专利名称：犬恶丝虫elisa 检测试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及犬恶丝虫感染抗体的检测方法，进一步讲是提供了用于犬的犬恶丝虫ELISA检测试剂盒，本发明还公开了该试剂盒的制备方法，属于犬科动物疾病检测技术领域。
背景技术：
犬恶丝虫病是犬恶丝虫i遞 iiis」成虫寄生于犬的右心室、肺动脉内，使患犬形成机械性栓塞，影响心肺功能，导致呼吸衰竭、循环和泌尿系统遭受严重损伤的一种寄生虫病。犬、猫科动物是本病的天然宿主，野生肉食动物、马属动物、灵长类等偶见感染，还可以感染人类。至今，犬恶丝虫病已在包括我国在内的世界多国家流行。人感染犬恶丝虫的病例已出现在美国、加拿大、巴西、哥伦比亚、哥斯达黎加、意大利、法国、葡萄牙、俄罗斯、中国大陆、中国台湾、日本、朝鲜和澳大利亚等。该病已成为潜在的严重威胁人类健康的新发人兽共患寄生虫病而受到人们的广泛关注和重视。现行的诊断方法，如直接镜检和染色镜检法费时、费力、检出率低；间接荧光抗体试验和PCR等方法对仪器设备和试剂的要求较高，因此建立一种快速、特异性较高的诊断方法是十分必要的。
发明内容
本发明公开一种犬恶丝虫ELISA检测试剂盒，用于检测犬科动物是否感染犬恶丝虫，解决了当前血液中微丝蝴镜检检测灵敏度低、费时、费力，间接荧光抗体试验和PCR等方法对仪器设备和试剂的要求较高等缺点，快速、特异性地检出犬恶丝虫的感染。本发明提供了犬恶丝虫ELISA检测试剂盒的制备方法，适用于工业化生产。本发明公开的犬恶丝虫的保护性抗原基因，如SEQ ID NO. I所示。本发明所述保护性抗原基因的扩增引物，其特征在于
F2 :5 ’ - GGATCCCAACTTACGCAGGAAGCA - 3 ’，
S2 :5，- CTCGAGCTCGAGTTAGCAGTAATTGATGCC _ 3 ’。本发明提供的ELISA检测试剂盒的组成包括包括底物溶液、酶标物、酶标物稀释液、聚苯乙烯塑料反应板、PBS(磷酸盐缓冲液)、包被液、封闭液、洗涤液、终止液及样品稀释液、阳性及阴性标准血清等。所述纯化重组蛋白为利用从犬恶丝虫成虫cDNA表达文库中筛选出的与编码马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白的同源基因命名为MTFP(同源性88%)，在大肠杆菌万.
BL21 (DE3)表达的MTFP蛋白作为抗原；
其中，PBS稀释液为pH值7. 4的磷酸盐缓冲液；
包被液为PH值9. 6的碳酸盐缓冲液；
封闭液为5%的脱脂奶粉PBS液；
洗涤液为O. 01mol/L的pH值是7. 4的PBST溶液；
终止液为2mol/L H2SO4溶液；酶标物为辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG (辣根过氧化物酶标记)；
底物溶液为PH值5. O的磷酸盐-柠檬酸缓冲液和H2O2配置的邻苯二胺(OPD)。本发明还提供检测样品是否含抗犬恶丝虫特异性抗体(即犬是否感染犬恶丝虫)，步骤如下
⑴样品前处理
⑵用权利要求所述的ELISA检测试剂盒检测，用抗原包被酶标板(聚苯乙烯塑料反应板)，依次加入封闭液、待检被检血清、酶标物，期间分别洗涤，再加入底物溶液、显色液及终止液，终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度值。⑶分析检测结果 本发明试剂盒的检测原理为
以纯化重组蛋白为抗原，将其包被酶标板后，洗去游离部分；用封闭液进行封闭，洗去游离部分；再加入被检血清，如果血清是抗犬恶丝虫血清就能和抗原特异性结合，形成免疫复合物，将游离的被检血清洗去；加入酶标物(辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG)，就会形成纯化重组蛋白-抗犬恶丝虫血清-酶标物复合物，洗去游离的酶标物；加入显色底物，酶标物会使无色的显色剂现色，加终止液后变黄；若血清被检不是抗犬恶丝虫血清，则不能形成纯化重组蛋白-抗犬恶丝虫血清免疫复合物，酶标物不能被固定于酶标板，加入显色底物及终止液后无色。 本发明的积极效果在于
利用从犬恶丝虫成虫CDNA表达文库中筛选出的与编码马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白的同源基因命名为MTFP (同源性88%)，在大肠杆菌万.coli BL21 (DE3)表达的MTFP蛋白作 为抗原，建立了检测犬的犬恶丝虫感染的间接ELISA方法。该检测特异性高、灵敏度高、准确性高、稳定性好。具有操作简单、检测快速，易于判断等优点，适合于临床的快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。本发明的试剂盒所有试剂均为已配制好的工作液，可以直接操作无需处理，减少了操作步骤，可以快速，灵敏检测待检犬血清中的抗犬恶丝虫特异性抗体IgG，避免了复杂的操作，对设备要求低，可以适应多种检测环境；且本发明的试剂盒样本用量小，试剂保存时间长，对操作者无毒性，对环境无污染等；因此本发明应用纯化重组蛋白建立的ELISA检测试剂盒具有重大的社会意义和广阔的市场前景。
