磷脂轮廓分析和癌症的制作方法

专利名称：磷脂轮廓分析和癌症的制作方法
技术领域：
一般情况下，本发明通过使用磷脂轮廓分析提供预后与预测性的方法和工具包，以确定受试者体内肿瘤的脂肪生成，其中单一不饱和磷脂物种的相对增加及多聚不饱和磷脂物种的相对减少是指示更强和更具侵略性的脂质生成癌症表现型。本发明的背景癌症是细胞不受控制地生长，进而形成肿瘤并最终可能入侵其他组织(癌扩散)。癌症影响所有年龄人士，它是人类死亡的主要原因，而其中肺癌、胃癌、大肠癌和肝癌是最致命的。男性最常出现的癌症是前列腺癌，女性则是乳腺癌。全球每年有11万人被诊断出 患有癌症。将近7万人死于这种疾病。许多癌症类型的治疗方案和介入治疗成功率很大程度上取决于诊断时的疾病阶段。在许多情况下，早期的发现是非常重要的，这是因为它能大大提高治疗的成功率。然而，进行早期检测的筛查计划会增加潜伏和无临床意义肿瘤的检出率。这带来了过度治疗的巨大风险，由于对于病情恶化没有有效的测试，因此这是一个巨大的临床困境。另一方面，尽管进行局部的积极治疗，生化衰竭仍是显着的。为数不少的患者会患有临床转移性疾病或在临床分期期间已发生潜伏性转移。加上肿瘤可能对指定类型的治疗产生不同反应的事实，这些情况强调有必要为治疗决策作出的可靠准则。目前，许多癌症的治疗决策主要是根据原发肿瘤的病理组织学 ^肿瘤、淋巴结、转移)系统及组织分化程度。由于这些系统只提供肿瘤的特别图片，肿瘤特征内以分子为基础的深刻见解无疑将有助于更准确地预测进展和治疗反应，并有助于选择更合适的主要和/或辅助性治疗方案。分子解析方法的最新进展在这方面扮演着重要角色，并有能力彻底改变诊断和治疗癌症的方式。到现在为止，针对分子鉴定和癌症分期所作的大部分努力都在DNA或RNA水平进行(筛检基因突变、表观遗传学分析或转录分析)。例如，基因表达分析可以预测前列腺癌(G. V. et al. , J. CHn. Invest. 113 :913-923 (2004))及乳癌(Van, t Veer et al. Nature415 :530-536(2002))的临床疗效。此外，Glins ky et al. (J. Clin. Invest. [upsilon]5 1503-1521 (2005))说明了 BMIl致癌基因表达的改变与患有多类型癌症的患者的预后不良样本相关联。然而，这些预测指标的使用大多只限于一种或几种类型的癌症，而不能普遍适用于所有类型的癌症。因此，改变更多的下游也许将更具意义，因为它们代表了细胞调节的更末梢端点、整合多样化(EPI)基因、监管和环境因素。在这方面特别令人感兴趣的是膜脂构成的改变。作为分离和划分细胞含量的屏障，细胞膜的作用是一个独特的界面，从而集中和调节许多的细胞过程(包括信令、养分运输、细胞分裂、呼吸、细胞死亡机制等等)。越来越多的证据显示了细胞膜脂质，特别是磷脂物种的改变在本规例中发挥了核心作用(Marguetet al. , 2006)o磷脂是一种由头基(肌醇、胆碱、乙醇胺、丝氨酸等等)和I至4脂肪酸链组成的复杂细胞脂质类，其中脂肪酸链的长度和饱和现象数量(双键)都不同，因而生成数百种不同的物种。这些脂质的构建模块可以通过循环得来，但有些也可以重新被合成。大多数细胞表达了能动态地修改脂质结构的复杂途径。这可以显着地更改它们的化学性质和局部地调整细胞膜的生物化学和生物物理特性。越来越多的证据表明在肿瘤中，磷脂代谢与正常组织有显着的不同。虽然大多数正常组织都通过血液循环获得大部分所需要的脂质，肿瘤细胞则大多数会通过它们的脂质新生(Kuhajada,2006 ;Swinnen et al. ,2006 ；Menendez et al. ,2008 ；Brusselmans etal.，2009)。脂肪合成酶的过量表达正好说明了这，举例如某些肿瘤内的脂肪酸合酶，特别是那些预后不良的。这一途径的抑制作用衰减了肿瘤的生长，杀死癌细胞并使他们更能适应各种的癌症治疗方法，这表明脂质生成表现型有助于逆转癌症的发展，而肿瘤的脂肪生成是侵略性和不佳反应肿瘤的标志物。然而，由于这种脂肪合成途径的激活涉及了酶调节的多层次变化(遗传变化、增强转录和翻译、蛋白质的稳定和磷酸化、变构调节和基质通量)，目前并无可用来识别一般脂质生成肿瘤的可靠标志物。此外，所述脂质生成途径的激活出现在各种常见致癌事件的下游(PTEN损失、Akt的活化、BRCAl基因损失、类固醇激素作用、肿瘤相关性缺氧等等)(Kuhajada, 2006 ；Swinnen et al. , 2006),因此,所述的诸如 PTEN、AKT、BRCA1等常见癌症标志物对于确定肿瘤是否为脂质生成也没有什么用处。此外，所述脂质生成途径的激活出现在各种常见致癌事件的下游(PTEN损失、Akt的活化、BRCAl基因损失、类固醇激素作用、肿瘤相关性缺氧等等)(Kuhajada, 2006 ;Swinnen et al.,2006)，因此，所述的诸如PTEN、AKT、BRCAl等常见癌症标志物对于确定肿瘤是否为脂质生成也没有什么用处。所述标志物可用于预测一般肿瘤的发展以及分析癌症治疗的效果。我们现在已经发现了脂质生成肿瘤与非脂质生成肿瘤相比，有着明显不同的磷脂轮廓。因此，通过利用磷脂轮廓分析，脂质生成肿瘤可以很容易地从非脂质生成肿瘤区分开来，使得更容易为每个病人进行微调的癌症治疗。前面已介绍过膳食脂肪酸和患上癌症的风险之间的相关性。举例来说，过量摄入特别是N-6多聚不饱和脂肪酸(亚油酸；Godley et al. , 1996and Gann et al. , 1994)、饱和脂肪酸(棕榈酸；Harvei et al. , 1997)(肉豆蘧酸；MSnnistS et al. , 2003),及单饱和脂肪酸(棕榈酸；Harvei et al.，1997)已证明了患癌风险加大的关联。此外，膳食脂肪酸也被证明跟肿瘤的侵略性有关联。举例来说Crowe et al.表明了棕榈酸(饱和脂肪酸)与低度恶性(较少攻击性)的前列腺癌呈正相关，而豆蘧酸(饱和脂肪酸)以及亚麻酸和二十碳五烯酸(均是n-3多聚不饱和脂肪酸)与高度恶性(侵略性)的前列腺癌呈正相关(Crowe etal.，2008)。然而，由于脂质生成肿瘤重新合成它们大部分的磷脂，膳食脂肪酸水平大多不能用于分析肿瘤的脂肪合成。此外，虽然一些非复杂型磷脂轮廓被发现跟肿瘤的致瘤性有关，但目前为止并没有描述与所述肿瘤的脂肪生成有任何相关性。举例来说，Le Bivic et al. (1987)表明了单元不饱和对多聚不饱和磷脂的比例在高致瘤性的人类黑色素瘤细胞株内有所增加。类似的结果也出现在二乙基亚硝胺(DEN)诱发肝癌的微粒和线粒体，相比起正常肝细胞中所发现的，单元不饱和对多聚不饱和PC和PE脂肪酸的比例有所增加(Canuto et al.，1989)。两位作者采用类似的技术来分离和分析个别的脂质物种。总脂质首先会被提取至氯仿-甲醇，然后用薄层色谱法(TLC)分离不同类别的磷脂的。磷脂馏分物会被处理，以获得脂肪酸甲酯，再通过气液色谱法(GLC)进行进一步的分析。虽然GLC给予我们有关细胞脂肪酸组成的概念，但只有数量有限的独特脂肪酸可被检测到，从而生成非复杂型磷脂轮廓。到目前为止,这些有限的轮廓已被链接到致瘤性,这些研究没有一个暗示或显示这些有限的磷脂轮廓与肿瘤的脂肪生成有任何可能的关联。我们现已发现磷脂轮廓对于预测所有类型的肿瘤脂肪生成都是有用的。此外，它可以为每位患者微调癌症治疗，以及分析癌症治疗的效果。特别是，我们发现单一不饱和磷脂物种的普遍增加及多聚不饱和磷脂物种的整体减少与FASN表达的增加有关，并提高了肿瘤细胞对细胞凋亡、应力自由基和化疗的抵抗。这些研究结果表明细胞膜磷脂轮廓分析可用于预后及预测性试验的发展，以评估患者肿瘤的脂肪生成。特别是，单一不饱和卵磷脂的普遍增加及多聚不饱和卵磷脂的整体减少与FASN表达的增加有关，并提闻了肿瘤细胞对细胞凋亡、应力自由基和化疗的抵抗。使用这种磷脂轮廓作为预测性/预后标志物将有助于制成一个更个性化的药物， 据。这些进展将使能让医生根据患者的个性化需求定制治疗。它也能避免因过度治疗而导致多余的发病率和副作用(即，免去患者在面对非侵略性或过于先进的疾病时接受侵入性手术过程)，并能优化现有资源的使用。本发明的概要本发明的目的是提供一种确定受试者体内肿瘤脂肪生成的体外预后或预测性方法，所述方法包括确定肿瘤样本与正常样本中至少I单一不饱和磷脂和至少I个多聚不饱和磷脂的相对表达水平；其中所述单一不饱和磷脂的相对表达水平增加及所述多聚不饱和磷脂的相对表达水平减少是指示更具侵略性的脂质生成表现型。在进一步的实施方案中，根据本发明的体外方法包括了 ；确定肿瘤样本与正常样本中至少I单一不饱和磷脂和至少I个多聚不饱和磷脂的表达水平；其中肿瘤样本相较正常样本的单一不饱和与多聚不饱和磷脂的比例增加表明是更具侵略性的脂质生成表现型。在进一步的实施方案中，根据本发明的体外方法包括了 ；确定患者体内肿瘤的脂质生成轮廓；其中具有一个或两个不饱和现象的物种增加(在酰基链中)及具有超过3个不饱和现象的PL物种减少表明是更具侵略性的脂质生成表现型，尤其是所述的PL物种是卵磷脂物种。