专利名称：一种软紫草和硬紫草的液相-圆二色谱(lc-cd)鉴定方法
技术领域：
本发明涉及软紫草和硬紫草的鉴定技术，特别的涉及液相-圆二色谱(LC-CD)准确地鉴定软紫草和硬紫草药材和提取物(包括含有紫草的复方中药、萘醌类成分单体)的方法。
背景技术：
紫草在我国有悠久的药用历史，其味甘咸，性寒，归心包络肝经，有凉血、活血、清热、解毒等功效，中医临床主要用于湿性斑疹、紫癜、血尿、淋浊和血痢、热结便秘、烧伤、湿疫、丹毒、痈瘍等病。紫草(RadixArnrbiae, Radix Lithospermi)为紫草科(Boraginaceae)植物新疆紫草 Arnebiaeuchroma (Royle) Johnst.、紫草 Lithospermum erythrorhizon Sieb.etZucc.或内蒙紫草Arnebiaguttata Bunge的干燥根[1]。其中新疆紫草又名软紫草,紫草或内蒙紫草又称硬紫草，软紫草和硬紫草是药用紫草的主要来源。文献报道表明[2’3]，紫草中含有多种化学成分，包括紫草萘醌类、酚酸类、生物碱类、苯酚及苯醌类、三萜酸及留醇类、黄酮类以及多糖类等物质。其中研究最多的是紫草萘醌类化合物，国内外学者从不同种属紫草植物的根中分离得到多种萘醌化合物，如:β -羟基异戊酰紫草素、紫草素、2，3_ 二甲基戊烯酰紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素、异丁酰紫草素、α-甲基-正丁酰紫草素、异戊酰紫草素、去氢阿卡宁(去氢异紫草素)、去氧紫草素、β，β -二甲基丙烯酰阿卡宁、β -乙酰氧基异戊酰阿卡宁、β -羟基异戊酰阿卡宁等。天然存在的紫草萘醌有两种光学异构体，一种为R型(命名为紫草素类)，一种为S型(命名为阿卡宁类)，它们 互为对映体[4’5]。
权利要求
1.一种软紫草和硬紫草的液相-圆二色谱(LC-CD)鉴定方法，其特征是利用高效液相色谱(HPLC)技术，分离出紫草中的萘醌类衍生物，再利用圆二色谱(CD)检测它们的圆二色性，利用圆二色色谱图中的峰的正负特性鉴定软紫草和硬紫草。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征为圆二色谱(CD)检测波长范围为:210_240nm,250_300nm,325_400nm 和 450-600nm,200_210nm,240_240nm,300_325nm,400_450nm。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征是圆二色谱(CD)检测波长为:220nm，245nm,260nm,310nm,360nm,430nm 和 550nm。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征是圆二色谱(CD)检测波长为:220nm，245nm,260nm 和 550nm。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征是 1.色谱条件:色谱柱为 Scienhome Kromasil C18 (4.6mmX 200mm, 5 μ m)及预柱，流动相为乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脱过程(A梯度)0-10分钟70%，10-30分钟70 % -75%, 30-31 分钟 75 % -95%, 31-36 分钟 95 %，36-37 分钟 95 % -70%, 37-50 分钟70%;检测波长 274nm (或者 220nm，245nm, 260nm, 310nm, 360nm, 430nm 和 550nm)，柱温 30 °C，流速1.0mL/min，理论板数以萘醌计不低于3000 ;其紫外光谱的回归方程、线性范围、最低检测限和定量限符合检测误差要求； .样品溶液的配置方法1:精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)溶解，经装填ODS (十二烷基键合硅胶)的SPE小色谱柱预处理，水(或者低浓度有机溶剂)洗脱除杂，继用乙腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)洗涤，合并洗脱液，甲醇溶解，定容，过滤，即得； ii1.样品溶液的配置方法2:精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇溶解，定容，过滤，即得； iv.样品溶液的配置方法3:精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，过滤，即得； V.测试方法:进行高效液相色谱(HPLC)分析，以圆二色谱(CD)为检测，记录色谱图；软紫草和硬紫草样品各波长处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图中色谱峰的符号不同，具体特征如下: 在220nm，274nm, 360nm和550nm处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图，软紫草中各个色谱峰为负峰，硬紫草中各个色谱峰为正峰； 在245nm，310nm和430nm处测定的液相-圆二色谱(LC-⑶)色谱图，软紫草中各个色谱峰为正峰，硬紫草中各个色谱峰为负峰。
