专利名称：一种基于nad(p)h荧光的醇脱氢酶的筛选鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种基于NAD(P)H荧光的醇脱氢酶的筛选鉴定方法，适用于所有以 NAD(H)或NADP (H)为辅酶的醇脱氢酶。
背景技术：
醇脱氢酶(ADHs，Ε. C. 1. 1. 1. 1)是以NAD (H)或NADP (H)为辅酶进行电子转移，催化醇的氧化或酮、醛还原的酶类。醇脱氢酶广泛地存在于细菌、酵母和霉菌等微生物中，在胞内代谢中具有重要的生理意义。醇脱氢酶也是一类重要的生物催化剂，可通过选择性氧化或不对称还原制备药物中间体-手性醇，在生物化工和工业催化领域正得到越来越大的应用。目前，筛选醇脱氢酶的方法主要包括用传统的特定底物多次富集法和基于NAD (P) H生成的比色法，即NBT/PMS检测方法。传统的方法通过多次的底物富集工作量大时间长， 得到优良菌株的几率小。NBT/PMS检测方法相对于传统方法有所改进，该方法所需试剂较多、所用试剂毒性较大并且过程较为繁琐。因此，设计出一套简单快速经济的方法提高筛选醇脱氢酶的成功率是相当必要和迫切的。
发明内容
本发明为了解决上述课题，基于醇脱氢酶以NAD(H)或NADP(H)为辅酶的特性，在反应体系中加入待测样本对醇进行氧化，在醇氧化的同时把不发射荧光的氧化型辅酶NAD+ 或NADP+转化成能在一定激发光激发下发射荧光的还原型辅酶NADH或NADPH，利用反应液荧光强度的变化设计出了一种醇脱氢酶的快速筛选鉴定方法。本发明采用的技术方案是一种基于NADH或NADPH荧光的醇脱氢酶的筛选鉴定方法，所述方法包括在96孔微孔板中，分别加入PH 7. 0 8. 8的Tris-HCl或ρΗ8· 8 10. 5的甘氨酸-NaOH缓冲液， 然后往缓冲液中添加0. 2. 0% (ν/ν)的底物，0. 5 ImM的辅酶NAD+或NADP+，以及待测样本，在0 80°C下反应1 4 后，反应液在激发波长340nm 380nm和发射波长 450nm 470nm下检测荧光强度，在同等条件下以反应体系中不加入底物的反应液为对照， 与对照相比，荧光强度增加值大于400的样本，即为含有对应醇脱氢酶的样本，反之则否； 所述底物为C2 ClO的醇、C6 ClO的芳香醇或C4 ClO的脂肪醇，包括混旋的醇或光学纯的醇。本发明方法可用于未知样品中醇脱氢酶的筛选，待测样品为微生物或酶液，所述微生物来自各种可分离得到的微生物样品，如污水、化工厂、农田等的土样或水样以及现存或保藏的微生物菌种或者基因工程菌，也可将待筛选的微生物经培养得到菌体后，再进行筛选操作。本发明方法也可用于已知酶样品的鉴定，待测样品为已知的粗酶液或经纯化后的纯酶，可为市购产品，也可为已知产醇脱氢酶微生物经发酵分离获得的酶液。
优选的，所述芳香醇为苯甲醇、1-苯乙醇、1-苯丙醇、扁桃酸甲酯。优选的，所述脂肪醇为乙醇、丙醇、戊醇、仲丁醇、仲戊醇、仲辛醇、4-氯-3-羟基丁
酸乙酯。添加的辅酶为NAD+时，反应液在激发波长360nm和发射波长460nm下检测荧光强度。添加的辅酶为NADP+时，反应液在激发波长350nm和发射波长460nm下检测荧光强度。本发明中所涉及的底物有一部分水溶性较差，本发明通过两种策略解决这一问题，一是降低底物浓度，另一是添加适量的助溶剂。优选的，所述缓冲液还添加有体积为缓冲液体积10 30%的助溶剂，所述助溶剂为甲醇、二甲基亚砜或乙腈。优选的，所述缓冲液还可添加有1 10g/L的溶菌酶。添加溶菌酶，有助于胞内醇脱氢酶的释放和大分子底物进入细胞，有利于增强反应液的荧光强度。优选的，所述待测样品为微生物菌株，所述方法可应用于醇脱氢酶产生菌的快速筛选，所述方法如下(1)在固体培养基上涂上20 200μ 1底物，作为富集平板，称取0. 1 1克土壤样本，溶于1 2ml无菌水中，充分混勻，再用无菌水稀释1000 10000倍后涂布于富集平板，在30或37°C下培养12 72h，挑选具有不同菌落形态特征的菌株，接种于斜面，在30 或37°C下培养12 72h，从斜面上用接种环挑取2环菌体，用60 μ 1无菌水制成菌悬液，用于96孔板的微量反应体系；(2)在96孔微孔板中，分别加入ρΗ 7. 