在进一步的实施方案中，磷脂是选自包括甘油磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、、和磷酸肌醇的组别，其中优选为卵磷脂。在进一步的实施方案中，饱和磷脂是饱和卵磷脂物种，选自包含PC30 :0、PC32 :0、PC34 :0、PC36 :0、及PC38 0的组别；和/或饱和磷脂酰乙醇胺，选自包含PC36 0及PC38 0的组别；和/或饱和磷脂酰丝氨酸，选自包含PS36 :0、PS38 :0、PS40 :0及PS42 0的组别；和/或饱和磷酯醢肌醇，选自包含PI34 :0、PI36 :0及PI38 0的组别。在另进一步的实施方案中，单一不饱和磷脂是拥有一个或两个单一不饱和脂肪酸链的卵磷脂(PC)，选自包含 PC30 :1、PC30 :2、PC32 :1、PC32 :2、PC34 :1、PC34 :2、PC36 :1、PC36 :2、PC38 1及PC38 2的组别；和/或拥有一个或两个单一不饱和脂肪酸链的磷脂酰乙醇胺(PE)，选自包含PE32 1及PE34 2的组别；和/或拥有一个或两个单一不饱和脂肪酸链的磷脂酰丝氨酸(PS)，选自包含PS36 :2、PS38 :2、PS40 :2及PS42 2的组别；和/或拥有一个或两个单一不饱和脂肪酸链的磷酯醢肌醇(PI)，选自包含PI34 :1、PI36 :1、PI38 :1、PI34 :2、PI36 :2 及 PI38 2 的组别。在进一步的实施方案中，多聚不饱和磷脂是多聚不饱和卵磷脂(PC)，选自包含PC34:3、PC34 :4、PC36 :3、PC36 :4、PC36 :5、PC38 :3、PC38:4、PC38 :5、PC38 :6、PC40 :3、PC40 :4、PC40 :5、PC40 :6及PC40 :7的组别；和/或多聚不饱和磷脂酰乙醇胺(PE)，选自包含PE36 :4、PE38 :4及PE40 :4的组别；和/或多聚不饱和磷脂酰丝氨酸(PS)，选自包含PS38 :4、PS40 :4、PS38 :5、PS40 5及PS38 6的组别；和/或多聚不饱和磷酯醢肌醇(PI)，选自包含PI36 :4及PI38 4的组别。在首选的实施方案中，单一不饱和磷脂是单一不饱和卵磷脂(PC)PC34 :1，而多聚不饱和磷脂是多聚不饱和卵磷脂(PC)，选自包含PC36 :3、PC38 :3、PC36 :4、PC38 :4、PC40 4、PC36 :5、PC38 :5、PC40 :5 的组别。在另一个首选的实施方案中，单一不饱和磷脂是单一不饱和卵磷脂(PC)PC34:1，而多聚不饱和磷脂是多聚不饱和卵磷脂(PC)PC36 :4或PC38 :4。在进一步的实施方案中，除 了确定磷脂轮廓外，侵略性脂质生成表现型的一个或多个其他生物标志物的相对表达水平也将被确定，举例但不限于FASN (脂肪酸合酶)、ACCA (乙酰辅酶A羧化酶、胆碱激酶及ACLY(ATP柠檬酸裂解酶)的表达。具有侵略性脂质生成表现型的肿瘤可能通过单一不饱和磷脂的相对表达水平增加及多聚不饱和磷脂的相对表达水平减少来鉴定，以及侵略性脂质生成表现型的一个或多个其他生物标志物的表达或磷酸化/活化增加。另外，具有侵略性脂质生成表现型的肿瘤也可能通过肿瘤样本相较正常样本的单一不饱和与多聚不饱和磷脂比例增加来鉴定，以及侵略性脂质生成表现型的一个或多个其他生物标志物的表达增加。本发明还涉及到使用根据本发明的体外方法来确定患者体内肿瘤的脂肪生成。最后，本发明提供了一个根据本发明执行体外方法的工具包，所述工具包包含了 ；ESI_MS/MS试剂的完整磷脂样品制备，尤其是抗氧化剂、溶剂和标准。图样简单说明图I. Soraphen治疗对完整卵磷脂物种的影响。用soraphen (100纳米)或赋形剂(对照组)处理LNCaP细胞72小时。制备脂质提取物，用ESI-MS/MS以MRM模式对卵磷脂物种进行分析。指示主要物种和它们的物种分配的m/z。Std是指脂质标准。用三个样本(1-3)进行脂质轮廓分析，并以平均值为表示。个别脂质物种在经soraphen处理后与对照样本相比,变动情况以倍数变化(log2)为表示。图2. A.用免疫印迹分析测定脂肪酸合成酶(FASN)在五对恶性与正常前列腺组织标本的表达，其表达被标准化为￠-肌动蛋白表达。数值以肿瘤相对正常组织的比例为表示。B.用ESI-MS/MS以MRM模式记录PC物种在五对恶性与正常前列腺组织标本的相对丰度。结果显示于左侧面板，以个别脂质物种相比正常(黑条)及恶性(灰条)样本中总磷脂酰胆碱水平的百分比为表示；而右侧面板是个别脂质物种的正常与恶性样本的倍数变化(log 2)。图3. (A) soraphen、过氧化氢和棕榈酸对脂质过氧化产物的影响。在存在或缺乏外源性棕榈酸(75 iiM)的情况下，用soraphen (100纳米)或赋形剂(对照组)处理LNCaP细胞72小时。细胞在最后的2小时暴露于200 y M的过氧化氢。使用脂质过氧化检测试剂盒分析等量的细胞，以确定是否有脂质过氧化产物。数据代表平均值土标准差(n=4)。*与没有过氧化氢曝光的控制有显着性差异(P〈0. 05)。#与过氧化氢或soraphen的单独治疗有显着性差异(P〈0. 05)。图4. (A)脂肪酸从头合成对⑶36阳性细胞识别的影响。在存在或缺乏外源性棕榈酸(75 ii M)的情况下，用soraphen (100纳米)或赋形剂(对照组)处理LNCaP细胞72小时。细胞在最后的30分钟暴露于300 M的过氧化氢。细胞被胰蛋白酶消化，标记上细胞示踪染料CMRA，并放在已转染⑶36化^36)质粒或相应空载体(？￡ -803)的C0S-7细胞顶部。I小时后，培养细胞被广泛地清洗和扫描。使用Adobe Photoshop软件对荧光进行量化。数据代表平均值土标准差U=3)。*与控制有显着性差异(P〈0.05)。(B)脂肪酸从头合成对细胞因氧化压力介导的细胞死亡的敏感性所带来的影响。在存在或缺乏外源性棕榈酸(75 ii M)或混合10%棕榈酸、45%亚油酸和45%亚麻酸(PUFA)(共75 u M)的情况下，用soraphen (100纳米)或赋形剂(对照组)处理LNCaP细胞72小时。细胞在最后的24小时暴露于300 PM的过氧化氢。收集细胞及沾上台盼蓝，以评估细胞的活力。数据代表平均值土标准差(n=3)。*与控制有显着性差异(P〈0. 05)。图5. (A) Soraphen对阿霉素触发率的影响。在有或没有soraphen (100纳米)的情况下培养LNCaP细胞72小时。在最后的24小时往细胞加入NBD-DHPE (IOuM)0在分析前的一个小时，用赋形剂或维拉帕米(100 u M)处理细胞。收集等量的细胞，添加阿霉素(IOy M)，持续监测和NBD荧光以确定阿霉素的NBD猝灭水平。数据代表平均值土标准差(n=4)。*与控制有显着性差异(P〈0. 05)。(B)定量soraphen对LNCaP细胞内阿霉素积累的影响。在存在或缺乏外源性棕榈酸(75 iiM)的情况下，以soraphen (100纳米)或不用soraphen处理LNCaP细胞72小时。在分析前的三十分钟，加入10 y M阿霉素至细胞内。准备细胞提取物，并以荧光测定法确定霉素含量。数据代表平均值土标准差U=4)。*与控制有显着性差异(P〈0. 05)。(C) Soraphen和棕榈酸对LNCaP细胞内阿霉素诱导的细胞毒性的影响。在存在或缺乏外源性棕榈酸(75 iiM)的情况下，以soraphen (100纳米)或不用soraphen处理LNCaP细胞72小时。在最后的24小时往细胞加入阿霉素(4 y M)或赋形剂。 收集细胞及沾上台盼蓝，以评估细胞的活力。数据代表平均值土标准差(n=6-12)。*与控制有显着性差异(P〈0. 05)。#与soraphen或阿霉素的单独治疗有显着性差异(P〈0. 05)。图6. 13位前列腺癌患者的前列腺肿瘤内的磷脂物种与正常前列腺组织的平均相对变化(log2)。磷脂根据脂质类别(PC、PE、PS和PI)进行排序。聚类分析将患者分为2个主要群组。群组A :有脂质生成表现型9位患者(图6A);群组B :没有脂质生成表现型4位患者(图6B)。本发明的描述本发明的目的是提供一种确定受试者体内肿瘤脂肪生成的体外方法，所述方法包括确定肿瘤样本与正常样本中至少I单一不饱和磷脂和至少I个多聚不饱和磷脂的相对表达水平；其中所述单一不饱和磷脂的相对表达水平增加及所述多聚不饱和磷脂的相对表达水平减少是指示更具侵略性的脂质生成表现型。在进一步的实施方案中，根据本发明的体外方法进一步包括了确定至少I个饱和磷脂的相对表达水平；其中所述饱和磷脂的相对表达水平减少、所述单一不饱和磷脂的相对表达水平增加及所述多聚不饱和磷脂的相对表达水平减少是指示更具侵略性的脂质生成表现型。本发明的进一步目的是提供一种确定受试者体内肿瘤脂肪生成的体外方法，所述方法包括确定肿瘤样本与正常样本中至少I单一不饱和磷脂和至少I个多聚不饱和磷脂的表达水平；其中肿瘤样本相较正常样本的单一不饱和与多聚不饱和磷脂比例增加是指示更具侵略性的脂质生成表现型。