图I为MTFP基因PCR扩增产物；M DNA分子标志物；1 =MTFP PCR扩增产物；
图2为重组克隆质粒T-MTFP鉴定，M =DNA分子标志物；1 :重组克隆质粒T-MTFP经BamHI和XhoI双酶切后的产物；
图3为重组质粒pGEX-4T-l-MTFP的酶切鉴定图，M DL2000标志物I :载体PGEX-4T-1-MTFP的双酶切 图 4 为 pGEX-4T-l-MTFP (DE3) SDS-PAGE R Werstorn Boltting 分析电泳图，M:蛋白标志物；I :阳性菌目的蛋白western-blot验证,2 :纯化蛋白，3 :未诱导菌体蛋白，4:终浓度为lmmol/L的IPTG诱导表达4h的菌体蛋白。
具体实施例方式 下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。实施例I:
目的基因的克隆
I.根据保护性抗原基因MTFP基因序列，设计片段扩增引物
F2 :5’ - GGATCCCAACTTACGCAGGAAGCA _ 3’，下划线为 BamH I 酶切位点；
S2:5 ’ - CTCGAGCTCGAGTTAGCAGTAATTGATGCC - 3 ’，下划线为 Xho I 酶切位点。 2.犬恶丝虫MTFP基因的PCR扩增
PCR反应体系为10 Xbuffer 5μ , dNTPs 4μ ，DNA模版3μ ，上游引物和下游引物各O. 5PL，rTaq酶O. 5μ ，加水至50μ 。反应条件95°C预变性5min ;94°C变性2min，59°C退火lmin，72°C延伸ImirTC，30个循环；最后72°C延伸lOmin。以制备的含有MTFP插入片段的噬菌体基因组为模板扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图I)。3.目的基因的克隆
⑴目的基因PCR产物的凝胶回收
用TaKaRa公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收产物，按照说明书进行。取5μ L回收的溶液产物电泳检测结果，剩下的_20°C保存备用。⑵目的DNA与PMD18-T克隆载体的连接依次加入下列溶液PCR回收产物4· 5μ L、PMD18-T vector O. 5 μ L、Ligation Solution 5 μ L，混匀后，4°C连接过夜。⑶连接产物的转化
①取IOPL连接产物加入在冰水混合物的DH5a感受态细胞中，冰浴放置30min .级42°C热激90s，冰浴2min冷却；③转移菌液至装有400mL预热至37°C的LB培养液的Ep管中，37°C振荡(120r/min) I h，使细胞恢复抗药性；④取200μ 细菌培养物均匀涂布于含Amp的LB琼脂平板上；⑤倒置平皿于37°C培养箱培养12h后，挑白色菌落提取质粒。⑷阳性克隆的鉴定
①小量质粒的制备
用TaKaRa公司小量质粒抽提试剂盒提取质粒，按照说明书进行。取5 μ L产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，其余于_20°C保存备用。②重组克隆载体的酶切鉴定
将上步提取的质粒用限制性内切酶BamH I, Xho I双酶切鉴定。酶切反应体系总体积IOyL :限制性内切酶BamH I 0. 5 μ L、限制性内切酶Xho I O. 5 μ L、10XH buffer lyL、重组质粒5μ &(1Η20 3 μ L，上述液体混匀后，37°C水浴温育3h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析(见图2)。(5)重组克隆载体中目的基因的测序
将酶切鉴定正确的阳性克隆送上海生物工程技术服务有限公司测序。测序结果与原序列Blast比对，与MTFP基因同源性为100% (序列见附序列表)。实施例2:
重组表达载体的构建 I大量质粒的制备
将验证正确的重组克隆载体转化DH5a后的重组菌接种于含Amp的LB液体培养基，37°C培养箱震荡培养12h后，用TaKaRa公司大量质粒抽提试剂盒提取质粒，按照说明书进行。2酶切目的基因的凝胶回收