0 8. 8的Tris-HCl或ρΗ 8. 8 10. 5的甘氨酸-NaOH缓冲液，然后往缓冲液中添加0. 2. 0%的底物，0. 5 ImM的辅酶NAD+ 或NADP+，以及步骤(1)获得的菌悬液，在20 50°C下反应10 24h后，反应液在激发波长340nm 380nm和发射波长450nm 470nm下检测荧光强度，在同等条件下以反应体系中不加入底物的反应液为对照，与对照相比，荧光强度增加值大于400的样本，即为含有对应醇脱氢酶的样本，即为相应醇脱氢酶产生菌。初筛所得的菌株可再利用气相色谱或液相色谱分析技术作进一步复筛确认。本发明的发明点如下(1)提供了一种醇脱氢酶的快速筛选鉴定方法，确定辅酶NADH和NADPH的激发和发射波长范围及其最适值，并得到优化的筛选反应体系及参数。(2)通过确定温度、ρΗ、助溶剂、底物与NAD(P)H荧光的关系，排除本发明在具体实施中NAD(P)H荧光的干扰因素，使本发明适用性更广。(3)利用96孔微孔板作为反应容器，利用辅酶荧光正向筛选醇脱氢酶，解决已有醇脱氢酶的筛选中时间过长，过程繁琐，试剂用量大且成功率低等问题。(4)本发明提供一种同时适用于筛选具有立体选择性的醇脱氢酶(底物为手性醇时)的方法。本发明的有益效果主要体现在本发明与已有的醇脱氢酶筛选方法相比，耗时短， 精确率高，所需反应试剂微量，具有高通量筛选的特点，并且反应体系简单，操作过程简便， 反应的干扰因素少。
图1为不同种类辅酶不同浓度下的荧光光谱图；“□”表示NADH ；“▲”表示NADPH ； “· ”表示 NADP+ ； “ Δ ” 表示 NAD+ ；图2为还原型辅酶NAD (P)H在发射光谱400 500nm的范围内荧光光谱图；“ □” 表示 NADH ；“▲” 表示 NADPH ；图3为还原型辅酶NAD (P)H在激发光谱300 400nm的范围内荧光光谱图；“ □” 表示 NADH ；“▲” 表示 NADPH ；图4为还原型辅酶NAD(P)H在不同温度下的荧光光谱图；“□”表示NADH ；“▲”表示 NADPH ；图5为还原型辅酶NAD (P)H在不同pH下的荧光光谱图；“ □”表示NADH ；“▲”表示 NADPH ；图6为不同助溶剂对还原型辅酶NADH荧光强度的影响；“ □”代表未加助溶剂， “曲’’代表加入10%的助溶剂，“ ■”代表加入20%的助溶剂，“國’’代表加入30%的助溶剂；图7为编号为观13的菌株气相色谱结果；1、溶剂乙酸乙酯；2、苯乙酮；3、 (R)-I-苯乙醇；4、(S)-I-苯乙醇。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 辅酶NADH和NADPH的激发与发射波长将还原型辅酶NADH和NADPH、氧化型辅酶NAD+和NADP+分别配制成从0. 01 ImM的不同浓度梯度的水溶液，取300 μ 1加入96孔微孔板中，在激发波长360nm，发射波长 460nm处测荧光强度，结果见图1。由图可知，在激发波长360nm和发射波长460nm下，还原型辅酶具有荧光，而氧化型辅酶不发射荧光。配制0. 5mM的NADH和NADPH水溶液，设定激发波长360nm，在发射光谱400 500nm的范围内测其荧光值，得到荧光光谱图，见图2。由图2可知，NADH和NADPH最适发射波长为460nm。另外，设定发射波长460nm，在激发光谱300 400nm的范围内测其荧光值，得到荧光光谱图，见图3。由图3可知，NADH最适激发波长为360nm，NADPH最适激发波长为350nm。实施例2 温度、pH、有机溶剂、底物等与NAD (P) H荧光的关系(1)温度与NAD(P)H荧光的关系配置0. 5mM的NAD (P)H水溶液，取300 μ 1分装入96孔微孔板中，在4 70°C的温度梯度内过夜放置16h，期间用保鲜膜封存，防止挥发对荧光值造成影响。