专利名称：松花粉超临界萃取物中总磷脂含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及ー种松花粉超临界萃取物中总磷脂含量的測定方法。
背景技术：
松花粉(Pollen Pini)是松科植物马尾松(Pinus massonina lamb)、油松 (Pinustabulaefermiscarr)等植物于春季花刚开时将雄球采摘，晒干，搓下花粉，收集，除去杂质所得的淡黄色细花粉[參见=ChP(中国药典).2010. Vol I (—部)191]。松花粉是天然的微型营养库。作为优良的保健食品，松花粉的营养成分可以分为糖、蛋白质、脂肪、维生素、微量元素和生物活性物质六大类。其所含的多种酶、激素、黄酮以及丰富的磷脂等生物活性物质对人体的生命活动有重要的调节作用，具有抗衰老、抗疲劳、调节血脂、降血糖、 护肝、美容、减肥等多种药理作用，是花粉产品中的佼佼者。松花粉活性成分复杂，虽被《中国药典》收载，规定了制法、显微鉴别和检查项目， 但未对其活性有效成分的含量做出质控标准。目前的文献表明松花粉所富含的磷脂具有显著的降血脂等多种药理活性。近20年来生物医学研究也充分证明磷脂具有调节生理机能、增强免疫力、防治心、脑、血管等疾病的作用。但磷脂遇热不稳定，给传统的溶剂提取带来困难。超临界流体萃取(supercritical fluid extraction, SFE)是近代分离领域出现的高新技木，除减少有机溶剂用量外，还有萃取效率和选择性高、适用于热不稳定物质的提取、环境污染小、操作条件易于改变等特点，是ー种较为理想的中药活性物质提取方法。 对松花粉进行超临界(X)2萃取，可以避免有机溶剂的残留，提高产率，同时在提取过程中不易破坏松花粉中的有效活性物质，大大提高活性成分的萃取量。[參见邵兴军，丁德华， 郦宏岩等.超临界CO2萃取松花粉中有效成分的方法.[P]中国专利200810155138. 3， 2009-03-18;冯武，范国栋，刘嘉宝.云南松花粉超临界CO2脱脂研究.[J]云南林业科技· 2003，(1) :63ο ]松花粉超临界萃取物作为具有广阔市场前景的中药提取物，制定其质量评价标准对其在中药产业的发展有非常重要的意义，特別是针对其中典型活性成分建立有效的分折方法从而从总体上把握萃取物的质量情况尤为重要。目前，国内外尚未见针对松花粉超临界萃取物进行磷脂类成分的含量測定文献及专利。
发明内容
本发明的目的在于设计提供一种针对超临界流体萃取松花粉中总磷脂成分建立含量測定方法的技术方案。本发明的技术方案如下ー种松花粉超临界萃取物中总磷脂含量的測定方法，它包括如下步骤1.标准储备液的制备精密称取磷酸ニ氢钾适量，加双蒸水溶解，配制成 0. 05mg · ml—1的磷酸ニ氢钾标准储备液(含磷0. OlHmg · ml—1)；
2.供试样品溶液的制备2. 1.精密称取松花粉超临界萃取物5. OOOOg，測定，放入IOOml圆底烧瓶中，加入 60ml三氯甲烷-甲醇混合液(v/v，2 1)，于60°C水浴中提取lh，提取结束后，取下圆底烧瓶，用布氏漏斗过滤，滤液用250ml圆底烧瓶收集，用三氯甲烷-甲醇混合液洗涤烧瓶、滤器及滤器中的试样残渣，洗涤液并入滤液中，置于65 70°C水浴中回收溶剤，至圆底烧瓶内物料显浓稠态，冷却，用移液管加入25ml石油醚，再加入15g无水硫酸钠，立刻加塞振荡 lOmin，将醚层移入具塞离心管中，以3000r · mirT1离心5min进行分离，用移液管迅速吸取离心管中澄清的醚层10ml，蒸发去除石油醚后，于100 105°C烘箱中烘至衡重，将其用三氯甲烷定容于25ml量瓶中，即得供试样品溶液以测定总磷脂的含量；2. 2磷显色液的制备:3mol ·じ1硫酸-水-2. 5%钼酸铵-10%抗坏血酸(ν/ν/ν/ ν,Ι 5 1 1)配制而成的溶液，配制时按上述硫酸、水、钼酸铵和抗坏血酸的順序加入， 且当天使用；3.