在进一步的实施方案中，本发明的方法包括确定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单一不饱和磷脂的相对表达水平。在更进一步的实施方案中，本发明的方法包括确定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个多聚不饱和磷脂的相对表达水平。本文中所使用的肿瘤被定义大量异常增长的细胞。对本发明有用的肿瘤包括但不 限于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、卵巢、子宫内膜癌、肝癌、食道癌、膀胱癌、口腔癌、甲状腺癌、胰腺癌、视网膜和皮肤癌，优选为前列腺癌。肿瘤样本是指在患者体内切除肿瘤之前或之后所取出的样本。正常的样本是指为了确定基准线表达水平而获取的样本。因此，正常的样本可通过许多方法从非癌变细胞或组织取得，例如，受试者肿瘤或癌细胞周围的细胞；来自没有癌症的受试者；来自没被怀疑有患癌风险的受试者；或源于这类受试者的细胞或细胞株。正常的样本还包括了先前建立的标准，举例如先前建立的癌细胞株。因此，根据本发明进行的任何测试或检测可能会与已建立的标准相比，未必每次都需要获取正常样本作比较。样本可以是任何组织、细胞、细胞提取物、尿液、血清、全血、血浆浓缩，从血浆/血或尿分离出来的任何析出物，举例如外泌体(以下也简称为细胞微粒子)，又举例如有从患癌受试者或健康志愿者分离出来的样本。“样本”也可能是在实验条件下创建的细胞或细胞系，而不是直接从受试者身上分离出来。受试者可以是人类、大鼠、小鼠、非人类灵长类动物、猫等等。例如，外泌体可以从癌症病人的尿液、血液或血清样本中提取。由于所述外泌体的细胞膜代表了癌细胞的细胞膜，这些外泌体的磷脂轮廓分析相比起直接从癌组织取得的磷脂轮廓分析是很好的替代方式，更重要的是这是一种侵入性较低的方法。随着时间的推移，这可以更容易追随肿瘤的进展，而无需每一次都进行肿瘤活检。举例来说，所述外泌体可以通过实验室芯片技术进行分离，同时也允许后续的磷脂轮廓分析，从而允许高通量的筛选。后者的外泌体(细胞微粒子)可以根据先前出版物所描述的以差速离心法进行分离(ValadiH, Ekstrom K, Bossios A, Sjostrand M, Lee JJ, Lotvall JO :外切体介导的 mRNA 和microRNA的转移是细胞之间的基因交换的新机制。Nat CellBiol 2007 ；9 :654-659_ZhangY，Liu D，Chen X，Li J,Li L，BianZ，Sun F，Lu J,Yin Y，Cai X，Sun Q,Wang K，Ba Y, WangQ, WangD, Yang J, Liu P, Xu T, Yan Q, Zhang J, Zen K, Zhang CY :分泌性单核细胞 miR-150增强针对性的内皮细胞迁移。Mol Cell2010 ;39 :133-144)。简言之，以300克、16，500克用离心法取出细胞和其他杂物后，以100，000克用离心法将上层清液分离70分钟(所有步骤以4° C温度进行)。外泌体取自于颗粒状物，并再次悬浮于无RNase水中。用流式细胞仪测定外泌体在超速离心法后的存在。为了确认囊泡的正确大小，使用I微米磁珠(表达载体)设置流式细胞仪的闸门，产生用于以下所述之微流控芯片的细胞微粒子。使用本发明的体外方法将能确定肿瘤的脂肪生成，并预测肿瘤发展成恶性表现型的潜力或预测肿瘤对抗癌疗法作出反应的潜力。所述抗癌疗法包括了现有技术已获知的任何疗法，举例但不限于化疗和放疗等等。此外，根据本发明的体外方法非常适合用于确定有可能对旨在抑制肿瘤脂肪生成的疗法作出反应患者子集，所述疗法包括但不限于涉及脂肪酸合成，诸如FASN、乙酰辅酶A羧化酶、胆碱激酶及ATP柠檬酸裂合酶的酵素抑制剂。所述抑制剂可用作单一治疗或用于已知癌症疗法中的敏化剂。正因为如此，根据本发明的体外方法也可以用来判断患者是否能对抗脂肪生成治疗作出反应。具侵略性脂质生成表现型是指内源性脂肪酸新生的肿瘤及令患者预后较差的肿瘤，也就是说相比起能令患者拥有较高预后存活质量的肿瘤，这类肿瘤对抗癌疗法较无反应及/或较有可能恶化或发生转移。磷脂是一种作为细胞膜重要组成部分且可以形成脂质双分子层的脂质。大多数磷脂皆包含一个甘油二酯、磷酸基团和一个简单的有机分子，如磷脂酰胆碱(PC)内的胆碱、磷脂酰肌醇(PI)内的肌醇、磷脂酰丝氨酸(PS)内的丝氨酸和磷脂酰乙醇胺(PE)内的乙醇胺。甘油二酯包含了 2个脂肪酸链，通过酯键共价连结甘油分子。脂肪酸是一种拥有至少4个碳原子组成无支链脂肪族的羧酸，视乎双键的存在，这些脂肪酸可以是饱和或不饱和。饱和 脂肪酸是脂肪族不含双键的脂肪酸，单一不饱和脂肪酸是脂肪族含有一个双键的脂肪酸，而多聚不饱和脂肪酸的脂肪族则含有2、3、4、5、6、7或更多双键。根据本发明的磷脂选自包含甘油磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、鞘氨醇磷月旨、磷脂酰丝氨酸和磷酸肌醇的组别。其中举例如甘油磷脂，它包含一个连接到甘油二酯的甘油首碳的磷酸基团，而鞘氨醇磷脂(如鞘磷脂)，其中它的磷酸基团被酯化到鞘氨基醇。另一个有关鞘氨醇磷脂的例子是硫苷脂，它包含了让分子两亲性的离子硫酸组。当然，磷脂也可能包含进一步的化学群体，举例如连接到磷酸基团的醇。这种醇组的例子包括了丝氨酸、乙醇胺、胆碱、甘油和肌醇。因此，具体的甘油磷脂包括了磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油或磷脂酰肌醇。其他磷脂包括了磷脂酸或二乙酰磷酸。一方面，磷脂酰胆碱包含了二油酰磷脂酰胆碱(又名心磷脂)、卵-磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、豆蘧酸单磷脂酰胆碱、棕榈酸磷脂酰胆碱、单硬脂酸磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰胆碱、丁酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、二辛酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱。磷脂的表达水平是指以任何合适的方法来确定完整的磷脂水平，举例如通过ESI-MS/MS分析。在所述的方法中，磷脂将根据电离物种的强度来确定，以个别磷脂的强度水平相对于所有测量磷脂的总强度水平的百分比作为表达。磷脂的相对表达水平是指肿瘤样本中磷脂表达水平相较于正常样本中磷脂的表达水平的差异。在一些实施方案中，相对表达水平可能会在不同的时间点被确定，如治疗之前、期间及之后。相对表达水平可能会以任何合适的方式作为表达，如log2。如果log2值高于0，磷脂的相对表达水平也需要增加，反之如果log2值低于0，它也需要减少。在进一步在实施方案中，如果1(^2值高于0，1、0，2、0，3、0，4或0，5，脂肪酸的相对表达水平将需要增加，反之如果log2值低于-0，1、_0，2、-0，3、-0，4或-0，5，脂肪酸的相对表达水平也需要减少。在本发明的另一种实施方案中，磷脂成份的变化将通过测定样品中单一不饱和及多聚不饱和磷脂的比例评分，其中肿瘤样本相较正常样本的单一不饱和与多聚不饱和磷脂比例增加表明是更具侵略性的脂质合成表现型。
在进一步的实施方案中，确定患者体内肿瘤脂肪合成的体外方法包括了 ；确定患者体内肿瘤的脂质生成轮廓；其中具有一个或两个不饱和现象的物种增加(在酰基链中)及具有超过3个不饱和现象的PL物种减少表明是更具侵略性的脂质生成表现型。在更进一步的实施方案中，确定患者体内肿瘤脂肪合成的体外方法包括了 ；确定患者体内肿瘤的脂质生成轮廓；其中饱和磷脂物种的减少，具有一个或两个不饱和现象的物种增加(在酰基链中)及具有超过3个不饱和现象的PL物种减少表明是更具侵略性的脂质生成表现型。在进一步的实施方案中，根据本发明的多聚不饱和磷脂是拥有一个或两个单一不饱和脂肪酸链的卵磷脂(PC)，选自包含 PC28 :1、PC30 :1、PC30 :2、PC32 :1、PC32 :2、PC34 :1、PC34 :2、PC36 :1、PC36 :2、PC38 :1、PC38 :2、PC40 :1 及 PC40 :2 的组别；优选为 PC34 :1。