在最适波长下分别测其荧光值，结果见图4。由图4可知，在此范围内温度对NADH的荧光值基本无影响； NADPH在高温下自发荧光有所减弱，但是根据实施例1中图1的结果分析，其荧光仍显著。(2) pH与NAD(P)H荧光的关系用pH 7.0 10. 5的缓冲液配置0.5mM的NAD (P) H溶液，其中pH 7. 0、7. 5、8. 0为 50mM 的 Tris-HCl 溶液，pH 8. 5、9. 0、9. 5、10. 0、10. 5 为 50mM 的甘氨酸-NaOH 溶液。取不同pH的NAD (P) H溶液各300μ 1，30°C恒温过夜放置16h，在最适波长下测其荧光值，结果见图 5。在pH 7.0 10. 5范围内，pH对NAD(P)H荧光没有明显影响。(3)助溶剂与NAD(P)H荧光的关系在0.5mM的NAD (P) H水溶液中加入不同浓度常用助溶剂(甲醇、二甲基亚砜、乙腈)，取300 μ 1加入96孔微孔板中，用保鲜膜封存防止挥发损失，30°C恒温过夜放置16h， 在最适波长下测其荧光值，其中NADH的数据如图6。由图可知，几种常见的助溶剂对其自发荧光值基本无影响，NADPH的结果基本与NADH —致。(4)底物NAD (P) H荧光的关系在0. 5mM的NAD (P) H水溶液中加入1. 0% (V/V)的各种常用醇脱氢酶底物，芳香醇以苯甲醇、1-苯乙醇、1-苯丙醇、扁桃酸甲酯为例；脂肪醇以乙醇、丙醇、戊醇、仲丁醇、仲戊醇、仲辛醇、4-氯-3-羟基丁酸乙酯为例。取300 μ 1加入96孔微孔板中，用保鲜膜封存， 30°C恒温过夜放置16h，在最适波长下测其荧光值，结果显示荧光值均在4000 6000的范围内，表明该方法对各种类型的醇具有普适性。在96孔微孔板中，分别加入pH 10. 5的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液，然后往缓冲液中添加1.0% (ν/ν)的前述常用醇脱氢酶底物(乙醇、仲丁醇、4-氯-3-羟基丁酸乙酯、 1-苯乙醇或扁桃酸甲酯)，0. 5mM的辅酶NAD+，以及相应的醇脱氢酶(乙醇脱氢酶、仲醇脱氢酶、4-氯-3-羟基丁酸乙酯脱氢酶、芳香醇脱氢酶)，反应总体系为300 μ 1。将反应液体系在96孔微孔板中配置好后，用保鲜膜封存，30°C恒温过夜放置16h，在最适波长下测其荧光值，在同等条件下以反应体系中不加入底物的反应液为对照，结果显示与对照相比，所有样本荧光强度增加值均大于400。实施例3 以1-苯乙醇为底物快速筛选醇脱氢酶产生菌取150 μ 1 1-苯乙醇涂布与LB平板上，吸收片刻，即为富集平板。称取土样(来源于湖北，内蒙古，山东等地)0. 5克，置于2ml离心管(含无菌水Iml)中，用无菌水1000 倍稀释后取10(^1均勻涂布于富集平板，301培养4811。然后选取平板上形态不同的菌落接种于LB斜面上，30°C培养Mh。从所得斜面中取2接种环菌体在60 μ 1无灭菌水中，震荡制成菌悬液，用于初筛。反应体系总体积为300 μ 1，分别包括pH 10.0的甘氨酸-NaOH缓冲液(总浓度50mM)、0. 5% (V/V)混旋1-苯乙醇、1. OmMNAD+和25 μ 1待测菌悬液。将配置好的反应液体系300 μ 1，加入96孔微孔板，保鲜膜封存，在30°C下反应1 后，在激发波长360nm和发射波长460nm下检测荧光强度。反应体系中不加底物苯乙醇作为对照，排除微生物可能由于自身存在能将NAD+还原成NADH的酶而影响筛选方法的准确性。对照在上述同等条件下反应并检测荧光强度。选取反应液的荧光值与对照差值大于400以上的菌株作为醇脱氢酶产生菌。实施例4 以1-苯乙醇为底物快速筛选醇脱氢酶产生菌菌株富集方法与菌悬液制备方法与实施例3中所用方法相同。反应体系总体积为 300 μ 1，分别包括pH 9. 0的甘氨酸-NaOH缓冲液(总浓度50mM) U.0% (V/V)混旋1_苯乙醇、l.OmM NADPMO% (V/V) 二甲基亚砜、1.0% (W/V)溶菌酶和50 μ 1待测菌悬液。