測定方法精密量取上述供试样品溶液或磷标准液适量于IOml容量瓶中，水浴上挥干溶剤，加0. 25ml质量百分浓度为70%高氯酸置沸水浴中消化，消化完全后，用磷显色液定容至刻度，摇勻后放入70°C水浴中加热IOmin后立即取出冷却至室温，以相应的试剂为空白，在315nm处测定吸光度；4.结果计算以磷酸ニ氢钾标准储备液的测定数据制作标准曲线，以供试样品溶液的测定数据对照标准曲线计算出样品溶液中总磷脂的量。方法建立后分别对料液比、消化反应时间两个显色条件进行考察，确定消化反应最佳料液比为4 10，消化时间池为最优。有益效果目前，针对松花粉及其提取物的药理作用和活性成分的研究已有多篇文献报道。 由于松花粉功效成分复杂，其质量评价散见于维生素、微量元素和部分单类活性物质的测定，评价内容的规范性和完整性尚有待完善。松花粉超临界萃取物作为具有广阔市场前景的中药提取物，针对其中典型活性成分制定其质量评价方案对其在中药产业的发展有非常重要的意义。目前，国内外尚未见针对松花粉超临界萃取物进行黄酮及磷脂类成分的含量測定的文献及专利。本发明首次针对超临界流体萃取松花粉中总磷脂分別建立了简便可行的分析方案，准确度、精密度良好，为实现松花粉超临界萃取物的质量可控提供了方法依据。
图1为磷标准液(1)及松花粉超临界(X)2萃取物供试品(2)紫外扫描图。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进ー步说明。SFE-PP中总磷脂的含量測定1.仪器与试药UV-2401PC型紫外分光光度计(日本岛津)；XT-102A型电子天平(瑞士 I^recisa)等。
松花粉超临界(X)2萃取物(SFE-PP，江苏江大源生态生物科技有限公司)；芦丁对照品(南京泽朗医药科技有限公司)；其余试剂分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。2.实验方法2. 1.标准储备液的制备精密称取磷酸ニ氢钾适量，加双蒸水溶解，配制成 0. 05mg · ml—1的磷酸ニ氢钾标准储备液(含磷0. OlHmg · ml-1)；2. 2.供试品溶液的制备精密称取松花粉超临界萃取物5. OOOOg,放入IOOml圆底烧瓶中，加入60ml三氯甲烷-甲醇混合液(v/v，2 1)，于60°C水浴中提取lh，提取结束后，取下圆底烧瓶，用布氏漏斗过滤，滤液用250ml圆底烧瓶收集，用三氯甲烷-甲醇混合液洗涤烧瓶、滤器及滤器中的试样残渣，洗涤液并入滤液中，置于65 70°C水浴中回收溶剤， 至圆底烧瓶内物料显浓稠态，冷却，用移液管加入25ml石油醚，再加入15g无水硫酸钠，立刻加塞振荡lOmin，将醚层移入具塞离心管中，以SOOOi^mirr1离心5min进行分离，用移液管迅速吸取离心管中澄清的醚层10ml，蒸发去除石油醚后，于100 105°C烘箱中烘至衡重，将其用三氯甲烷定容于25ml量瓶中，即得供试品溶液以测定总磷脂的含量；2. 3磷显色液的制备3mol ·じ1硫酸-水-2. 5%钼酸铵-10%抗坏血酸(ν/ν/ν/ ν,Ι 5 1 1)配制而成的溶液，配制时按上述順序加入，且当天使用；2. 4測定方法精密量取上述供试样品溶液或磷酸ニ氢钾标准储备液适量于IOml 量瓶中，水浴上挥干溶剤，加0. 25ml 70%高氯酸置沸水浴中消化，消化完全后，用磷显色液定容至刻度，摇勻后放入70°C水浴中精确恒温IOmin后立即取出冷却至室温，以相应的试剂为空白，在315nm处测定吸光度；2. 5.结果计算以磷酸ニ氢钾标准储备液的测定数据制作标准曲线，以供试样品溶液的测定数据对照标准曲线计算出样品溶液中总磷脂的量。3.结果与讨论3. 1总磷脂含量測定实验条件的优化与验证3. 1. 1.測定波长的选择精密量取2. 1项下的磷标准液和2. 2项下的供试品溶液适量于IOml量瓶中，照 2. 4測定方法加入试剂，以相应的试剂为空白，分別在200nm SOOnm范围内进行扫描，以确定最大吸收波长。