专利名称：一种联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法
技术领域：
本发明涉及一种联 合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法。
背景技术：
镉污染已在世界范围内普遍存在，进而导致在人类的主要食物中富集有一定量的镉，给人体健康带来了潜在的威胁。食物的安全检测是预防人体镉中毒的重要保障。目前，主要通过测定食物中镉的积累量来间接的评价其对人体的生物学效应，这难免存在很大的不准确性；动物实验也是评价食物安全性的一种方法，但由于动物实验存在周期长、操作复杂、易受实验因素(如其他饲料成分、实验条件、动物生理状况等)影响等，因此，毒性评价时往往存在偏差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用细胞培养技术，既将Caco-2细胞和293T细胞进行联合培养，从而建立起联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型的建立方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法，包括以下步骤(I)食物样品消化和测定液获取a.食物样品收集后，磨碎，采用胃液和肠液依次消化；b.将消化混合液离心，收取上清液，高压灭菌；(2)单独培养Caco-2细胞和293T细胞a. Caco-2细胞(人结肠癌细胞系)培养于六孔板插入槽的聚碳酸酯膜上；b. 293T细胞(人胚肾T细胞系)培养于另一块六孔板的底部；(3) Caco-2细胞和293T细胞的联合培养将培养有Caco-2细胞的插入槽移入培养有293T细胞的六孔板中，继续培养24h ；(4)镉生物有效性和毒性评价将食物样品测定液置于联合培养模型的Caco-2细胞层上，同时在293T细胞层上加入等渗的孵育液，继续培养24h ;慢性毒性试验时，可最长联合培养IOd(5)指标检测a.用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术测定细胞吸收的镉量；b.通过观察细胞的形态学、MTT比色、LDH活性、细胞凋亡以测定镉对细胞的毒性。步骤(I)食物样品消化和测定液获取方法具体包括以下步骤收集待检测的食物样品，磨碎，依次通过pH2. 0的胃蛋白酶消化液，37°C恒温水浴箱里消化Ih ；pH7. 0的胰酶-胆汁榨取物消化液，37°C恒温水浴箱里消化2h ;离心，收取上清液作为测定液；将测定液高压灭菌。
步骤(2)Caco_2细胞和293T细胞单独培养方法具体为具体为Caco_2细胞和293T细胞单独培养于25cm2培养瓶中，并定期换液、传代和细胞形态结构观察，保证细胞培养过程中不受污染，形态结构正常；达到试验需要的数量后，将Caco-2细胞转入六孔培养板的插入槽上培养；293T细胞转入另一个六孔培养板的底部培养。步骤(3)Caco_2细胞和293T细胞联合培养方法具体为通过测定Caco_2细胞层甘露醇透过率和细胞跨膜电阻值，以评价Caco-2细胞层的完整性，甘露醇透过率低于0. 5% .^1 cm_2，细胞跨膜电阻值稳定高于250 Q cm2 ;通过相差显微镜下观察293T细胞层形态良好，结构完整、紧密；将培养有Caco -2细胞的插入槽移入培养有293T细胞的培养板中，并在插入槽上部和培养板底部加入培养液，37°C二氧化碳培养箱中联合培养24h。步骤(5)指标检测具体为吸取底部孵育液，收取Caco-2细胞和293T细胞，100°C烘干，加入5mL浓硝酸和5滴30%的双氧水，于80°C加热，残余物用I. 4M的硝酸液溶解，获得消化液。用ICP-MS技术测定孵育液和消化液中镉含量，以Caco-2细胞内镉、293T细胞内镉、底部孵育液镉之和作为评价食物镉蓄积对人体的生物有效性。通过观察Caco-2细胞和293T细胞的形态学、MTT比色、试剂盒测定LDH活性、流式细胞仪检测细胞凋亡，以评价镉对细胞的毒性。