将配置好的反应液体系300 μ 1，加入96孔微孔板，保鲜膜封存，在30°C下反应他后，在激发波长350nm和发射波长460nm下检测荧光强度。反应体系中不加底物苯乙醇作为对照，排除微生物可能由于自身存在能将NADP+还原成NADPH的酶而影响筛选方法的准确性。对照在上述同等条件下反应并检测荧光强度。选取反应液的荧光值与对照差值大于400以上的菌株作为醇脱氢酶产生菌。实施例5 以1-戊醇为底物快速筛选醇脱氢酶产生菌取150 μ 1 1-戊醇涂布与LB平板上，吸收片刻，即为富集平板。称取土样0. 5克， 置于2ml离心管(含无菌水Iml)中，用无菌水1000倍稀释后取100 μ 1均勻涂布于富集平板，30°C培养48h。然后选取平板上形态不同的菌落接种于LB斜面上，30°C培养Mh。从所得斜面中取2接种环菌体在60 μ 1无灭菌水中，震荡制成菌悬液，用于初筛。反应体系总体积为 300 μ 1，分别包括 pH 8. 0 的 50mM Tris-HCl 缓冲液、2. 0% (V/V) 1-戊醇、0. 8mM NAD+、 20% (V/V)甲醇、0. 5% (ff/V)溶菌酶和50 μ 1待测菌悬液。将配置好的反应液体系300 μ 1， 加入96孔微孔板，保鲜膜封存，在30°C下反应IMi后，在激发波长360nm和发射波长460nm 下检测荧光强度。反应体系中不加底物苯乙醇作为对照，排除微生物可能由于自身存在能将NAD+还原成NADH的酶而影响筛选方法的准确性。对照在上述同等条件下反应并检测荧光强度。选取反应液的荧光值与对照差值大于400以上的菌株作为醇脱氢酶产生菌。实施例6 气相色谱方法复筛醇脱氢酶产生菌将实施例3和4中初筛后得到的菌株接种于LB培养基中，在30°C和200rpm下培养48h，取IOml菌液在6000rpm下离心lOmin，弃上清，所得菌体用与甘氨酸-NaOH缓冲液 (50mM,pH 10. 0)洗涤一次，6000rpm离心lOmin，弃上清。所得菌体中加入2ml甘氨酸-NaOH 缓冲液(50mM，pH 10. 0),5 μ 1 1-苯乙醇和40 μ 1的NAD+(40mM)，混勻。反应液在30°C和 200rpm下反应16h，然后反应液经过乙酸乙酯1 1萃取，萃取所得的有机相用于气相色谱分析(色谱柱，CHIRASIL-DEX CB ；流速，0. 60ml/min ；分流比，1 50 ；140°C恒温)。结果表明，从土壤中分离得到菌株214株，经实施例3和4的荧光检测后，初筛得到44株醇脱氢酶产生菌，占所测菌株总数的20. 6%。初筛所得的菌株经气相色谱法复筛后，结果表明具有氧化1-苯乙醇活力的菌株为36株，占初筛所得菌株的81. 8%，其中47%的菌株的底物对映体过量值在80 %以上。本发明从菌种分离、菌悬液制备、反应、荧光检测到色谱验证整个筛选过程时间跨度约为5天，一批次可处理上百个待测菌株，与已有筛选的方法比较，本发明不仅仅大大缩短了筛选时间，更重要的是大幅度地提高了筛选的成功率。实施例7 用于手性催化的醇脱氢酶产生菌的筛选从实施例6中随意选取一株ee值大于80%的菌株，筛菌编号为观13，气相结果如图7所示。以混旋1-苯乙醇为底物时，菌株观13选择性氧化(S)-I-苯乙醇生成苯乙酮，同时导致(R)-I-苯乙醇的对映体过量值大于80%。按照实施例3中的反应体系作96孔微孔板检测，将底物分别替换为(S)-I-苯乙醇及(R)-I-苯乙醇，得到荧光值如表1所示。荧光检测结果显示，以(S)-I-苯乙醇为底物时反应液的荧光值显著增高，比对照大2598. 396。 而以(R)-I-苯乙醇为底物的反应液荧光值，与对照相比，荧光组增加值只有约197，与实施例6中得到的气相结果一致。因而，分别以S型和R型对映体作为底物，通过比较它们的反应液荧光值，本方法也可用于筛选具有立体选择性醇脱氢酶活力的菌株。表1
权利要求