进一步的实施方案中，多聚不饱和磷脂是多聚不饱和卵磷脂(PC)，选自包含PC32 :3、PC34 :2、PC34 :3、PC34 :4、PC36 :3、PC36 :4、PC36 :5、PC36 :6、PC38 :2、PC38 :3 、PC38 :4、PC38 :5、PC38 :6、PC38 :7、PC40 :2、PC40 :3、PC40 :4、PC40 :5、PC40 :6、PC40 :7、PC40 :8、PC42 :2、PC42 :3、PC42 :4、PC42 :5、PC42 :6、PC42 :7、PC42 :8、PC42 :9、PC42 :10、PC42 :11、PC44 :2、PC44 :3、PC44 :4、PC44 :5、PC44 :6、PC44 :7、PC44 :8、PC44 :9、PC44 :10、PC44 :11 及 PC44 12 的组别；优选为 PC36 :3、PC38 :3、PC36 :4、PC38 :4、PC40 :4、PC36 :5、PC38 :5、PC40 5 ;而最优选为 PC36 :4 及 / 或 PC38 :4。在首选的实施方案中，单一不饱和磷脂是单一不饱和卵磷脂(PC) PC34 :1，而多聚不饱和磷脂是多聚不饱和卵磷脂(PC) PC36 :4及/或PC38 :4。在进一步的实施方案中，单一不饱和磷脂是拥有一个或两个单一不饱和脂肪酸链的磷脂酰乙醇胺(PE)，选自包含PE32 :1及PE34 2的组别。在另进一步的实施方案中，多聚不饱和磷脂是多聚不饱和磷脂酰乙醇胺(PE)，选自包含PE36 :4、PE38 :4及PE40 4的组别。在进一步的实施方案中，单一不饱和磷脂是拥有一个或两个单一不饱和脂肪酸链的磷脂酰丝氨酸(PS)，选自包含PS36 :2、PS38 :2、PS40 :2及PS42 2的组别。在另进一步的实施方案中，多聚不饱和磷脂是多聚不饱和磷脂酰丝氨酸(PS)，选自包含 PS38 :4、PS40 :4、PS38 :5、PS40 :5 及 PS38 :6 的组别。在进一步的实施方案中，单一不饱和磷脂是拥有一个或两个单一不饱和脂肪酸链的磷酯醢肌醇(PI)，选自包含 PI34 :1、PI36 :1、PI38 :1、PI34 :2、PI36 :2 及 PI38 :2 的组别。在另进一步的实施方案中，多聚不饱和磷脂是多聚不饱和磷酯醢肌醇(PI)，选自包含PI36 4及PI38 4的组别。在进一步的实施方案中，除了确定磷脂的表达外，侵略性脂质生成表现型的其他生物标志物的相对表达水平也将被确定，举例但不限于FASN (脂肪酸合酶)、ACCA (乙酰辅酶A羧化酶)、胆碱激酶及ACLY (ATP柠檬酸裂解酶)的表达或磷酸化/活化。具有侵略性脂质生成表现型的肿瘤可能通过单一不饱和磷脂的相对表达水平增加及多聚不饱和磷脂的相对表达水平减少来鉴定，以及侵略性脂质生成表现型的一个或多个其他生物标志物的表达增加。另外，具有侵略性脂质生成表现型的肿瘤也可能通过肿瘤样本相较正常样本的单一不饱和与多聚不饱和磷脂比例增加来鉴定，以及侵略性脂质生成表现型的一个或多个其他生物标志物的表达增加。本发明还涉及到使用根据本发明的体外方法来确定患者体内肿瘤的脂肪生成。
最后，本发明提供了一个根据本发明执行体外方法的工具包，所述工具包包含了 ；ESI-MS/MS试剂或其他以质谱为基础的磷脂样品制备，尤其是抗氧化剂、溶剂和标准。在进一步的实施方案中，所述工具包包含了一个微流控芯片，以及一个可将细胞微粒子固定于涂上分子或药剂的涂层表面，而该药剂对所述细胞微粒子具亲和性或能够结合泡性颗粒。任何对适用于涂料的细胞微粒子具亲和性的分子皆能被使用。对细胞微粒子具亲和性的分子是指该分子能够通过共价键或非共价键结合出现在细胞微粒子内的分子。出现在细胞微粒子内的分子最好为膜结合型分子。优选为使用对细胞微粒子具有高亲和性的分子。优选地，亲和性以解离常数为表达。优选地，解离常数低于0. I纳米的分子会被使用，更优选为低于10纳米。更优选地，解离常数低于10-15米的分子会被使用。在另一个优选体中，解离常数介于0. 1-10纳米之间的亲和性会被使用。亲和性的确定是此项技术中已知的方法。优选地，所使用的方法如 Johnson et al. Journal of Molecular Biology 368(2)434-449中所描述的。任何通过使用对细胞微粒子具亲和性的涂层而适合用于固定化的表面可被使用。 首选的表面由包括玻璃、云母、塑料、金属或陶瓷的材料所制成。有各种方法可制成对(糖)，蛋白质，细胞膜或一般生物分子具亲和性的表面涂层。一般来说，这些方法使用了通过共价键或非共价键结合特定生物分子的活性基团。例如，涂上氨基硅烷的载片可用于蛋白质的非共价吸附。涂上环氧基硅烷的载片在PH值为5-9时能与赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸和羟基发生反应。涂上醛的载片在PH值为7-10时能驱动Schiff碱反应，从而与赖氨酸及精氨酸发生反应。专业人员将知道如何选择正确的涂层来结合所选的表面材料，并测试对细胞微粒子的亲和性。所产生的涂层表面将通过往包含所述的流体加上层流，然后再放入细胞微粒子里。所述流体可以是任何能与细胞微粒子兼容的流体。兼容的意思是指细胞微粒子的完整性丝毫无损，也就是说本发明方法中所使用的磷脂至少存在于细胞微粒子内。优选地，所述流体包包含了血浆、细胞培养液、磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸盐缓冲钾、或4- (2-羟乙基)-I-哌嗪乙磺酸(HEPES)。层流是流体的一种流动状态，其特点是高动量扩散、低动量对流，压力和速度与时间无关。所述层流的特点是其雷诺数低于2000和高于O。介于0至1000雷诺数的层流为优选，更优选则介于0至500，而最优选则介于0至100。专业人员将知道如何实现层流。任何能够将层流里的流体放入所述涂层表面的方法皆能被采用。优选的层流是朝一个方向的呈线性层流。优选的层流能针对流体设备的功能优化接触面积、接触时间和流动速度。更优选的层流是通过一个包含功能化壁的通道的层流.优选是使用一种方法来指定对细胞微粒子具体的亲和性。特定亲和性的优点是能减少结合不需要的分子或微粒。首选的方法是将亲和性链接共价或非共价连接至表面。亲和性链接是有能力共价或非共价结合到配偶体的分子，从而产生所述亲和性链接和所述配偶体的复合物。所述配偶体可以是有能力结合至细胞微粒子的分子或存在于细胞微粒子且能直接与所述亲和性链接产生相互作用的分子。有关亲和性链接及其配偶体的例子是链霉亲和素或抗生物素蛋白和生物素；抗体和抗原；配体和受体、凝集素和糖类物质、蛋白A和/或蛋白G-免疫球蛋白恒定区，以及标记肽序列和标记抗体。亲和性链接和配偶体这两个术语是指它们的功能。因此，根据上面提到的亲和性链接及配偶体组合的不同，所使用的术语也可各别交换。举例来说，如果生物素是结合至表面的话，它便是亲和性链接；但如果是结合至细胞微粒子的话，它便是配偶体。任何将亲和性链接结合至表面的方法都可被采用。将亲和性链接结合至涂层表面的方法将视表面材料和亲和性链接的性质而有所不同。专业人员将有能力选择适合表面材料类型和所选亲和性链接的正确方法。将亲和性链接结合至表面的方法已为专业人员熟知。将抗体结合至金属或硅表面的方法已为现有技术所熟知。2005年4月出版的生物电化学第66卷、第1-2期、第111-115页描述了首选的方法。将抗体结合至玻璃表面的方法也同样为现有技术熟知，与J Colloid Interface Sci. 2002AugI ；252(1) :50-6中有所描述。在具体的实施方案中，亲和性链接均选自包含抗体物种、蛋白质、核酸适配体的组别，选择性限制细胞微粒子通过的表面，以及选择性粘附至细胞微粒子的表面；其中蛋白质特别选自包含外源凝集素或其他糖结合化合物的组别；而其中外源凝集素特别选自GNA、NPA、刀蛋白A或监操抗病毒蛋白的组别。在具体的实施方案中，所述层流乃采用微流控技术达成。微流控技术这术语是指操纵流体流动，以让其特征尺度达到测微计I毫米范围的设备、系统和方法(更完整的概述 可参阅Manz,A. and Becker. H. (Eds. ) ,Microsystem Technology in Chemistry and LifeSciences (化学与生命科学的微系统技术)，Springer-Verlag Berlin Heidelberg NewYork, ISBN 3-540-65555-7)。其优势是微流体系统具备比传统宏观系统更迅速执行操作的能力，而且化学品和液体资源的消耗少得多。在本发明的具体实施方案中，所述层流通过微流控芯片形成。优选地，所述微流控芯片包含至少一个具有入口和出口的微流体通道，其中所述至少一个的微流体通道的微流控芯片表面具有至少一个间隙，以允许所述至少一个通道和表面的接触。所述微流控芯片的优点是它能够允许所述微流体通道内的流体与表面直接接触。优选地，所述入口和/或出口将置于所述微流控芯片的表面，该表面不同于包含所述微流体通道间隙的表面。其优势是这将允许所述微流体芯片及所述表面之间的夹合，同时能保持入口和/或出口的接触。在优选实施方案中，所述微流体芯片将会有一个小孔，以便能用螺钉或其他方式将表面附着于微流体芯片。其优势是表面可以连接到微流控芯片中，以达到彼此的连接性，从而防止液体从微流体通道中泄漏出来。使用微流体通道的优点是通道的几何形状能令层流成为可控诱因。