本发明将人结肠癌细胞系(Caco-2)细胞和人体肾胚T细胞系(293T)进行联合培养，建立联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型，通过测定细胞吸收镉评价镉蓄积对人体的生物有效性、通过观察细胞形态学、MTT比色、LDH活性、细胞凋亡评价镉蓄积对人体的毒性，并藉此建立一套用于食物重金属污染物对人体生物有效性和毒性的联合评价方法体系。即通过分析食物中重金属在肠道的吸收率，并进入相关器官的过程，研究机体整体生物学状况和功能调节，从细胞水平进行毒性效应研究，为人体膳食安全预警提供依据。本发明方法的建立可快速、准确、简便的评价食物镉积累对人体的生物有效性和毒性。与传统的以食物中镉蓄积量作为指标评价其对人体的毒性相比，该发明具有更加准确和高度模拟性的特点；与动物镉毒性试验相比，该发明具有操作简单、试验条件易控制、污染小、经济、结果准确等特点，并具有生物有效性和毒性联合评价的优点。适合谷物、蔬菜和动物性食物镉蓄积的安全性评价。
具体实施例方式实施例I :水稻镉蓄积对人体的生物有效性和毒性(I)收集水稻籽粒，磨碎，依次通过PH2.0的胃蛋白酶消化液，37°C恒温水浴箱里消化Ih ；pH7. 0的胰酶-胆汁榨取物消化液，37°C恒温水浴箱里消化2h ;离心，收取上清液，将上清液高压灭菌；(2)将上清液与培养液(不含镉)均匀混合，制成混合液，吸取2. 5mL混合液加入已经建立的联合培养模型的Caco-2细胞层上，同时，吸取等渗的培养液2. 5mL加入293T细胞层上，继续在37°C二氧化碳培养箱中培养24h ;若食物镉蓄积量低，可进行慢性毒性试验，最长继续培养IOd ；(3)吸取底部孵育液收取Caco-2细胞和293T细胞，100°C烘干，加入5mL浓硝酸和5滴30%的双氧水，于80°C加热，残余物用I. 4M的硝酸液溶解，获得消化液，用ICP-MS技术测定孵育液和消化液中镉含量。
(Caco-2细胞内镉+293T细胞内镉+底部孵育液镉)
镉生物有效性(％) =X 100%
水稻籽粒镉蓄积总量通过观察Caco-2细胞和293T细胞 的形态学、MTT比色和试剂盒检测LDH活性、流式细胞仪检测细胞凋亡，以评价镉对细胞的毒性。实施例2 :动物肝脏镉蓄积对人体的生物有效性和毒性(I)将动物肝脏煮熟，磨碎，依次通过pH2. O的胃蛋白酶消化液，37°C恒温水浴箱里消化Ih ；pH7. O的胰酶-胆汁榨取物消化液，37°C恒温水浴箱里消化2h ;离心，收取上清液，将上清液高压灭菌；(2)将上清液与培养液(不含镉)均匀混合，制成混合液，吸取2. 5mL混合液加入已经建立的联合培养模型的Caco-2细胞层上，同时，吸取等渗的培养液2. 5mL加入293T细胞层上，继续在37°C二氧化碳培养箱中培养24h ;若食物镉蓄积量低，可进行慢性毒性试验，最长继续培养IOd ；(3)吸取底部孵育液。收取Caco-2细胞和293T细胞，100°C烘干，加入5mL浓硝酸和5滴30%的双氧水，于80°C加热，残余物用I. 4M的硝酸液溶解，获得消化液，用ICP-MS
技术测定孵育液和消化液中镉含量。
(Caco-2细胞内镉+293T细胞内镉+底部孵育液镉)
镉生物有效性(％) =_ X 100%
肝脏中镉蓄积总量通过观察Caco-2细胞和293T细胞的形态学、MTT比色和试剂盒检测LDH活性、流式细胞仪检测细胞凋亡，以评价镉对细胞的毒性。
权利要求
1.ー种联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于包括以下步骤 (1)食物样品消化和測定液的获取 a.食物样品收集后，磨碎，采用胃液和肠液依次消化； b.将消化混合液离心，收取上清液，高压灭菌； (2)单独培养Caco-2细胞和293T细胞 a.Caco-2细胞(人结肠癌细胞系)培养于六孔板插入槽的聚碳酸酯膜上； b.293T细胞(人胚肾T细胞系)培养于另一块六孔板的底部； (3)Caco-2细胞和293T细胞的联合培养 将培养有Caco-2细胞的插入槽移入培养有293T细胞的六孔板中，继续培养24h ； (4)镉生物有效性和毒性评价 将食物样品測定液置于联合培养模型的Caco-2细胞层上，同时在293T细胞层上加入等渗的孵育液，继续培养24h ;慢性毒性试验时，可最长联合培养IOd ； (5)指标检测 a.用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术测定细胞吸收的镉量； b.通过观察细胞的形态学、MTT比色、LDH活性、细胞凋亡以测定镉对细胞的毒性。
