法。新疆小麦地方品种鉴别方法，包括以下步骤Al、麦谷蛋白的提取1)小麦种子单粒磨成细粉，称重20mg放入1.5ml的试管中，加入1. OmlSA溶液 (50%丙酮和0.8摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl pH 8. 0))，在65°C条件下培养 lh；2)离心机中于2000rpm条件下离心lmin，去上清液，重复此操作过程1次；3)加入200 μ 1的SAl溶液(在SA溶液中加入1 %甘油)，，并在涡流震荡器上混勻；4)在65°C条件下培养lh，在13000rpm条件下离心IOmin ；5)取100 μ 1的上清液，加入同样体积的SA2溶液(SA溶液中加入1. 4%乙烯基吡啶)，在65°C条件下继续培养30min后，加入0. 8ml的丙酮，在13000rpm条件下离心IOmin ；6)去上清液，沉积物在60°C条件下干燥5min，加入100 μ 1的SC溶液(20%甘油， 6摩尔尿素和25毫摩尔醋酸)；7)加入样品缓冲液十二烷基硫酸钠，62. 5毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸 (ρΗ6. 8)，10%甘油，5% 2-巯基乙醇和溴酚蓝)，混合物煮沸3min，作为SDS-PAGE分析样品保存；A2、SDS-PAGE 电泳1)麦谷蛋白通过SDS-PAGE(10%分离胶(10. 3%丙烯酰胺，1. 02%甲叉双丙烯酰胺，0.375摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6. 8)，0.2%十二烷基硫酸钠，0.033%过硫酸铵和0. 05%四甲基乙二胺的混合液)和5%的积层胶(5. 0%丙烯酰胺，0. 5%甲叉双丙烯酰胺，0. 125摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6. 8)，0.02%十二烷基硫酸钠，0.033%过硫酸铵和0. 四甲基乙二胺))分离纯化；2)聚丙烯凝胶规格为HcmX IOcmX Imm ；3)电泳缓冲液为(192毫摩尔甘氨酸，25毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0. 1% 十二烷基硫酸钠)，在20毫安电流下电泳6小时；4)凝胶通过考马斯亮蓝G250溶液来染色，用离子交换水冲洗直至背景清晰；A3、判读SDS-PAGE图谱通过分析SDS-PAGE图谱，鉴定新疆小麦地方品种高分子量麦谷蛋白亚基组成。通过此方法，在新疆小麦地方品种中鉴定了一个新的亚基，新的亚基命名为亚基 Glu-Dl (2. 6+12) bp (t)。为育种材料评价和杂交后代高分子量麦谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择，提供了一种简单、准确、快速的实用方法。样品用量少，提取方法简单，无有毒试剂，分离迅速，分辨率高、检测灵敏度高等特点，但是，由于电泳图谱上亚基的迁移率与分子量并不总是一致，从而混淆分子量不同而迁移率相似的亚基，因此在精确度上有待进一步提尚。
图1为新疆小麦地方品种(含有2. 6+12亚基)与日本小麦品种(含有2. 2+12亚基)SDS-PAGE 图谱；1. tz Iv b 二 W 2.金包银 3.农林61 4.红壳冬麦 5.么< 々办 6.红冬麦 7. ^ Lh Zts^ 8.白冬麦 9.中国春。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。一、鉴定方法1、麦谷蛋白的提取1)小麦种子单粒磨成细粉，称重20mg放入1.5ml的试管中，加入LOmlSA溶液(IOOmlSA溶液配置方法，用40ml蒸馏水溶解9. 6912g三羟甲基氨基甲烷，再加入 50ml99. 9%丙酮溶液定容至100ml，而后用盐酸将pH值调配到8.0。)在65°C条件下培养 lh。2)离心机中于2000rpm条件下离心lmin，去上清液，重复此操作过程1次。3)加入200 μ 1的SAl溶液(IOOmlSAl溶液配置方法，在IOOmlSA溶液中加入Ig
二硫苏糖醇)，并在涡流震荡器上混勻。4)在65°C条件下培养lh，在13000rpm条件下离心lOmin。5)取100 μ 1的上清液，加入同样体积的SA2溶液(100mlSA2溶液配置方法，在 IOOmlSA溶液中加入1.4g乙烯基吡啶，用磁力搅拌器搅拌溶解)，在65°C条件下继续培养 30min后，加入0. 8ml的丙酮，在13000rpm条件下离心IOmin06)去上清液，沉积物在60°C条件下干燥5min，加入100 μ 1的SC溶液(IOOmlSC溶液是由20%甘油，6Μ尿素和25mmol/L醋酸混合配置而成，即称取36. 036g尿素溶于60ml蒸馏水中，在加入20ml甘油，然后量取2. 5ml IM醋酸溶液加水定容至100ml)。7)加入样品缓冲液十二烷基硫酸钠，62.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸 (pH6. 8)，10%甘油，5% 2-巯基乙醇和溴酚蓝)，混合物煮沸3min，作为SDS-PAGE分析样品保存。2、SDS-PAGE 电泳1)麦谷蛋白通过SDS-PAGE(10%分离胶(10. 3%丙烯酰胺，1. 02%甲叉双丙烯酰胺，0.375摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6. 8)，0.2%十二烷基硫酸钠，0.033%过硫酸铵和0. 05%四甲基乙二胺的混合液)和5%的积层胶(5. 0%丙烯酰胺，0. 5%甲叉双丙烯酰胺，0. 125摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6. 8)，0.02%十二烷基硫酸钠，0.033%过硫酸铵和0. 四甲基乙二胺))分离纯化。2)聚丙烯凝胶规格为14cmX IOcmX 1謹。3)电泳缓冲液为(192mM甘氨酸，25mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0. 十二烷基硫酸钠)，在20毫安电流下电泳6小时。4)凝胶通过考马斯亮蓝G250溶液来染色，用离子交换水冲洗直至背景清晰。3、判读 SDS-PAGE 图谱通过分析SDS-PAGE图谱，鉴定新疆小麦地方品种高分子量麦谷蛋白亚基组成。二、鉴定依据应用SDS-PAGE技术，以高分子量麦谷蛋白亚基标准品种=Chinese Spring (null, 7+8，2+12)，Norin 61 (2*，7+8，2. 2+12)，Eradu(1，17+18，2+12)，Cadoux(2*,13+16,2+12), Harunoakebono (2*，7+9，5+10)和 Harunoakebono 的近等基因系的替代亚基(2+12)，(6+8)， (17+18)，(20)或G+12)为对照材料，判读SDS-PAGE图谱，对新疆小麦地方品种的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GQ组成进行判读。三、鉴定结果小麦地方品种的种子贮藏蛋白的电泳模式通过SDS-PAGE方法显示，在Glu-Dl位点，我们发现了一个新的亚基，其与亚基12共同表达，新的亚基比2. 2亚基分子量稍大，把新的亚基命名为亚基Glu-Dl (2. 6+12) bp (t)，分子量大约是160kd，其比亚基2. 2更大(图 1)。这意味着这个亚基在目前所知的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GQ中是最大的。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.新疆小麦地方品种鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤Al、麦谷蛋白的提取1)小麦种子单粒磨成细粉，称重20mg放入1.5ml的试管中，加入1. OmlSA溶液(50% 丙酮和0.8摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl pH 8. 0))，在65°C条件下培养Ih;2)离心机中于2000rpm条件下离心lmin，去上清液，重复此操作过程1次；3)加入200μ1的SAl溶液(在SA溶液中加入甘油)，并在涡流震荡器上混勻；4)在65°C条件下培养lh，在13000rpm条件下离心IOmin；5)取100μ 1的上清液，加入同样体积的SA2溶液(SA溶液中加入1. 4%乙烯基吡啶)， 在65°C条件下继续培养30min后，加入0. 8ml的丙酮，在13000rpm条件下离心IOmin ；6)去上清液，沉积物在60°C条件下干燥5min，加入100μ 1的SC溶液(20%甘油，6摩尔尿素和25毫摩尔醋酸)；7)加入样品缓冲液O%十二烷基硫酸钠，62. 5毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸 (ρΗ6. 8)，10%甘油，5% 2-巯基乙醇和溴酚蓝)，混合物煮沸3min，作为SDS-PAGE分析样品保存；A2、SDS-PAGE 电泳1)麦谷蛋白通过SDS-PAGE(10%分离胶(10.3%丙烯酰胺，1. 02%甲叉双丙烯酰胺， 0. 375摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6. 8)，0.2%十二烷基硫酸钠，0.033%过硫酸铵和 0. 05%四甲基乙二胺的混合液)和5%的积层胶(5.0%丙烯酰胺，0.5%甲叉双丙烯酰胺， 0. 125摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6. 8)，0.02%十二烷基硫酸钠，0.033%过硫酸铵和0. 四甲基乙二胺))分离纯化；2)聚丙烯凝胶规格为14cmXIOcmX Imm ；3)电泳缓冲液为(192毫摩尔甘氨酸，25毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0.十二烷基硫酸钠)，在20毫安电流下电泳6小时；4)凝胶通过考马斯亮蓝G250溶液来染色，用离子交换水冲洗直至背景清晰；A3、判读SDS-PAGE图谱通过分析SDS-PAGE图谱，鉴定新疆小麦地方品种高分子量麦谷蛋白亚基组成。
全文摘要
本发明公开了新疆小麦地方品种鉴别方法，应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术，在新疆小麦地方品种中鉴定了一个新的亚基，新的亚基命名为亚基Glu-D1(2.6+12)bp(t)，为育种材料评价和杂交后代高分子量麦谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择，提供了一种简单、准确、快速的实用方法。样品用量少，提取方法简单，无有毒试剂，分离迅速，分辨率高、检测灵敏度高等特点，但是，由于电泳图谱上亚基的迁移率与分子量并不总是一致，从而混淆分子量不同而迁移率相似的亚基，因此在精确度上有待进一步提高。
文档编号G01N27/447GK102323321SQ20111027029
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者丛花, 严勇亮, 王宏飞, 章艳凤 申请人:新疆农业科学院农作物品种资源研究所