优选地，所述通道具有不到I毫米的高度。其优势是所述流体及所述涂层表面的体积比例得到优化。在另一优选的实施方案中，涂区上的通道高度小于微流体装置其他部位的通道高度。其优势是所述流体及所述涂区的体积比例得到优化，同时也能维持流动性。更优选地，所述的通道高度低于0. 5毫米。其优势是这个高度对拥有血浆粘度的流体是最佳的。优选地，所述通道具有不到I毫米的宽度。其优势是这能让接触所述流体的所述涂层表面拥有最小的接触面积。优选地，所述的最小接触面积小于所述涂层表面面积。优选地，所述的最小接触面积介于100和10000平方微米间。在优选的实施方案中,所述的最小接触面积低于I平方毫米。其优点是这限制了表面面积的检查时间及增加每表面面积所收集囊泡的浓度。更优选地，所述的最小接触面积介于I平方微米和0. I平方毫米间。正如熟练技工所熟知的，上述通道可能会进一步包含一个过滤器，它能允许小于细胞微粒子的粒子通过。在这个方法中，所述过滤器的表面将会收集细胞微粒子，随后再改变流动方向，以重新悬浮说所述细胞微粒子。此方法进一步包括了在所述流体包含所述细胞微粒子接触所述涂层表面前，将所述细胞微粒子重新悬浮于流体中的步骤。因此，在更进一步的实施方案中，在此处使用的微流控芯片还包含了一个抽水系统。任何适合将流体泵送至微流控电路内部的系统都可以被采用。示例说明可参阅2002年八月出版的生物医学工程的年度审查(Annual Review of Biomedical Engineering)第 4 卷第 261-286 页，微流控技术在生物学中的物理与应用(PHYSICS AND APPLICATIONS OF MICROFLUIDICS INBIOLOGY), David J. Beebe, Glennys A. Mensing, Glenn M. Walker0当在本发明的方法中使用微流体芯片时，细胞微粒子可能会通过进行成像技术来检测。其优点是它能测量一个或多个参数，其中包括但不限于粒子的几何尺寸、形状、粗糙度、光散射、细胞微粒子尺寸，或是确定分子是否存在于表面或细胞微粒子内。该方法可以使用任何一种成像方法。首选的成像方法包括了突光显微镜，包括内反射突光显微镜，电子显微镜(EM),共聚焦显微镜,光散射或表面电衆显微镜,拉曼光谱仪，椭偏仪/反射技术，红外光谱分析或原子力显微镜(AFM)或上述提及的各种组合。以下实验细节的引用将能让读者更好地理解本发明，但本领域技术人员应明白到这些都只是说明性的示例，其后的申索将会作出更充分的描述。另外，在整个药的应用过程中，我们引用了各类出版物。通过融合参考文献并应用在实践中的这些出版物的公开出版， 更充分地描述了与此药发明相关的前沿技术。示例下面的例子说明该发明。熟练该行技术的人可以按照这些例子进行其他实施例。例I :前列腺癌细胞内的脂肪酸从头合成与单一不饱和脂肪酸水平的提高及多聚不饱和脂肪酸水平的减少有关。材料与方法细胞培养和处理LNCaP和C0S-7细胞取自美国菌种保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州)。细胞被放入RPMI 1640培养液中，然后放入空气氛围为5% C02/95%，温度达37° C的加湿孵化器中，并辅以10% FCS(加利福尼亚州，卡尔斯巴德，Invitrogen公司)。通过检查形态学和染色体组型来验证细胞株。由粘细菌纤维堆囊菌纯化而来的soraphen A(soraphen)由Drs. KlausGerth 及 Rolf Jansen (Helmholtz-Zentrum fiir Infektionsforschung, Braunschweig,Germany) (Bedorf et al. , 1993 ；Gerth et al. , 1994)友善提供。2-14C-醋酸盐掺入法检测和薄层色谱法分析用soraphen或赋形剂(乙醇)处理LNCaP细胞为时24小时。在最后的4个小时，将标上2-14C的醋酸(57mCi/mmol ；2 u Ci/dish ;英国艾尔斯伯里Amersham国际公司)添加到培养液中。脂质将根据如前所述的经修改布莱代尔(Bligh-Dyer)法进行提取(De Schrijver et al.,2003)。如之前所述(De Schrijver et al. , 2003),为了分析2-14C-醋酸在不同脂质类的吸收程度，研究人员将会进行薄层色谱分析，并将脂质暴露于PhosphorImager屏幕以进行定量分析(加利福尼亚州桑尼维尔，分子动力学)。临床组织样本新鲜冷冻的前列腺癌组织和配对的正常样本取自于曾接受激进耻骨后前列腺切除术的局部前列腺癌患者。在用于脂质和免疫印迹分析的组织附近进行组织学分析，以鉴定出正常组织和肿瘤组织。
细胞总磷脂、甘油三酯和胆固醇的定量分析使用先前所描述但稍作修改的方法(Van Veldhoven and Bell, 1988 ；VanVeldhoven et al. , 1998 ；Van Veldhoven et al. , 1997)在布莱代尔(Bligh-Dyer)脂质提取物上进行总磷脂、甘油三酯和胆固醇的定量分析。采用ESI-MS/MS进行完整的磷脂物种分析为了准备用于ESI-MS/MS分析的脂质提取物，组织或细胞被放入I. 6毫升的0. INHCl CH30H I l(v/v)中进行均质化。添加三氯甲烷(0. 8毫升)和200微克/毫升的抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲基苯酚(Sigma) (Milne et al.，2006)。在添加了脂质标准后，经200g离心5分钟采集有机质组分。样品被蒸发及重组成CH3OH =CHCl3 =NH4OHOO : 10 :1. 25，v/v/v),在配有磁带纳米流/离子源(Advion Biosciences)的混合四极杆线性离子讲质谱仪(4000QTRAP system ;产自加利福尼亚福斯特城Applied Biosystems)上采用电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)分析脂质。该系统以MRM模式为个别物种进行定量分析。数据被表示 为相比对照样本的差异倍数(未经处理的细胞或相匹配的正常组织)，并使用热图生成软件(美国斯坦福大学，Clifton Watt)表现为热图。结果为了研究细胞脂质成分中与肿瘤相关的脂肪酸从头合成所带来的影响，我们用已知的脂肪酸合成酶抑制剂soraphen治疗前列腺癌细胞LNCaP(Beckers et al. ,2007)。脂肪酸从头合成的抑制，也因此脂质新生因2-14C醋酸的吸收(

图1A)得以被证实。过后，细胞总脂质提取物将被放入电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)，以分析所有主要的完整磷脂物种。如图Ib所示，个别的磷脂酰胆碱(PC)物种皆产生了巨大的变化。Soraphen治疗大幅将PC物种的不饱和度减少高达4倍。由于拥有两个不饱和现象的PC物种可以代表拥有两个单一不饱和链的分子，甚至是一个饱和及一个双不饱和链的分子，soraphen治疗对这些物种有不明确或轻微的净效应。总体而言，视物种的不同，拥有更高不饱和度(> 三)的PC物种水平上升到8倍。当脂肪生成受到另一种脂质生成前列腺癌细胞株22Rvl细胞的抑制时，我们还能看到多聚不饱和脂肪的转变发生。为了评估癌症细胞的脂质合成表现型是否与体内磷脂饱和度的增加有关，前列腺肿瘤标本和匹配的正常对照组织将通过免疫印迹分析确定是否有过度表达点脂肪酸合酶(FASN)，然后记录磷脂轮廓。五个匹配样本的三个(肿瘤与对照)显示了肿瘤组织中有大量的FASN过度表达(图2A)。相较于非脂质合成肿瘤，ESI-MS/MS所分析的磷脂成分显示了脂肪合成肿瘤中有显着不同PC轮廓。相较于匹配的正常组织，FASN表达水平较低的肿瘤(患者4和5)，其多聚不饱和物种有整体的增幅，单一不饱和物种也有所减少。然而，FASN表达水平较高的肿瘤(患者4和5)则刚好相反相较于匹配的正常组织(图2B)，肿瘤组织中的单一不饱和酰基链持续增加，而多聚不饱和物种则相对减少。这些数据资料为我们对脂肪生成抑制剂soraphen的研究结果提供了支持，并证明了与肿瘤相关的脂肪生成增加了人类肿瘤内的饱和磷脂。结论总括而言，这些数据表明了肿瘤细胞中的脂肪酸从头合成提供了饱和及单一不饱和酰基链的细胞，替代了细胞膜组分的细胞并同时增加了磷脂的相对饱和度，特别是卵磷脂(PC)。
Ml:调制前列腺癌细胞中的脂肪酸从头合成影响了更具侵略性的脂质合成表现型的多个参数材料与方法细胞培养和处理见示例I采用ESI-MS/MS进行完整的磷脂物种分析见示例I。如前面所述(Brusselmans et al. , 2005),对于棕榈酸救援实验,棕榈酸(Sigma公司，圣路易斯,密苏里州)被合成到无脂肪酸牛血清白蛋白中(BSA) (Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。