2.根据权利要求I所述的联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于步骤(I)食物样品消化和測定液获取方法具体包括以下步骤收集待检测的食物样品，磨碎，依次通过PH2. O的胃蛋白酶消化液，37°C恒温水浴箱里消化Ih ；pH7. O的胰酶-胆汁搾取物消化液，37°C恒温水浴箱里消化2h ;离心，收取上清液作为测定液；将測定液高压灭菌。
3.根据权利要求I所述的联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于步骤(2) Caco-2细胞和293T细胞单独培养方法具体为具体为Caco-2细胞和293T细胞单独培养于25cm2培养瓶中，并定期换液、传代和细胞形态结构观察，保证细胞培养过程中不受污染，形态结构正常；达到试验需要的数量后，将Caco-2细胞转入六孔培养板的插入槽上培养；293T细胞转入另ー个六孔培养板的底部培养。
4.根据权利要求I所述的联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于步骤(3) Caco-2细胞和293T细胞联合培养方法具体为通过测定Caco-2细胞层甘露醇透过率和细胞跨膜电阻值，以评价Caco-2细胞层的完整性，甘露醇透过率低于O. 5% · IT1 · cm_2，细胞跨膜电阻值稳定高于250 Ω. cm2 ;通过相差显微镜下观察293T细胞层形态良好，结构完整、紧密；将培养有Caco-2细胞的插入槽移入培养有293T细胞的培养板中，并在插入槽上部和培养板底部加入培养液，37°Cニ氧化碳培养箱中联合培养 24h。
5.根据权利要求I所述的联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于步骤(5)指标检测具体为吸取底部孵育液，收取Caco-2细胞和293T细胞，100°C烘干，加入5mL浓硝酸和5滴30%的双氧水，于80°C加热，残余物用I. 4M的硝酸液溶解，获得消化液；用ICP-MS技术测定孵育液和消化液中镉含量，以Caco-2细胞内镉、293T细胞内镉、底部孵育液镉之和作为评价食物镉蓄积对人体的生物有效性。
全文摘要
本发明涉及一种联合评价食物镉蓄积对人体生物有效性和毒性的模型建立方法，包括以下步骤(1)食物样品消化和测定液的获取a.食物样品收集后，磨碎，采用胃液和肠液依次消化；b.将消化混合液离心，收取上清液，高压灭菌；(2)单独培养Caco-2细胞和293T细胞；(3)Caco-2细胞和293T细胞的联合培养将培养有Caco-2细胞的插入槽移入培养有293T细胞的六孔板中，继续培养24h；(4)镉生物有效性和毒性评价将食物样品测定液置于联合培养模型的Caco-2细胞层上，同时在293T细胞层上加入等渗的孵育液，继续培养24h；慢性毒性试验时，可最长联合培养10d；(5)指标检测。本发明具有操作简单、试验条件易控制、污染小、经济、结果准确等特点，并具有生物有效性和毒性联合评价的优点。适合谷物、蔬菜和动物性食物镉蓄积的安全性评价。
文档编号G01N33/02GK102680654SQ20111042798
公开日2012年9月19日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者何万领, 张才, 张纪亮, 李健, 李元晓, 李旺, 李晓丽, 杨盼盼 申请人:河南科技大学