依次加入以下试剂2μ 限制性内切酶BamH Ι、2μ 限制性内切酶Xho I、4WL DNA和5PL Buffer混匀，37°C水浴反应3h，取全部进行琼脂糖凝胶电泳。用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因。3 pGEX-4T-l载体的双酶切及回收
PGEX-4T-1载体用BamH I, Xho I双酶切，反应体系如下pGEX_4T_l质粒33μ ，IOXUniversal Buffer H 3μ , BamH I 2μ , Xho I 2μ 。37°C水浴反应 3h，取全部进行琼脂糖凝胶电泳。用DNA凝胶回收试剂盒回收PGEX-4T-1载体酶切产物。4目的片段与PGEX-4T-1载体的连接与转化
取目的片段4μ 、载体WL混合后，加IOX Ligation buffer μ ,Τ4 DNA连接酶 μ ，加无菌去离子水到ΙΟμ 。混匀后置4°C连接过夜。在无菌条件取连接产物ΙΟμ ，加入到200mL BL21 (DE3)感受态细胞中进行转化。转化过程如下①把连接产物加入到BL21 (DE3)感受态细胞中后，冰浴约30min ；
②用42°C的水浴进行热激，时间为90 S，然后冰浴2min进行冷却事先取800μ LB培养液预热至37°C，将转移菌液至该培养基中，37°C振荡lh，使细胞恢复抗药性；④取培养好的菌液200μ 均匀涂布于含Amp筛选标记的LB琼脂平板上； 将培养皿倒置，放于于37°C培养箱中培养过夜。5表达载体的酶切鉴定及测序鉴定
将经PCR鉴定后为阳性的菌液，用质粒DNA制备试剂盒提取质粒。①表达载体的酶切鉴定
重组表达载体用BamH I和Xho I进行双酶切鉴定。双酶切反应体系(15 μ L)如下取重组质粒和 pGEX_4T_l 质粒各 5. O μ L,分别加入 IOXUniversal Buffer H I μ L, BamH IO. 5 μ L, Xho I O. 5 μ L，灭菌四馏水补足体积至10 μ L0 37°C酶切3h，并用1%琼脂糖凝胶中电泳检验，结果所得载体和基因片段均与预期相符。②表达载体的测序鉴定
经酶切鉴定为阳性克隆的重组菌，按I : 100的比例，接种于5. OmL含Amp的LB液体培养基中，37°C，180r/min振荡培养至对数生长期，取O. 5mL菌液送上海生工生物公司进行测序，结果正确。6表达载体pGEX-4T-l-MTFP的构建
把经BamH I与Xho I双酶切鉴定正确的克隆载体pMD18_MTFP，分别用上述两种酶双酶切回收目的片段，然后连接与用BamH I和Xho I双酶切的表达载体pGEX_4T_l上，转化细菌，提取质粒并双酶切鉴定重组表达载体PGEX-4T-1-MTFP (见图3)。实施例3:
目的基因的原核表达与纯化 I目的基因的原核表达 ⑴重组表达载体转化感受态细胞
将构建正确的表达载体质粒加入到已制备好的Rosetta(DE3)感受态中。加样量0.5 μ L，转化过程如下①把连接产物加入BL21(DE3)感受态细胞中；②冰浴放置约30min ；
③42°C水浴热激90S，冰浴2min冷却；④转移菌液至装有800 ul预热至37°C的LB培养液中，37°C振荡(120) lh，使细胞恢复抗药性；⑤取200 uL均匀涂布于含筛选标记(Amp)的LB琼脂平板上，封口 ；⑥倒置平皿于37°C培养箱培养过夜，可见克隆。⑵重组蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ①融合蛋白的诱导表达
取鉴定正确的单个阳性菌接种到5ml含有Amp的LB培养液中，37°C，180r/min震荡培养5-6h至0D_值达O. 6。无菌条件下加入IPTG至终浓度lmmol/L进行诱导，37°C继续震荡培养。诱导4h后，12000g离心lmin，收集菌体。同时做一空白对照不加诱导剂IPTG诱
导表达。②样品的制备
将上述收集的菌液加入到I. 5mL的离心管中，12000r/min离心lmin，弃上清。用PBS(高压灭菌)洗涤一次，晾干。每管加入70μ I去离子水，吹打悬匀，各加巯基乙醇10μ 1，5Χ上样缓冲液20μ 1，100°C煮沸IOmin ;12000r/min离心5min，上清即为蛋白电泳样品。(4) SDS-PAGE检测融合蛋白的表达
①12% SDS-PAGE凝胶的配制分离胶灌制去离子水I. 6mL，40%聚丙烯酰胺4. OmL,