脂质过氧化产物的检测将等量的细胞刮进冰镇的PBS中，在冰上放置15分钟后进行超声波处理(IObursts)。经3，OOOg离心10分钟后,使用脂质过氧化检测试剂盒(牛津生物医学研究，牛津大学，MI)对培养上清液进行分析，它会对产自脂肪酸过氧化氢分解物的丙二醛量和4-羟基烯醛进行量化。CD36-结合的检测LNCaP细胞在有或没有soraphen和/或棕榈酸的情况下培养72小时。将细胞置于H2O2 (300 PM)为时30分钟。为细胞进行胰蛋白酶消化，并标上CellTracker DyeOrange CMRA (C34551)。已标记的LNCaP细胞(I. 5x10s)随后层叠在C0S-7细胞的单分子层上，该细胞之前已于盖玻片进行培养，并转染了 CD36编码构成物(pCD36)或相应的空载体(pEF-BOS)(皆由澳大利亚纽卡斯尔大学的R. Thorne友善提供)。细胞被放入I毫升的RPMI培养基，以37° C温度共培养I小时。经过深入洗涤后，该培养物被固定和成像。使用Adobe Photoshop软件测量CellTracker Dye的荧光信号(加利福尼亚州圣何塞)。位反率和阿霉素累积的测定用soraphen或赋形剂处理细胞为时72小时，以测量阿霉素的位反率。在处理过程的最后24小时，添加10 ii M到NBD-磷脂酰乙醇胺(NBD-PE ；Invitrogen公司)。在通过胰蛋白酶消化采收细胞的I小时前，以IOOiiM的浓度添加维拉帕米(Verapamil)。当NBD的荧光因为NBD-PE猝灭而减少时，测量阿霉素在细胞膜上的位反率(Regev et al. ,2005)(请参阅附加方法以了解相关详细信息)。要直观显示细胞内的阿霉素积累，以IOii M的最终浓度加入阿霉素。在30分钟后，使用荧光显微镜(515纳米长通发射滤光片)及LIDA软件(莱卡微系统公司)分析细胞。细胞置于IOiiM的阿霉素为时30分钟，在PBS中洗涤，再溶解于含0. 3M盐酸的50%乙醇(V :v)，并以700g离心5分钟，以便可用荧光分光光度法测量阿霉素的积累。如所指出的，该介质应添加棕榈酸。细胞死亡的检测在接触到soraphen和/或其他化合物的指定时间后,通过胰蛋白酶消化及离心方式收集粘附和悬浮细胞，并将两个细胞群体相结合。如前所述，采用台盼蓝染色排除法计算存活细胞数和死亡细胞数(德斯赫雷弗等人，2003年)。统计分析使用图基事后检验以单因子方差分析结果。〈0.05的P值被认为具有统计学意义。如图例所示，所呈现的所有数据代表平均值土SE。结果调制前列腺癌细胞中的脂肪酸从头合成的新生影响细胞膜产生脂质过氧化作用的敏感性饱和与多聚不饱和酰基链的结构和理化性质有显着的差异。其中一个关键区别是对过氧化的敏感性。在这个过程中，自由基从细胞膜脂质中提取电子，从而导致氧化脂质物种的形成。这些脂质物种具有重要的生物学功能，并有可能最终分解成更小的活性产物，如丙二醒量和4-轻基烯醒；当以高水平表达时可能会导致细胞损伤(Deininger andHermetter, 2008 ；Rabinovich and Ripatti, 1991 ;Schneider et al.,2008)。由于甲基(CH2)组内双键之间的氢原子特别有活性，因此多聚不饱和酰基链也更容易受到过氧化。根据我们的研究结果，调制肿瘤细胞中的脂肪酸从头合成会影响细胞膜磷脂的饱和及多聚不饱和酰基链之间的平衡，据此我们也评估这代谢途径的调制是否会影响肿瘤细胞对自由基诱导性脂质过氧化的易感性。用soraphen治疗LNCaP细胞为时3天，然后暴露于H2O2中。 脂质过氧化的产品用比色法进行测量。Soraphen治疗显着增加脂质过氧化产物的水平(图
3)，这与从Soraphen治疗中看到的多聚不饱和磷脂转换相一致。外源H2O2的治疗会产生较高水平的自由基，从而诱导进一步增加的过氧化产物，这表明了 soraphen促成了增敏作用。有趣的是，通过添加外源性棕榈酸介质补充饱和酰基链会大幅度扭转这些变化，证明了增强的脂肪生成能通过限制磷脂的饱和程度，进而使癌细胞不易受到脂质过氧化。脂肪酸合成的生成影响癌细胞的CD36-介导细胞识别我们已知道细胞膜内的氧化磷脂会发生构象变化，这会令氧化酰基链从疏水膜内部突出来，再进入极性水环境中，以作为内源性模式识别配体的功能(Hazen，2008)。细胞清道夫受体CD36可能会识别氧化磷脂的细胞表面。这种受体表达于先天免疫细胞中，这些细胞涉及宿主组织的监视，并清除受损、衰老或凋亡的细胞。由于我们已确定了癌细胞内脂肪酸从头合成的抑制能增加磷脂多聚不饱和的水平及对过氧化的易感性，我们也研究脂肪合成的调制是否会影响CD36-阳性细胞对癌细胞的识别。LNCaP细胞在有或没有soraphen的情况下进行培养，并叠加到已转染了⑶36表达构成物(p⑶36)或空载体(pEF-BOS)的COS细胞(Thorne et al. ,1997)。经过深入洗漆,计算结合的LNCaP细胞数。如图4A所示,在进行H2O2短暂接触后的soraphen治疗大幅增加⑶36-结合LNCaP细胞的数量。加入外源性棕榈酸能抵消这些作用。这些研究结果表明了与肿瘤相关的脂质生成通过提高细胞膜磷脂的饱和程度，特别是PC物种，从而限制了氧化多聚不饱和物种在细胞表面的暴露。这种反应可能会最大限度地减少CD36-阳性细胞对肿瘤细胞的识别，并有可能促进脂肪合成的癌细胞从免疫系统中逃出。脂肪酸从头合成确定癌细胞因氧化压力介导的细胞死亡的敏感性有越来越多的证据显示氧化磷脂和它们降解产物在诱导细胞凋亡中发挥了关键作用(Dupertuis et al. , 2007 ；Fruhwirth and Hermetter, 2008 ；Tang et al. , 2002 ；ffestet al.，2004)。因此，我们研究脂肪酸从头合成的调制是否影响癌细胞的敏感性，以氧化压力介导的细胞死亡。如台盼蓝染色所示，原生的LNCaP细胞比较能抵抗H2O2诱导的细胞死亡，但soraphen预治疗显着增加了对H2O2反应的死亡(图4B)。这些作用被外源性棕榈酸抵消。有趣的是，当介质辅以饱和脂肪酸和多聚不饱和脂肪酸的混合物时，救援效果明显要少得多。总体而言，这些数据证明了增加的脂肪生成通过改变细胞膜的饱和程度，进而保护肿瘤细胞免受氧化压力介导的细胞死亡。肿瘤相关的脂肪酸合成会影响普通化疗药物的吸收和反应除了其对脂质过氧化的影响，细胞膜脂质构成的调制也对细胞膜组分的流动性有重要待影响(Rabinovich and Ripatti, 1991 ；Stillwell and Wassail, 2003)。细胞膜组分的横向流动，也称为位反，会在低率时发生，除非它由特定的转运体介导。然而，对于某些外源性化合物，包括诸如阿霉素的常用化疗药物，被动位反是进入细胞的主要机制(Regevet al. ,2005)。目前已知用外源性不饱和脂肪酸治疗细胞能促进阿霉素的吸收(Davies etal.，1999)，我们同时也确定脂肪酸合成的抑制是否能促进细胞膜位反及阿霉素的吸收。为了测量阿霉素的位反，用7-硝基苯-2-oxa-l，3-唑磷脂(NBD-PE)治疗soraphen或暴露于赋形剂的LNCaP细胞，荧光标记的磷脂结合到细胞膜的两个小叶。在加入阿霉素后，NBD荧光会快速地猝灭，这是因为阿霉素与磷脂在外小叶结合而成的。阿霉素传送至内小叶，令我们进一步观察到NBD的粹灭(Regev et al.,2005)。NBD粹灭的监测表明了 soraphen的诱导令阿霉素位反率增加了 6倍(图5A)。这些作用并不是因P-糖蛋白(负责将诸如阿霉 素的疏水性分子泵出细胞)的间接影响而引起的，这是因为类似的结果也同样在使用P-糖蛋白抑制剂维拉帕米时出现。在用荧光显微镜和荧光分析评估细胞提取物后，证实位反率的增加也伴随了阿霉素细胞内积累的显着增加。外源性棕榈酸的添加抵消了 soraphen的效果(图5B)。Soraphen治疗显着令LNCaP细胞对阿霉素的细胞毒作用变得敏感，这与经Soraphen治疗的细胞阿霉素积累增加及细胞死亡的易感性增加相一致。在标准培养条件下生长的LNCaP细胞比较能抵抗阿霉素诱导的细胞死亡(4 M 8%的细胞死亡)(图5C)，但单独soraphen预治疗能诱导高达20%的细胞死亡，将细胞死亡率增加至约50%。根据联合指数(Cl)的方法,这个强效作用是相互反应的(Chou and Talalay, 1984)。对于所测试的阿霉素/soraphen比率(80 : 1，40 : 1，20 :1和10 :1)，Cl值全都低于I。图C实验中所使用的组合(4 ii M阿霉素，IOOnM soraphen)有强烈的协同作用(0. KCK0. 3)(数据未显示)。外源性棕榈酸的添加抵消了这些作用，并很大程度上将细胞从死亡中挽救出来(图5C)。用前列腺癌细胞株，22Rvl也同样取得类似的结果(数据未显示)。总的来说，这些数据表明了肿瘤细胞中的从头脂肪酸合成影响了化疗药物的吸收，并调节癌细胞对这些药物的反应。