发现磷标准液和SFE-PP样品在315nm处均有最大吸收(见图1)，且峰形相似，因此选择315nm为测定波长。3. 1.2.标准曲线的绘制精密量取磷标准储备液0. 30ml,0. 60ml,0. 90ml、1. 20ml、1. 50ml 置 IOml 量瓶中， 照2. 4測定方法加入试剂，以相应的试剂为空白，在315nm处测定吸光度，对所得数据进行回归，求出回归方程为y = 0. 3939X+0. 0041 (r = 0. 9997,η = 5)，结果表明，在实验浓度范围内磷标准液的吸光度与浓度呈良好的线性关系。3. 1. 3精密度实验精密吸取磷标准储备溶液0. 30ml,0. 90mlU. 50ml于IOml量瓶中，得低、中、高三个浓度分别为0. 342、1. 026、1. 710 μ g -πιΓ1的标准溶液，按2. 4项显色，每个浓度平行測定 5份，以考察方法的日内精密度；以上三个浓度的标准溶液，每天测一次，连续5天，以考察方法的日间精密度。结果见表1。表1总磷脂精密度实验结果(n = 5)
权利要求
1.ー种松花粉超临界萃取物中总磷脂含量的測定方法，其特征是它包括如下步骤 标准储备液的制备精密称取磷酸ニ氢钾适量，加双蒸水溶解，配制成0. 05 mg ml—1的磷酸ニ氢钾标准储备液(含磷0. 0114 mg πιΓ1)； 供试样品溶液的制备精密称取松花粉超临界萃取物5. 0000 g，放入100 ml圆底烧瓶中，加入60 ml三氯甲烷-甲醇混合液(v/v，2 1)，于60°C水浴中提取1 h，提取结束后，取下圆底烧瓶，用布氏漏斗过滤，滤液用250 ml圆底烧瓶收集，用三氯甲烷-甲醇混合液洗涤烧瓶、滤器及滤器中的试样残渣，洗涤液并入滤液中，置于65KTC水浴中回收溶剤，至圆底烧瓶内物料显浓稠态，冷却，用移液管加入25 ml石油醚，再加入15 g无水硫酸钠，立刻加塞振荡10 min，将醚层移入具塞离心管中，以3000 r · HiirT1离心5 min进行分离，用移液管迅速吸取离心管中澄清的醚层10 ml，蒸发去除石油醚后，于10(T105°C烘箱中烘至衡重，将其用三氯甲烷定容于25 ml量瓶中，即得供试样品溶液以测定总磷脂的含量；
2.磷显色液的制备3mol じ1硫酸-水-2. 5%钼酸铵-10%抗坏血酸(v/v/v/v， 1:5:1: 1)配制而成的溶液，配制时按上述硫酸、水、钼酸铵和抗坏血酸的順序加入，且当天使用；測定方法精密量取上述供试样品溶液或磷标准液适量于10 ml容量瓶中，水浴上挥干溶剤，加0.25 ml质量百分浓度为70%高氯酸置沸水浴中消化，消化完全后，用磷显色液定容至刻度，摇勻后放入70°C水浴中加热10 min后立即取出冷却至室温，以相应的试剂为空白，在315 nm处测定吸光度；结果计算以磷酸ニ氢钾标准储备液的测定数据制作标准曲线，以供试样品溶液的测定数据对照标准曲线计算出样品溶液中总磷脂的量。
全文摘要
一种松花粉超临界萃取物中总磷脂含量的测定方法，它是以磷酸二氢钾作为标准溶液，以紫外光谱仪315nm处测得吸光度作出标准曲线；精密称取松花粉超临界萃取物，加入三氯甲烷-甲醇混合液(v/v,2∶1)，提取，过滤，回收溶剂至浓稠态，冷却，定量加入石油醚，再加入15g无水硫酸钠，以3000r·min-1离心分离，醚层蒸发去除石油醚后，烘箱中烘至衡重，以70%高氯酸溶液置沸水浴中消化，消化完全后，用磷显色液定容至刻度，以相应的试剂为空白，在315nm处测定吸光度，测得松花粉超临界萃取物中总磷脂含量。本发明首次针对超临界流体萃取松花粉中总磷脂分别建立了简便可行的分析方案，准确度、精密度良好，为实现松花粉超临界萃取物的质量可控提供了方法依据。
文档编号G01N21/31GK102564978SQ201110374368
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者余江南, 徐希明, 童姗姗, 邓倩 申请人:江苏大学