1.5M Tris-HCl (PH8. 8) 2. OmL, 10% SDS 50 μ L, 10%过硫酸铵 50 μ L, TEMED 2 μ L ;②积层胶灌制:去离子水 I. 4mL，40%聚丙烯酰胺O. 33mL, I. 5M Tris-HCl (PH6. 8) O. 25mL, 10%SDS 20 μ L, 10%过硫酸铵 20 μ L, TEMED 2. O μ L,总体积 2mL。②全菌蛋白的SDS-PAGE洗净玻璃板，固定在电泳槽上。取上述配制12%的分离胶7mL，缓慢注入两玻璃板之间，胶顶覆盖2mL双蒸水使得分离胶压平。待分离胶凝固后倒出出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，再用滤纸吸干，加入3mL 5%的积层胶溶液，插上梳子，37°温箱中放置使电凝胶凝固；小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液，将电源负极与上槽相连；将细菌沉淀重悬于IOOPL IXSDS凝胶加样缓冲液中，煮沸15min。取20μ 上样，用80V电压电泳至分离胶，然后再120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部2cm处；染色小心剥离凝胶，在考马斯亮蓝染色液(45mL甲醇、45mL水、IOmL冰醋酸中溶解O. 25g考马斯亮蓝)中浸泡凝胶,放在摇床上室温染色2h ;⑤脱色用含30%甲醇、10%冰乙酸的混合液，在摇床上脱色过夜，其间更换脱色液3 4次,待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。2重组蛋白的纯化 ⑴重组质粒大规模表达
①取2只装有20 mL含氨苄青霉素2mg的LB液体培养基的25mL三角烧瓶，分别接种重组质粒PGEX-4T-1-GSP1和pGEX_4T-l_MTFP的单菌落，于37°C 250 r/min振摇过夜；②分别取其20 mL接种至6L的LB培养基于37°C条件下250 r/min振摇培养，至吸光度(A600值)达O. 7 ;③加入IPTG使终终浓度达O. 2 mmol/L,于26°C条件下250 r/min诱导过夜；
④诱导后立即将菌液在4°C条件下8000 Xg离心20 min，收集菌体(沉淀)，-20°C过夜备用。⑵重组蛋白的纯化
①从_20°C冰箱取出细菌，置于冰上15 min进行溶解；②按5 mL/g加入细胞裂解液将以上菌体重悬，再加入溶菌酶(Iysozyme)使终浓度达到lmg/mL,进行30 min冰浴；③使用功率为150 W的超声破碎仪于4°C超声5min后按10 μ g/mL加入RNA酶A，按5 μ L /mL加入DNA酶I，轻柔混匀后10 15 min冰浴；④于4°C重复2次离心(10 000 Xg, 20 min)，收集上清,0. 45 μ m微孔的滤膜除菌；⑤采用美国Novagen公司的GST标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。操作按说明是进行，将收集的重组蛋白于_20°C保存。纯化的目的蛋白经SDS-PAGE分析，分别可见其目的蛋白带(见图4)。纯化后蛋白浓度为8. 5μ g/μ L。实施例4
间接ELISA方法的建立 I封闭剂的选择
用纯化重组蛋白GST-MTFP包被酶标板，4°C过夜。甩去抗原液，洗涤液清洗3次(每次间隔311^11)，每孔加10(^1^封闭液(分别选择用PBST稀释的10 %胎牛血清、10 %正常兔血 清和5 %脱脂奶粉的PBS溶液为封闭液)，37°C封闭2 h ;洗涤液清洗3次(每次间隔3min)，分别加阳性血清和阴性血清，37 V孵育I. 5 h。洗涤，加入HRP标记的羊抗犬二抗，37 V孵育I h。洗涤后加入100 μ L底物，观察颜色变化。显色后，用2 mo I/L H2SO4终止反应。酶标仪测定0D49(lnm值。同时设阳性对照(P)、阴性对照(N)和空白对照，P/N > 2，判为阳性。5 %脱脂奶粉的PBS溶液封闭效果最佳。2抗原和一抗工作浓度的确定
分别取不同浓度的纯化重组蛋白GST-MTFP 20、10、5、2. 5,1. 25,0. 625μδ/孔的纯化重组蛋白包被酶标板，选择最佳封闭剂，用不同稀释倍数I : 20、1 40,1 80,1 160、
I 320... I 640,1 1280的阳性血清孵育，进行间接ELISA，确定抗原和一抗最佳工作浓度。抗原的最佳包被浓度为5Pg/100mL,最佳抗体稀释度为I : 160。3 HRP标记的羊抗犬二抗工作浓度的确定
选择最佳封闭剂，抗原和一抗按最佳工作浓度稀释，将HRP标记羊抗犬二抗稀释为不同浓度 1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000,1:8 000、1:16 000。加底物缓冲液显色，测定0D49(lnm值，确定二抗最佳工作浓度为I :2 000。4间接ELISA结果判定标准的确定