讨论总之，实例I和2的研究结果证明了癌细胞在其脂质供应方面变得更加自主，并通过活化脂肪酸从头生成将脂质成分转移到增加的饱和度。再者说，肿瘤相关的脂肪生成赋予了癌细胞显着的优势，这是因为帮助它们从致癌性和治疗性调解攻击中生存下来。因此，磷脂轮廓分析使我们能够根据磷脂饱和度的测定来找出脂质合成、更具侵略性和更强的肿瘤。Ml :在扩展组别的患者中使用PC、PE、PS和PI型进行磷脂轮廓分析采集组织前列腺癌组织和配对的正常样本取自于曾接受激进耻骨后前列腺切除术的14名局部前列腺癌患者。使用6或8mm直径冲孔活检仪器取出前列腺组织标本。将样本速冻于液氮中，并将脂肪、蛋白质和RNA提取物保存在-80° C的空间里。在用于脂质和免疫印迹分析的组织附近(嵌入到Tissue-Tek 0CT)进行组织学分析，以鉴定出正常组织和肿瘤组织。将连续切片送去进行苏木精伊红染色处理。对癌症样本进行Gleason评分，并估计它们所含有的癌症百分比。DNA浓度的测定DNA浓度的测定是为了将添加到样本中标准和运行溶液量正常化，以用于血脂分析。样本被放入均质缓冲液中进行超声波处理及稀释(pH 7，4的5xl0-2MNa2HP04/NaH2P04缓冲液；2M NaCl及2x 10-3M EDTA)。鲱鱼的精子DNA (威斯康星州麦迪逊Promega公司；05ugDNA/125ul)被用来在均质缓冲液形成不同的稀释度，以创建出标准曲线。接下来，让样本以37° C进行培养一小时，以提高裂解。过后添加2 u g/ml的Hoechst 33258试剂(加利福尼亚拉霍亚的Calbiochem公司)。使用荧光计(德国奥芬堡BMG Labtech的Fluostar SLT)测量样本DNA和鲱鱼精子DNA的含量。激发355 nm ;排放460 nm。根据标准曲线的数据计算出每个样本的DNA含量。
脂质提取用Dounce均质器在800 U I PBS内为40毫克的组织进行均质化，以制造样本的脂质提取物。准备100 u L的等分试样进行DNA分析。剩余700 u I被转移到聚四氟乙烯衬垫的玻璃管中，然后加入900 ill IN HCl =CH3OH I :8 (v/v)、800 1；101(13及500 y g的抗氧化剂2，6-二叔-丁基-4-甲基苯酚(BHT)(密苏里州圣路易斯的Sigma公司)。根据原始样本的DNA 量加入适当的血脂标准(每毫克 DNA :150 nmol PC 26 0 ；50 nmol PC 28 0 ；150 nmolPC 40 0 ；75 nmol PE28 0 ；8,61 nmol PI25 :0 及 3 iimol PS 28 :0)。在摇床搅拌 5 分钟和及进行相位分离后(以4° C进行17300克的高速离心，为时5分钟)，使用巴斯德吸管玻璃采集较低的有机部分，然后使用Savant Speedvac spdlIIv(马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific)进行蒸发程序。将其余的脂质颗粒以-20° C的温度储存。质谱分析对于质谱分析(MS)，我们根据原组织样本的DNA量(I ii L运行溶液/I ii g DNA)再造脂质颗粒(CH3OH =CHCl3 =NH4OH ;90 :10 :1. 25，v/v/v)。在配有磁带纳米流/离子源(Advion Biosciences)的混合四极杆线性离子讲质谱仪(4000QTRAP system;产自加利福尼亚福斯特城Applied Biosystems)上采用电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)分析PL物种。测量前，在运行溶液中替样本进行稀释。以1/30的稀释度进行卵磷脂(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)及磷酯醢肌醇(PI)物种的测量。磷脂酰乙醇胺(PE)物种的分析则使用1/3的稀释度。以正离子和负离子扫描模式记录PL轮廓分析，母离子扫描(prec.)的碰撞能量为50eV，中性丢失扫描(nl.)的碰撞能量为35eV。中性丢失扫描为141，_40eV，母离子扫描为87及-55eV。241分别为PC、PE、PI及PS物种。系统以MRM模式为个别物种进行定量分析。通常情况下，每个频谱所用的信号平均为3分钟。进行碳同位素效应的数据修正，并表达为相同PL系列相对总可衡量PL物种的百分比。只有相同PL系列相对总可衡量PL物种的百分比高于0. 1%的PL物种会被显示在图形中。聚类分析使用Cluster 3. 0软件的重心链接聚类算法进行聚类分析[Eisen, M. B.,P. T. Spellman, P. 0. Brown, and D.Botstein, Cluster analysis and display ofgenome-wide expression patterns. Proc Natl Acad SciU S A,1998. 95 (25)p. 14863-8. ] o 使用 Java TreeView I. I. 5.软件令聚类结果变为可视化[Saldanha, A. J.，Java Treeview—extensible visualization of microarray data. Bioinformatics,2004. 20(17) :p. 3246-8. ] 结果肿瘤标本的特征为了研究肿瘤组织相对正常组织以及个别患者肿瘤组织中的PL轮廓变化，大约40mg的前列腺肿瘤组织和邻近正常前列腺组织将取自于曾接受激进耻骨后前列腺切除术的14名局部前列腺癌患者。通过组织病理学检查验证所有的肿瘤组织，以包含至少80%的肿瘤组织。磷脂轮廓分析程序的优化
为了查看完整的PL物种，我们使用由Prof. R. Derua及Prof. E. Waelkens合作开发的一个以质谱为基础的方法(K.U. Ieuven的分子细胞生物学部)。这个程序乃根据 Briigger 等人[Brugger, B. , G. Erben, R. Sandhoff, F. T. ffieland, and ff. D. Lehmann,Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole levelby nano-electrospray ionization tandem mass spectrometry. Proc Natl Acad SciUSA, 1997. 94(6) p. 2339-44.]及 Milne 等人[Milne，S.，P. Ivanova, J. Forrester,and H. Alex Brown, Lipidomics an analysis of cellular lipids by ESI-MS. Methods,2006. 39(2) :p. 92-103.]所描述的方案执行，并用于配有磁带纳米流/离子源(以进行自动样本进样)的ABI4000QTRAP质谱仪中。由于本方案原是为了针对培养细胞进行PL分析，我们调整成可用于分析临床标本。简言之,均质化程序将通过改变起始原料的数量和修改Dounce均质化的程序(行程数)进行优化。MS程序将通过改变脂质提取物的稀释进行优化。前列腺癌组织和组织正常匹配的磷脂轮廓分析为了在试探性方法中直接从总脂提取物检测个别类别的磷脂，串联质谱(MS/MS)分析将会进行不同的母离子和中性丢失扫描。这种方法可以将重点放在特定类别的脂质、减少光谱的复杂性，并消除了基线噪音。四个主要PL类别被分析PC、PE、PS及PI。在母离子扫描(m/z 184)中以正离子模式检测PC物种，对应于MS/MS模式在分裂后的磷酸头基峰值。在正离子模式下以碰撞诱导分解检测PE物种，产生一个对应于磷酸乙醇胺中性丢失的离子。以负离子模式测量PS和PI，而中性丢失和母离子扫描分别为87及241。在同位素修正后在多反应监测(MRM)模式为物种进行定量分析，专注于最丰富的PL物种。为了做出不饱和度水平的最佳鉴定，脂质物种数量不会以绝对值作为表示，而是所有可测量物种在一个磷脂类的百分比(如PC)。为了避免因电离效率差异而产生的错误，百分比的差异将会表示为癌组织相较匹配正常组织的数值比率。使用log2对数值计量来平衡两个方向的差异(增加和减少)。为了避免因背景噪声而产生的错误，同一 PL类中所有物种总强度少于I%的物种将不会被计算在内。取自14名前列腺癌患者的正常前列腺组织与前列腺肿瘤的PL物种相对变化会被测定。在14名患者中，有13名的PL轮廓有明显的差异。有趣的是，我们从不同患者身上观察到不同的变化(数据未显示)。我们在所有患者身上观察到某些变化(如PS40 8的增加)。大多数的其他变化只限于特定子集的患者(如PE38 :0的增加)。为了更好地显示出不同患者间的PL轮廓的差异和相似之处，我们会使用聚类分析。这会揭示出复发性的变化及将患者分为2个主要组别。图6代表了每个被测磷脂物种的平均增加/减少(log2)。聚类A (图6A)(患者3、4、5、6、7、9、10、11及13)的特点是完全饱和的PL物种有明显下降，拥有一个或两个无不饱和现象的物种(同时包括两个酰基链)有所增加，而拥有超过3个无不饱和现象大PL物种则减少。这种模式在PC部分中表现得最直接，将被称为“脂质合成轮廓”，这是因为它能以脂质合成的切换作为来解释(见下页)。聚类B (图6B)(患者1、2、8及14)含有没有脂质合成轮廓的肿瘤。患者12的肿瘤和正常组织之间的PL轮廓只有变化不大的改变，因此不能归类为 聚类A或B。参考文献Beckers, A. , Organe, S.，Timmermans，L , Scheys, K. , Peeters, A. , Brusselmans,K.，Verhoeven, G.，and Swinnen，J. 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权利要求