利用圆二色色谱图中的峰的正负特性鉴定软紫草和硬紫草。
6.一种软紫草和硬紫草的液相-圆二色谱(LC-CD)鉴定方法，其特征是利用高效液相色谱(HPLC)分离出紫草中的萘醌类衍生物，再利用圆二色谱(CD)和紫外光谱(UV)同时检测，根据紫外色谱峰的峰面积计算对映异构体总含量，根据紫外色谱峰的峰面积计算对映异构体总含量，利用圆二色色谱图中的峰的正负，鉴定软紫草和硬紫草。
7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征为圆二色谱(CD)检测波长范围为:210_240nm,250_300nm,325_400nm 和 450-600nm,200_210nm,240_240nm,300_325nm,400-450nm ;紫外光谱(UV)检测波长范围为200-300nm和400_600nm。
8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征是圆二色谱(CD)检测波长为:220nm，245nm, 260nm, 310nm, 360nm, 430nm 和 550nm,最优选检测波长为:220nm, 245nm, 260nm 和550nmo
9.根据权利要求8所述的鉴定方法，其特征为: i.色谱条件:色谱柱为 Scienhome Kromasil C18 (4.6mmX 200mm, 5 μ m)及预柱，流动相为乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脱过程(A梯度)0-10分钟70%，10-30分钟70 % -75%, 30-31 分钟 75 % -95%, 31-36 分钟 95 %，36-37 分钟 95 % -70%, 37-50 分钟70%;检测波长 274nm (或者 220nm，245nm, 260nm, 310nm, 360nm, 430nm和 550nm)，柱温 30°C，流速1.0mL/min，理论板数以萘醌计不低于3000 ;其紫外光谱的回归方程、线性范围、最低检测限和定量限符合检测误差要求； ii.样品溶液的配置方法1:精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)溶解，经装填ODS (十二烷基键合硅胶)的SPE小色谱柱预处理，水(或者低浓度有机溶剂)洗脱除杂，继用乙腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)洗涤，合并洗脱液，甲醇溶解，定容，过滤，即得； ii1.样品溶液的配置方法2:精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇溶解，定容，过滤，即得； iv.样品溶液的配置方法3:精密称取软紫草或硬紫草样品(药材、提取物、化学成分单体、含有紫草的复方中药等)各适量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、环己烷等有机溶剂及其不同浓度的水溶液)提取，过滤，即得； V.测试方法:进行高效液相色谱(HPLC)分析，以圆二色谱(CD)为检测，记录色谱图；软紫草和硬紫草样品各波长处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图中色谱峰的符号不同，具体特征如下: 在220nm，274nm, 360nm和550nm处测定的液相-圆二色谱(LC-CD)色谱图，软紫草中各个色谱峰为负峰，硬紫草中各个色谱峰为正峰； 在245nm，310nm和430nm处测定的液相-圆二色谱(LC-⑶)色谱图，软紫草中各个色谱峰为正峰，硬紫草中各个色谱峰为负峰； 波长为274nm处进行紫外检测，并记录色谱图； 根据紫外色谱峰的峰面积计算对映异构体总含量，利用圆二色色谱图中的峰的正负，鉴定软紫草和硬紫草。
10.根据权利要求1-9任一所述的鉴定方法，其特征是该方法还可以用来鉴定软紫草和硬紫草提取物、含 有紫草的复方中药、萘醌类成分单体。
全文摘要
本发明涉及软紫草和硬紫草的鉴定技术，利用软紫草和硬紫草分别含有的卡宁对映异构体，在液相-圆二色谱(LC-CD)中的相反关系，建立了液相-圆二色谱(LC-CD)准确地鉴定软紫草和硬紫草药材和提取物(包括含有紫草的复方中药、萘醌类成分单体)的方法，从而，提供了一种准确地鉴定和区分软紫草和硬紫草药材和提取物(包括含有紫草的复方中药、萘醌类成分单体)的方法。
文档编号G01N30/88GK103175928SQ20111028536
公开日2013年6月26日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者王金辉, 刘珂, 李国玉, 冯文文, 郎跃武 申请人:山东靶点药物研究有限公司