取15份参考阴性血清1:160稀释进行ELISA反应，分别检测15份健康的犬恶丝虫感染阴性犬血清0D49(lnm值平均值Γ为O. 077，标准差SD为0.022 (见表I)，因此阳性样品检出下限为7 +3SD=0. 143。为了减少假阳性和假阴性的出现，将临界值加减一个标准差作为可疑区间。因此当OD490nm彡O. 165时，样品判定为阳性;当OD彻nm < O. 121时，样品判定为阴性；当O. 165 ( 0D49(lnm < O. 121时，样品判定为可疑，但是需要重新检测。若重检时，OD490nm彡O. 143,样品判定为阳性；OD490nm < O. 143,样品判定为阴性。表I融合蛋白GST-MTFP间接ELISA结果判定标准的确定
权利要求
1.一种犬恶丝虫的保护性抗原基因，如SEQ ID NO. I所示。
2.权利要求I所述保护性抗原基因的扩增引物，其特征在于F2 :5 ’ - GGATCCCAACTTACGCAGGAAGCA - 3 ’，S2 :5，- CTCGAGCTCGAGTTAGCAGTAATTGATGCC _ 3 ’。
3.一种犬恶丝虫ELISA检测试剂盒，包括底物溶液、酶标物、酶标物稀释液、聚苯乙烯塑料反应板、PBS(磷酸盐缓冲液)、包被液、封闭液、洗涤液、终止液及样品稀释液、阳性及阴性标准血清； 所述纯化重组蛋白为利用从犬恶丝虫成虫cDNA表达文库中筛选出的与编码马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白的同源基因命名为MTFP(同源性88%)，在大肠杆菌疋coli BL21 (DE3)表达的MTFP蛋白作为抗原； 所述PBS稀释液为pH值7. 4的磷酸盐缓冲液； 包被液为PH值9. 6的碳酸盐缓冲液； 封闭液为5%的脱脂奶粉PBS液； 洗涤液为O. Olmol/L的pH值是7. 4的PBST溶液； 终止液为2mol/L H2SO4溶液； 酶标物为辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG (辣根过氧化物酶标记)； 底物溶液为PH值5. O的磷酸盐-柠檬酸缓冲液和H2O2配置的邻苯二胺(OPD)。
4.权利要求2所犬恶丝虫ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于以三聚氰胺为半抗原，通过与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原；通过完全抗原免疫小鼠、细胞融合、筛选及克隆化培养过程制备单克隆抗体；将单克隆抗体包被于酶标板制备包被三聚氰胺单克隆抗体的酶标板，再加入三聚氰胺酶标物、三聚氰胺标准液、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液及样品稀释液，组成ELISA试剂盒。
5.权利要求3所述犬恶丝虫ELISA检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤 ⑴样品前处理； ⑵用权利要求所述的ELISA检测试剂盒检测，用抗原包被酶标板(聚苯乙烯塑料反应板)，依次加入封闭液、待检被检血清、酶标物，期间分别洗涤，再加入底物溶液、显色液及终止液，终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度值； ⑶分析检测结果。
全文摘要
本发明提供了用于犬的犬恶丝虫ELISA检测试剂盒及制备方法，利用从犬恶丝虫成虫cDNA表达文库中筛选出的与编码马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白的同源基因命名为MTFP(同源性88%)，在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达的MTFP蛋白作为抗原，建立了检测犬的犬恶丝虫感染的间接ELISA方法。该检测特异性高、灵敏度高、准确性高、稳定性好。具有操作简单、检测快速，易于判断等优点，适合于临床的快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。
文档编号G01N33/569GK102798716SQ20111041952
公开日2012年11月28日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者张西臣, 侯洪烈, 李建华, 宫鹏涛, 张楠, 张国才, 杨举, 李 赫, 陈玉江 申请人:吉林大学