1.一种确定受试者中的肿瘤的脂肪生成的体外方法，所述方法包括确定肿瘤样本与正常样本中至少I种单不饱和磷脂和至少I种多不饱和磷脂的相对表达水平；其中所述单不饱和磷脂的相对表达水平的增加及所述多不饱和磷脂的相对表达水平的减少指示更具侵略性的脂肪生成表型。
2.根据权利要求I的体外方法,进一步包括确定肿瘤样本与正常样本中至少I种饱和磷脂的相对表达水平；其中所述饱和磷脂的相对表达水平的减少、所述单不饱和磷脂的相对表达水平的增加及所述多不饱和磷脂的相对表达水平的减少表明是更具侵略性的脂肪生成表型。
3.一种确定受试者中的肿瘤的脂肪生成的体外方法，所述方法包括确定肿瘤样本与正常样本中至少I种单不饱和磷脂和至少I种多不饱和磷脂的表达水平；其中相对于正常样本，肿瘤样本的单不饱和与多不饱和磷脂之比的增加表明是更具侵略性的脂肪生成表型。
4.一种确定受试者中的肿瘤的脂肪生成的体外方法，所述方法包括确定患者中的肿瘤的脂质生成谱；其中具有一个或两个不饱和现象的种类的增加(在两个酰基链中合计)及具有超过3个不饱和现象的PL种类的减少表明是更具侵略性的脂质生成表型。
5.根据权利要求4的体外方法，进一步包括确定患者中的肿瘤的脂质生成谱；其中饱和种类的减少，具有一个或两个不饱和现象的种类的增加(在两个酰基链中合计)及具有超过3个不饱和现象的PL种类的减少表明是更具侵略性的脂质生成表型。
6.根据权利要求I至5任一项的方法，其中磷脂选自包括甘油磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷酸肌醇的组。
7.根据权利要求2、5及6任一项的方法，其中饱和磷脂是饱和卵磷脂种类，选自包含PC30 :0、PC32 :0、PC34 :0、PC36 :0、及PC38 0的组；和/或饱和磷脂酰乙醇胺，选自包含PE36 0及PE38 0的组；和/或饱和磷脂酰丝氨酸，选自包含PS 36 :0、PS 38 :0、PS 40 0及PS 42 0的组；和/或饱和磷脂酰肌醇，选自包含PI34 :0、PI36 :0及PI38 0的组。
8.根据权利要求I至7任一项的方法，其中单不饱和磷脂是具有一个或两个单不饱和脂肪酰基链的卵磷脂(PC)，选自包含 PC28 :1、PC30 :1、PC30 :2、PC32 :1、PC32 :2、PC34 :1、PC34 :2、PC36 :1、PC36 :2、PC38 :1、PC38 :2、PC40 :1 及 PC40 :2 的组。
9.根据权利要求I至8任一项的方法，其中单不饱和磷脂是单不饱和卵磷脂(PC)PC34 :1。
10.根据权利要求I至7任一项的方法，其中多不饱和磷脂是多不饱和卵磷脂(PC)，选自包含 PC32 :3、PC34 :2、PC34 :3、PC34 :4、PC36 :2、PC36 :3、PC36 :4、PC36 :5、PC36 :6、PC38 3、PC38 :4、PC38 :5、PC38 :6、PC38 :7、PC40 :3、PC40 :4、PC40 :5、PC40 :6、PC40 :7、PC40 :8、PC42 3, PC42 4, PC42 :5、PC42 :6、PC42 :7、PC42 :8、PC42 :9、PC42 :10、PC42 :11、PC44 :3、PC44 :4、PC44 :5、PC44 :6、PC44 :7、PC44 :8、PC44 :9、PC44 :10、PC44 :11 及 PC44 :12 的组。
11.根据权利要求I至7任一项的方法，其中多不饱和磷脂是多不饱和卵磷脂(PC)，选自包含 PC36 :3、PC38 :3、PC36 :4、PC38 :4、PC40 :4、PC36 :5、PC38 :5、PC40 :5 的组。
12.根据权利要求I至7任一项的方法，其中多不饱和磷脂是多不饱和卵磷脂(PC)PC36 :4 或PC38 :4。
13.根据权利要求I至7任一项的方法，其中单不饱和磷脂是具有一个或两个单不饱和脂肪酰基链的磷脂酰乙醇胺(PE)，选自包含PE32 :1及PE34 2的组。
14.根据权利要求I至7任一项的方法，其中多不饱和磷脂是多不饱和磷脂酰乙醇胺(PE)，选自包含 PE36 :4、PE38 :4 及 PE40 4 的组。
15.根据权利要求I至7任一项的方法，其中单不饱和磷脂是具有一个或两个单不饱和脂肪酰基链的磷脂酰丝氨酸(PS)，选自包含PS36 :2、PS38 :2、PS40 :2及PS42 2的组。
16.根据权利要求I至7任一项的方法，其中多不饱和磷脂是多不饱和磷脂酰丝氨酸(PS)，选自包含 PS38 :4、PS40 :4、PS38 :5、PS40 :5 及 PS38 :6 的组。
17.根据权利要求I至7任一项的方法，其中单不饱和磷脂是具有一个或两个单不饱和脂肪酰基链的磷脂酰肌醇(PI)，选自包含PI34 :1、PI36 :1、PI38 :1、PI34 :2、PI36 :2及PI38 2 的组。
18.根据权利要求I至7任一项的方法，其中多不饱和磷脂是多不饱和磷脂酰肌醇(PI)，选自包含PE36 :4及PE38 4的组。
19.根据权利要求I至7任一项的方法，其中单不饱和磷脂是单不饱和卵磷脂(PC)PC34 :1，并且其中多不饱和磷脂是多不饱和卵磷脂(PC) PC36 :4和/或PC38 :4。
20.根据权利要求I至19任一项的方法，其中肿瘤选自包含前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝癌、食道癌、膀胱癌、口腔癌、甲状腺癌、胰腺癌、视网膜癌和皮肤癌的组，优选为前列腺癌。
21.根据权利要求I至20任一项的方法，进一步包含测量肿瘤样本与正常样本中侵略性脂质生成表型的一个或多个其他生物标志物的相对表达或磷酸化/活化；其中所述一个或多个其他生物标志物的相对表达水平的增加、所述单不饱和磷脂的相对表达水平的增加及所述多不饱和磷脂的相对表达水平的减少表明是更具侵略性的脂肪生成表型。
22.根据权利要求21的方法，其中侵略性脂质生成表型的一个或多个其他生物标志物选自FASN、ACCA、胆碱激酶及ACLY。
23.根据权利要求I至22任一项的方法，其中磷脂的表达水平通过以ESI-MS/MS或其他以质谱为基础的方法、包括MALDI-TOF和基于MS的磷脂成像分析磷脂而被测定。
24.根据权利要求I至23任一项的体外预后或预测性方法用于测定受试者中的肿瘤脂肪生成的用途。
25.用于执行权利要求I至23中任一项的体外方法的工具包，其包含用于ESI-MS/MS或其他以质谱为基础的磷脂样品制备的试剂，其中所述磷脂分离自待分析的样品。
26.权利要求25的工具包，其包含抗氧化剂、溶剂和标准物。
27.权利要求25的工具包，其包含微流体芯片，以及用于将微泡固定于涂覆了分子或药剂的表面的涂覆的表面，所述分子或药剂对所述微泡具有亲和性或能够结合微泡颗粒。
28.根据权利要求25的工具包，其中分子或药剂对所述微泡具有亲和性或能够结合微泡颗粒；其是下列一种或多种抗体种类、蛋白质、适配体、选择性限制微泡通过的表面，以及对微泡具有选择性粘附的表面。
29.根据权利要求28的工具包，其中蛋白质选自包含外源凝集素或其他糖结合化合物的组。
30.根据权利要求29的工具包，其中外源凝集素选自包含GNA、NPA、刀豆蛋白A或蓝藻抗病毒蛋白的组。
31.根据权利要求27至30任一项的工具包，其中微流体芯片包含如权利26-29任一项所定义的涂覆的表面。
全文摘要
一般情况下，本发明通过使用磷脂轮廓分析提供预后与预测性的方法和工具包，以确定受试者体内肿瘤的脂肪生成，其中单一不饱和磷脂物种的相对增加及多聚不饱和磷脂物种的相对减少是指示更强和更具侵略性的脂质合成癌症表现型。
文档编号G01N33/574GK102753974SQ201180009013
公开日2012年10月24日 申请日期2011年2月10日 优先权日2010年2月11日
发明者J·斯温尼恩 申请人:勒芬天主教大学