1.一种基于NAD (P) H荧光的醇脱氢酶的筛选鉴定方法，所述方法包括在96孔微孔板中，分别加入PH 7.0 8. 8的Tris-HCl或pH 8. 8 10. 5的甘氨酸-NaOH缓冲液，然后往缓冲液中添加0. 1 % 2. 0 %的底物，0. 5 ImM的辅酶NAD+或NADP+，以及待测样本，在 0 80°C下反应1 48h后，反应液在激发波长!MOnm 380nm和发射波长450nm 470nm 下检测荧光强度，在同等条件下以反应体系中不加入底物的反应液为对照，与对照相比，荧光强度增加值大于400的样本，即为含有对应醇脱氢酶的样本；所述底物为C2 ClO的醇、 C6 ClO的芳香醇或C4 ClO的脂肪醇。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述样本为分离自天然环境的微生物、基因工程菌、粗酶或纯酶样本。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述芳香醇为苯甲醇、1-苯乙醇、1-苯丙醇、扁桃酸甲酯。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述脂肪醇为乙醇、丙醇、戊醇、仲丁醇、仲戊醇、仲辛醇、4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于添加的辅酶为NAD+时，反应液在激发波长 360nm和发射波长460nm下检测荧光强度。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于添加的辅酶为NADP+时，反应液在激发波长 350nm和发射波长460nm下检测荧光强度。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述缓冲液还添加有体积为缓冲液体积 10 30%的助溶剂，所述助溶剂为甲醇、二甲基亚砜或乙腈。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述缓冲液还添加有1 10g/L的溶菌酶。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测样品为微生物菌株，所述方法如下(1)在固体培养基上涂上20 200μ 1底物，作为富集平板，称取0. 1 1克土壤样本， 溶于1 2ml无菌水中，充分混勻，再用无菌水稀释1000 10000倍后涂布于富集平板，在 30或37°C下培养12 72h，挑选具有不同菌落形态特征的菌株，接种于斜面，在30或37°C 下培养12 72h，从斜面上用接种环挑取2环菌体，用60 μ 1无菌水制成菌悬液，用于96孔板的微量反应体系；(2)在96孔微孔板中，分别加入pH7. 0 8. 8的Tris-HCl或pH 8. 8 10. 5的甘氨酸-NaOH缓冲液，然后往缓冲液中添加0. 1 % 2. 0%的底物，0. 5 ImM的辅酶NAD+或 NADP+，以及步骤(1)获得的菌悬液，在20 50°C下反应10 24h后，反应液在激发波长 340nm 380nm和发射波长450nm 470nm下检测荧光强度，在同等条件下以反应体系中不加入底物的反应液为对照，与对照相比，荧光强度增加值大于400的样本，即为含有对应醇脱氢酶的样本。
全文摘要
本发明提供了一种基于NAD(P)H荧光的醇脱氢酶的快速筛选鉴定方法，所述方法基于醇脱氢酶以NAD(H)或NADP(H)为辅酶的特性，以96孔微孔板为反应容器，在反应体系中加入待测样本对醇进行氧化，在醇氧化的同时把不发射荧光的氧化型辅酶转化成能在一定激发光激发下发射荧光的还原型辅酶NADH或NADPH，通过测定反应液荧光强度的变化来筛选醇脱氢酶产生菌。本发明与已有的醇脱氢酶产生菌筛选方法相比，耗时短，精确率高，所需反应试剂微量，具有高通量筛选的特点，并且反应体系简单，操作过程简便，反应的干扰因素少。
文档编号G01N21/64GK102517378SQ20111036389
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者应向贤, 杨池, 汪钊, 熊斌 申请人:浙江工业大学